Name: anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells
Uploaded: 2014-06-23T18:15:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells at JoVE.com

हम उसे विशेषज्ञ तकनीकी समीक्षा के लिए IIF प्रयोग और कैरोल Buchner प्रदर्शन के लिए Cassandra ब्रायंट धन्यवाद.

1. तैयारी और सब्सट्रेट चयन नमूना <ol><li> पैकेजिंग से अभिकर्मकों निकालें और प्रत्येक आइटम के कमरे के तापमान पर आने के लिए अनुमति देते हैं. अभिकर्मकों तैयार करें और दिशा डालने के अनुसार रोगी सीरा पतला. नोट: नोवा लाइट स्लाइड barcoded कर रहे हैं और आसानी से प्रयोगशाला सूचना प्रणाली एलआईएस के साथ संयोजन के रूप में स्वचालित प्रणाली में एकीकृत किया जा सकता है. इस प्रक्रिया का मार्गदर्शन स्लाइड प्रसंस्करण दिखाता है; उच्च throughput प्रयोगशालाओं, हालांकि, स्वचालित स्लाइड प्रसंस्करण के उपकरण के लिए विकल्प चुन सकते हैं. </li></ol> नियंत्रण और नमूनों की 2. इसके अलावा <ol><li> सकारात्मक नियंत्रण और उचित स्लाइड वेल्स को नकारात्मक नियंत्रण की 1 बूंद की 1 बूंद बांटना. शेष कुओं को पतला रोगी सीरम की पिपेट 20-25 μl. एक समय में एक स्लाइड प्रक्रिया. </li><li> तल पर एक नम कागज तौलिया के साथ एक धुंधला कंटेनर में स्लाइड (ओं) रखें. कंटेनर कवर और 30 मिनट के लिए स्लाइड (ओं) सेते हैं. नोट: उमस भरी परिस्थितियों होगाबाहर सुखाने से सब्सट्रेट रोका जा सके. कुओं के सूखने artifactual धुंधला हो सकती थी. इस ऊष्मायन अवधि के दौरान, रोगी के सीरम में परमाणु विरोधी एंटीबॉडी अच्छी तरह से प्रत्येक पर तय कर रहे हैं कि कोशिकाओं के एंटीजन को बाध्य होगा. </li><li> ऊष्मायन अवधि के बाद, धोने बफर के एक सौम्य धारा का उपयोग सीरम बंद कुल्ला. सब्सट्रेट हानिकारक से बचने और वेल्स के बीच नमूने के पार से अधिक, कोण स्लाइड को रोकने के क्रम में थोड़ा कुओं पर सीधे धारा निर्देशन से बचने के लिए. अतिरिक्त धोने बफर बंद नल और लगभग 5 मिनट के लिए धोने बफर युक्त एक Coplin जार में स्लाइड जगह. </li></ol> फ्लोरिसेंट संयुग्म के 3. इसके अलावा <ol><li> एक के बाद एक, धोने बफर से स्लाइड्स निकालें और धीरे अतिरिक्त धोने बफर दूर करने के लिए नल. प्रत्येक कुएं पर (FITC विरोधी मानव आईजीजी लेबल) फ्लोरोसेंट रूप साधना की 1 बूंद लागू करें. Humidified कंटेनर में 30 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं, और धुंधला बदलने के लिए सुनिश्चित होकंटेनर कवर. नोट: एना परीक्षण के लिए, एक आईजीजी एफसी विशिष्ट रूप साधना के उपयोग की सिफारिश की है. संयुग्म प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, और कवर humidified वातावरण बनाए रखने के अलावा प्रकाश के संपर्क से स्लाइड्स की रक्षा करेगा. इस ऊष्मायन अवधि के दौरान, संयुग्म सेल एंटीजन को बाध्य कर दिया है कि रोगी के परमाणु विरोधी एंटीबॉडी