Name: anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells
Uploaded: 2014-06-23T18:15:00
Duration: 13 min 1 s
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私たちは彼女の専門家の技術検討のためのIIF実験·キャロルブフナーを実行するためのカサンドラブライアントに感謝します。

1。準備と基質の選択サンプル<ol><li>梱包から試薬を除去し、各項目は室温にすることができます。試薬を準備し、方向インサートに応じて患者の血清を希釈。注：NOVAライトのスライドにバーコードされているので、容易に検査情報システムLISと併せて自動化システムに組み込むことができる。この手順は、手動スライド処理を示す図である。ハイスループット研究所は、しかしながら、自動スライド処理装置を選択することができる。 </li></ol>コントロールとサンプルの2また<ol><li>ポジティブコントロールし、適切なスライドウェルにネガティブコントロールの1滴1滴を分注する。残りのウェルに希釈した患者血清のピペット20〜25μL。一度に1スライドを処理します。 </li><li>底に湿らせたペーパータオルで染色容器にスライド（複数可）を配置します。容器を覆い、30分間のスライド（複数可）をインキュベートする。注：湿度の高い条件になる乾燥から基板を防ぐ。井戸の乾燥は、人為的染色につながる可能性があります。このインキュベーション期間中に、患者の血清中の抗核抗体を各ウェルに固定された細胞の抗原に結合するであろう。 </li><li>インキュベーション期間の後、洗浄バッファーの穏やかな流れを用いて血清を洗い流してください。基板の損傷を避けるため、ウェル間のサンプルの交差角度スライドを防止するために若干のウェル上に直接流を導く回避する。余分な洗浄バッファーをオフにタップして、約5分間の洗浄バッファーを含むコプリンジャーにスライドを置く。 </li></ol>蛍光結合体の3。追加<ol><li>一つ一つは、洗浄バッファーからスライドを外し、ゆっくりと過剰な洗浄緩衝液を除去するためにタップします。各ウェルに（FITC抗ヒトIgGのラベル）の蛍光コンジュゲートの1滴を適用します。加湿された容器に30分間スライドをインキュベートし、染色を交換してください容器カバー。注意：ANAのテストでは、IgGのFc特異的結合体の使用をお勧めします。結合体は、光に敏感であり、カバーが加湿された環境を維持することに加えて、光への暴露からスライドを保護します。このインキュベーション期間中に、コンジュゲートは、細胞抗原に結合した患者の抗核抗体に結合するであろう。この結合体は、ウェルにおける蛍光の存在で結果を結合。 </li><li>上記のようにスライドをすすぎ、洗浄します。 </li><li>ペーパータオルの上にカバースリップを置き、カバーガラスの下端までの連続した​​線に封入剤を適用します。 </li><li>洗浄バッファーから各スライドを削除し、余分な洗浄バッファーを除去するためにゆっくりとスライドをタップします。カバースリップの端までスライドの下端をタッチします。 </li><li>穏やかにカバースリップ上の封入剤は、気泡を形成することなく、スライドの上端に流れるような方法で、カバースリップ上にスライドを下げる。注意：共同封入剤の