के लिए बाध्य होगा. इस संयुग्म कुओं में प्रतिदीप्ति की उपस्थिति में परिणाम बंधन. </li><li> कुल्ला और ऊपर वर्णित के रूप में स्लाइड धो लो. </li><li> एक कागज तौलिया पर एक coverslip जगह और coverslip के नीचे किनारे करने के लिए एक सतत लाइन में बढ़ते मध्यम लागू होते हैं. </li><li> धोने बफर से प्रत्येक स्लाइड निकालें और अतिरिक्त धोने बफर दूर करने के लिए धीरे स्लाइड टैप करें. Coverslip के किनारे करने के लिए स्लाइड के निचले किनारे को स्पर्श करें. </li><li> धीरे coverslip पर बढ़ते मध्यम हवा बुलबुला गठन के बिना स्लाइड के शीर्ष किनारे करने के लिए बहती है कि इस तरह से coverslip पर स्लाइड कम है. नोट: सह, बढ़ते मध्यम के इष्टतम राशि का उपयोग भी शामिल है, verslipping सही करने के लिए अभ्यास लेता है कि एक तकनीक है. </li></ol> सकारात्मक और नकारात्मक परिणामों के 4. पहचान मैनुअल व्याख्या <ol><li> देखें एक अंधेरे कमरे में स्थित एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, साथ स्लाइड. सेल वितरण और प्रतिदीप्ति की एकरूपता का आकलन करने के लिए एक 20X या 25x उद्देश्य के साथ पूरे अच्छी तरह से स्कैनिंग प्रदर्शन </li><li> सकारात्मकता और पैटर्न के बारे में अंतिम व्याख्या करने के लिए एक 40x उद्देश्य के लिए स्विच. </li><li> सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण को देखो. 1 से 4 + से एक जेट ग्रेडिंग पैमाने का उपयोग करते हुए ग्रेड सकारात्मकता. नोट: नकारात्मक नियंत्रण पूरी तरह से अंधेरा नहीं दिख सकता है, लेकिन अक्सर कम स्तर अविशिष्ट प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करेगा. सकारात्मक नियंत्रण नाभिक में उज्ज्वल सेब हरी प्रतिदीप्ति (चित्रा 1) प्रदर्शित करेगा. </li></ol> स्वचालित व्याख्या नोट: additi मेंपुस्तिका व्याख्या, भार और नोवा देखें स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप या अन्य स्वचालित डिजिटल इमेजिंग साधन से स्कैन स्लाइड करने पर; कोई darkroom आवश्यक है. उपयुक्त स्लाइड प्रकार का चयन करके एक परियोजना बनाने के बाद, साधन अच्छी तरह से प्रत्येक में कोशिकाओं की उच्च संकल्प डिजिटल छवियों प्राप्त है और भंडार. इसके अतिरिक्त, नोवा देखें फ्लोरोसेंट रोशनी की तीव्रता को मापता है, और सकारात्मक या नकारात्मक रूप में परिणाम categorizes, और सकारात्मक नमूने के लिए पैटर्न मान्यता प्रदान करता है. छवियाँ नोवा देखें परिणाम की अंतिम व्याख्या, संशोधन और पुष्टि के लिए अनुमति देता है, एक उच्च संकल्प कंप्यूटर मॉनीटर पर ऑपरेटर द्वारा देखा जाता है. रिपोर्टों की पुष्टि परिणामों पर उत्पन्न किया जा सकता है. यह परिणाम की व्याख्या करने में सहायता करने का इरादा है के रूप में डिजिटल माइक्रोस्कोपी एक अनुभवी प्रयोगशाला तकनीशियन के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

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लेखकों गैब्रिएला Lakos, Cassandra ब्रायंट, कैरल Buchner, और अन्ना Eslami INOVA निदान के कर्मचारी हैं.

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the &#8220;gold standard&#8221; for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns. 
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells. 
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

अवधि antinuclear प्रतिरक्षी (एएनए) डीएनए, प्रोटीन और ribonucleoproteins 1, 2 सहित सेल नाभिक के घटक के साथ प्रतिक्रिया है कि autoantibodies की एक किस्म का वर्णन करता है. एचईपी-2 सेल, एंटीजन के सैकड़ों के साथ एक देशी प्रोटीन सरणी, एना 1 का पता लगाने के लिए एक आदर्श सब्सट्रेट प्रदान करता है. मानव सीरम में एना का पता लगाने के संयोजी ऊतक रोगों के लिए एक महत्वपूर्ण स्क्रीनिंग उपकरण है, और IIF एना 1 के परीक्षण के लिए संदर्भ विधि है. हाल ही में, एचईपी-2 कोशिकाओं पर IIF प्रतिजन विशेष immunoassays और मल्टीप्लेक्स के तरीकों के साथ कुछ प्रयोगशालाओं में जगह दी गई है. कारण झूठी नकारात्मक परिणामों पर चिंता और चिकित्सकों के लिए पारदर्शिता की कमी के कारण, संधिवातीयशास्त्र के अमेरिकी कॉलेज एचईपी-2 कोशिकाओं का उपयोग IIF एना 1 स्क्रीनिंग के लिए &quot;सोने के मानक &#39;होना चाहिए कि निष्कर्ष निकाला है कि एक टास्क फोर्स का गठन किया. कारण एना स्क्रीनिंग के व्यक्तिपरक स्वभाव के कारण, एचईपी-2 कोशिकाओं की गुणवत्ता में हैपरिणाम की सटीक और आत्मविश्वास से रिपोर्टिंग करने tegral. mitotic कोशिकाओं के एक उच्च संख्या की उपस्थिति, इष्टतम सेल आकारिकी, पर्याप्त confluency, और प्रासंगिक एंटीजन की अभिव्यक्ति विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं. IIF पैटर्न मान्यता रोगी निदान में सहायता करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में कार्य करता है. विभिन्न पैटर्न के महत्व को समझना चिकित्सकों और प्रयोगशाला कर्मियों निदान की पुष्टि करने के लिए उपयुक्त अनुवर्ती परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए सक्षम बनाता है. उदाहरण के लिए, सजातीय एना पैटर्न विरोधी dsDNA या chromatin एंटीबॉडी की उपस्थिति में हो सकता है, और प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष erythematosus (SLE) 3 के साथ जुड़ा हो सकता है. दूसरे पक्ष से, यह हाल ही में सामान्यतः दिनचर्या नमूने के ऊपर से 12% में देखा जाता है कि तथाकथित घने ठीक धब्बेदार पैटर्न (डीएफएस), ज्यादातर विरोधी DFS70 एंटीबॉडी के साथ संबद्ध किया गया है कि वर्णित किया गया है. इन autoantibodies, (अन्य रोग विशेष एना के बिना) अलगाव में पाया जब प्रणालीगत autoimmune आमवाती रोगों के साथ संबद्ध नहीं हैं &lt;&gt; 4-9 समर्थन. विरोधी DFS70 एंटीबॉडी के लिए इस प्रकार पुष्टि परीक्षण, अनावश्यक पलटा परीक्षण कम करने में मदद काफी लागत बचत की पेशकश, और रोगी चिंता कम कर सकते हैं. IIF autoantibodies पता लगाने के लिए पहली पंक्ति स्क्रीनिंग पद्धति है कि यह देखते हुए, यह उपयोगकर्ता अभिकर्मकों और ऊतक substrates के चयन के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं कि कैसे समझता है कि सर्वोपरि है. IIF तकनीक स्वाभाविक व्यक्तिपरक है, यह प्रयोग किया अभिकर्मकों उच्चतम गुणवत्ता परिणाम प्रदान जरूरी है. इस वीडियो प्रोटोकॉल के इस लक्ष्य IIF विधि, एना के साथ जुड़े आम पैटर्न प्रदर्शन करने की जरूरत है सही कदम के साथ उपयोगकर्ता को परिचित करने के लिए, और प्रयोगशाला कार्यप्रवाह को कारगर बनाने और परिणाम मानकीकृत कर सकते हैं जो नई प्रगति का परिचय है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)</td>
			<td style="width:189px;">INOVA Diagnostics</td>
			<td style="width:135px;">708102</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NOVA View Instrument</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>NV2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation License</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barcode Scanner</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells

एना परीक्षण पर संधिवातीयशास्त्र स्थिति बयान की अमेरिकी कॉलेज एना 1 स्क्रीनिंग के लिए स्वर्ण मानक पद्धति के रूप में IIF के उपयोग के अनुबंध. IIF विशेषज्ञ हाथ में एक उत्कृष्ट स्क्रीनिंग परीक्षा है, प्रसंस्करण और IIF पढ़ने के तकनीकी कठिनाइयों स्लाइड - जैसे श्रम गहन स्लाइड प्रसंस्करण, मैनुअल पढ़ने, अनुभवी लिए की जरूरत है, प्रशिक्षित प्रौद्योगिकीविदों और अंधेरे कमरे के उपयोग के रूप - IIF विधि बनाने आधुनिक, स्वचालित प्रयोगशालाओं के कार्यप्रवाह में फिट करने के लिए मुश्किल. उच्च गुणवत्ता एना स्क्रीनिंग की दिशा में पहला और महत्वपूर्ण कदम सावधान स्लाइड प्रसंस्करण है. यह प्रक्रिया श्रम गहन है, और पूरी प्रक्रिया की समझ है, साथ ही विवरण और अनुभव करने के लिए ध्यान की आवश्यकता है. स्लाइड पढ़ने अंधेरे कमरे में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जाता है, और सेल चक्र के संदर्भ में, विभिन्न पैटर्न के साथ परिचित हैं, जो प्रशिक्षित प्रौद्योगिकीविदों द्वारा किया जाता हैऔर अंतरावस्था और विभाजित कोशिकाओं की आकारिकी. IIF सही ढंग से इस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए कदम को समझने, सार्ड के लिए पहली पंक्ति प्रदर्शन उपकरण प्रदान की है कि महत्वपूर्ण है. हाल ही में, डिजिटल इमेजिंग सिस्टम IIF स्लाइड्स की स्वचालित पढ़ने के लिए विकसित किया गया है. ऐसे नोवा देखें स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के रूप में इन पद्धतियों, दिनचर्या IIF कार्यप्रवाह को कारगर बनाने के लिए तैयार कर रहे हैं. नोवा देखें जिससे व्याख्या से छवि अधिग्रहण को अलग करने, कुओं की उच्च संकल्प डिजिटल छवियों का अधिग्रहण और दुकानों; छवियों उच्च संकल्प कंप्यूटर मॉनिटर पर व्याख्या की एक में देखा जाता है. यह भविष्य में संदर्भ के लिए छवियों को संग्रहीत करता है और छवियों पर फ्लोरोसेंट रोशनी की तीव्रता डेटा उपलब्ध कराने के द्वारा संचालक की व्याख्या का समर्थन करता है. यह भी प्रारंभिक सकारात्मक या नकारात्मक रूप में परिणाम categorizes, और सकारात्मक नमूने के लिए पैटर्न मान्यता प्रदान करता है. संक्षेप में, यह darkroom के लिए की आवश्यकता समाप्त, और automates और IIF readi सुव्यवस्थितएनजी / व्याख्या कार्यप्रवाह. सबसे महत्वपूर्ण बात यह पाठकों और रीडिंग के बीच स्थिरता बढ़ जाती है. इसके अलावा, बारकोड वाले स्लाइड्स के उपयोग के साथ, प्रतिलेखन त्रुटियों नमूना traceability और सकारात्मक रोगी की पहचान कराने के द्वारा समाप्त हो जाते हैं. इस वृद्धि रोगी डेटा अखंडता और सुरक्षा में परिणाम है. इस वीडियो के समग्र लक्ष्य स्लाइड प्रसंस्करण, आम IIF पैटर्न की पहचान है, और इस तकनीक को आसान बनाने और अनुरूप नई प्रगति का परिचय सहित, IIF प्रक्रिया का प्रदर्शन है.

एचईपी-2 के लिए सेल धुंधला परिणामों का मूल्यांकन, पांच प्रमुख परमाणु पैटर्न सबसे अधिक बताया हैं: समरूप, धब्बेदार, गुणसूत्रबिंदु, nucleolar, और परमाणु डॉट्स. इन नमूनों स्वप्रतिरक्षी नाभिक की विशेष घटक के लिए बाध्य करने के परिणाम हैं. एना परीक्षण परमाणु संरचनाओं के लिए विशिष्ट है, cytoplasmic संरचनाओं के खिलाफ autoantibodies के साथ जुड़े cytoplasmic पैटर्न भी देखा जा सकता है. कुछ मामलों में, कई autoantibodies एक नमूने में मौजूद हो सकता है, और छवि एक मिश्रित पैटर्न के रूप में प्रकट हो सकता है. अन्य कम अक्सर देखा, और IIF विधि से पता लगाया जा सकता है कि अक्सर सेल चक्र विशिष्ट पैटर्न हैं; सबसे हाल ही में, विशेष चिकित्सीय महत्व के साथ एक तथाकथित घने ठीक धब्बेदार पैटर्न कुछ एना सकारात्मक सीरा में वर्णित किया गया है. सजातीय पैटर्न एक सजातीय पैटर्न की पहचान करने के लिए, अच्छी तरह से स्कैन और mitotic या विभाजन की पहचानकोशिकाओं. mitotic कोशिकाओं की सघन chromatin (चित्रा 2, नारंगी तीर) अक्सर सजातीय पैटर्न, आराम कोशिकाओं प्रदर्शनी वर्दी, पूरे नाभिक की फैलाना प्रतिदीप्ति (चित्रा nuclei.In विश्राम कक्ष में की तुलना में अधिक स्पष्ट है, जो ठोस, ​​वर्दी प्रतिदीप्ति दर्शाती 2, सफेद तीर). यह विशेषता पैटर्न अक्सर विरोधी dsDNA एंटीबॉडी 10 का परिणाम है. धब्बेदार पैटर्न मोटे धब्बेदार पैटर्न में, mitotic कोशिकाओं गाढ़ा गुणसूत्र क्षेत्रों का कोई धुंधला (चित्रा 3, नारंगी तीर) दिखा. आराम कोशिकाओं पूरे नाभिक भर बारीक प्रतिदीप्ति दिखा रहे हैं. परमाणु speckling मोटे या ठीक के रूप में परिभाषित किया जा सकता है. मोटे speckling पैटर्न अक्सर विरोधी एस.एम. और विरोधी RNP 11 का परिणाम है. ठीक धब्बेदार पैटर्न में, आराम कोशिकाओं को आमतौर पर एक समान विकास में, नाभिक भर में ठीक या फैलाना speckling दिखानेistribution (चित्रा 4, सफेद तीर). ठीक धब्बेदार पैटर्न अक्सर विरोधी SSAand विरोधी एसएसबी 12 का परिणाम है. घने ललित धब्बेदार पैटर्न यह अब घने ठीक धब्बेदार पैटर्न (डीएफएस) नियमित परीक्षण में आम है कि मान्यता प्राप्त है, और नमूने के रूप में ज्यादा के रूप में 12% विरोधी DFS70 autoantibodies के लिए सकारात्मक रहे है. हालांकि, अलगाव में पाया जब इन autoantibodies, प्रणालीगत autoimmune आमवाती रोगों 4 -6 से संबद्ध नहीं हैं. ये एंटीबॉडी स्वस्थ व्यक्तियों और सार्ड 6 के लिए असंबंधित रोगों असर रोगियों में प्रचलित हैं. विरोधी DFS70 एंटीबॉडी के लिए पुष्टि परीक्षण, अनावश्यक पलटा परीक्षण कम करने में मदद काफी लागत बचत की पेशकश, और रोगी चिंता कम कर सकते हैं. डीएफएस पैटर्न की पहचान करने और एना सकारात्मकता दोनों मरीजों और चिकित्सकों के लिए चिंता पैदा कर सकता है मुश्किल है, यह अत्यधिक की पहचान के बाद एक पुष्टि परीक्षण करने की सिफारिश की है<html> एना के नैदानिक ​​महत्व को स्पष्ट करने के लिए विरोधी DFS70 एंटीबॉडी का सूचक एक पैटर्न fying 5,6 positivty. सेल नाभिक (चित्रा 5, सफेद तीर) नाभिक भर में प्रदर्शनी समान रूप से वितरित ठीक speckles के आराम जबकि इस पैटर्न में, mitotic कोशिकाओं (चित्रा 5, नारंगी तीर), मेटाफ़ेज़ chromatin की सकारात्मक धब्बेदार धुंधला दिखा. Centromere पैटर्न , गुणसूत्रबिंदु पैटर्न की पहचान कुओं को स्कैन और mitotic या विभाजित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए. Mitotic कोशिकाओं (चित्रा 6, नारंगी तीर) में, इन असतत speckles के निकट से अक्सर एक &quot;मेटाफ़ेज़ बार &#39;के रूप में वर्णित किया जाता है में जुड़े हो जाते हैं. गुणसूत्रबिंदु पैटर्न में, आराम कोशिकाओं (चित्रा 6, सफेद तीर) नाभिक भर में वितरित लगभग 40-60 असतत speckles दिखा. गुणसूत्रबिंदु पैटर्न विरोधी CENP एक का परिणाम है, बी, सी 13 एंटीबॉडी. कदम &quot;&gt; nucleolar पैटर्न अन्य nucleolear पैटर्न गुणसूत्र क्षेत्र की सकारात्मक धुंधला प्रदर्शित करते हुए कुछ nucleolar पैटर्न, mitotic कोशिकाओं में फैलाना cytoplasmic धुंधला (चित्रा 7, नारंगी तीर) और नकारात्मक गुणसूत्र क्षेत्र के साथ जुड़े रहे हैं. nucleolar पैटर्न कमजोर धब्बेदार या nucleoplasm के समरूप धुंधला के साथ, nucleoli के समरूप या धब्बेदार धुंधला (चित्रा 7, सफेद तीर) के साथ जुड़ा हुआ है. इन नमूनों विरोधी शाही सेना पोलीमरेज़ III के साथ जुड़े रहे हैं, विरोधी fibrillarin, anti-Th/To और anti-PM/Scl 14,15 एंटीबॉडी. परमाणु डॉट पैटर्न परमाणु डॉट पैटर्न नकारात्मक मेटाफ़ेज़ mitotic कोशिकाओं (चित्रा 8, नारंगी तीर) के साथ और विश्राम सेल नाभिक में कुछ असतत speckles (8 चित्रा, सफेद तीर) के साथ जुड़ा हुआ है. यह विशेषता पैटर्न अक्सर SP-100, पीएमएल, या P80 कॉलिन autoantibodies का परिणाम है. ये एंटीबॉडी के रूप में कर रहे हैं<html> प्राथमिक पैत्तिक सिरोसिस और autoimmune हैपेटाइटिस 16 के साथ sociated. <img alt="चित्रा 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . चित्रा 1 नकारात्मक नियंत्रण (बाएं): कोशिकाओं गैर विशिष्ट प्रतिदीप्ति कम स्तर है, लेकिन कोई विशिष्ट परमाणु धुंधला प्रदर्शित सकारात्मक नियंत्रण (दाएं):. प्रकोष्ठों सेब हरे परमाणु प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करते हैं. <img alt="चित्रा 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> चित्रा 2. समरूप पैटर्न. Mitotic कोशिकाओं (orangearrow) ठोस प्रतिदीप्ति दिखा. आराम कोशिकाओं भी, फैलाना धुंधला (whitearrow) दिखा. &quot;चौड़ाई =&quot; 500 &quot;/&gt; चित्रा 3. मोटे धब्बेदार पैटर्न. Mitotic कोशिकाओं (नारंगी तीर) नकारात्मक धुंधला दिखा. आराम कोशिकाओं को एक अलग धब्बेदार दाग (सफेद तीर) दिखा. <img alt="चित्रा 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> चित्रा 4. ललित धब्बेदार पैटर्न. Mitotic कोशिकाओं (नारंगी तीर) नकारात्मक धुंधला दिखा. आराम कोशिकाओं एक विशिष्ट ठीक धब्बेदार धुंधला (सफेद तीर) दिखा. <img alt="चित्रा 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> चित्रा 5. घने ठीक धब्बेदार पैटर्न. Mitotic कोशिकाओं (नारंगी तीर) के ठीक एक बारीक ठोस धुंधला दिखा. आराम कोशिकाओं (whitearrow) एक बहुत ही सुन्दर, फैलाना धब्बेदार दाग दिखा. चित्रा 6. Centromere पैटर्न. Mitotic कोशिकाओं (orangearrow) शो वर्दी, असतत speckles. कोशिकाओं (whitearrow) आराम सेल नाभिक प्रति 40-60 असतत speckles से पता चलता है. <img alt="चित्रा 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> चित्रा 7. Nucleolar पैटर्न. Mitotic कोशिकाओं (orangearrow) बारीक धुंधला के रूप में बड़े समूहों में दिखाई देते हैं. Nucleoli में आराम कर रही सेल nucleishows प्रतिदीप्ति (whitearrow). <img alt="8 चित्रा" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> चित्रा 8. परमाणु डॉट पैटर्न. Mitotic कोशिकाओं (orangearrow) नकारात्मक दिखाई देते हैं. आराम कोशिकाओं कुछ discr दिखानेनाभिक (whitearrow) में ETE speckles. इसके अतिरिक्त, nucelar डॉट पैटर्न mitochondrial एंटीजन (लाल तीर) को autoantibodies के साथ जुड़े cytoplasmic धुंधला के साथ साथ रह सकते हैं.

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Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

अप्रत्यक्ष Immunofluorescent (IIF) assays पारंपरिक रूप से मानव सीरम में antinuclear एंटीबॉडी (एएनए) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन एंटीबॉडी की उपस्थिति प्रणालीगत autoimmune आमवाती रोगों (सार्ड) के निदान में सहायता कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से सही इन autoantibodies पता लगाने के लिए IIF तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए कैसे करें.

परमाणु विरोधी एंटीबॉडी एचईपी-2 कोशिकाओं का उपयोग स्क्रीनिंग

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

के लाइव विच्छेदन ड्रोसोफिला भ्रूण एंटीबॉडी धुंधला द्वारा उत्परिवर्ती संग्रह स्क्रीनिंग के लिए सुव्यवस्थित तरीके

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

आरएनएआई स्क्रीनिंग के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में मिशन esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

मिशन LentiPlex स्तनधारी कोशिकाओं में जमा shRNA पुस्तकालय स्क्रीनिंग

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

एक कैप्चर एलिसा के Luminex Xmap परख एक मल्टीप्लेक्स एंटीबॉडी स्क्रीनिंग विधि का उपयोग करने के लिए रूपांतरण

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

एक घर का बना दोहरे चमक luciferase परख का उपयोग उच्च throughput कार्यात्मक स्क्रीनिंग

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mesenchymal संक्रमण के लिए प्रेरण और उपकला का विश्लेषण

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

एंटीबॉडी धुंधला में<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; &quot;रुक क्रैकिंग&quot; का प्रयोग

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

पोस्ट-transcriptionally विनियमित जीन का रासायनिक Modulators के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

उच्च Throughput स्क्रीनिंग का उपयोग किनेस-सब्सट्रेट जोड़े की पहचान


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

मल्टी एंजाइम एक उच्च throughput जेनेटिक एनजाइम स्क्रीनिंग प्रणाली का प्रयोग स्क्रीनिंग

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...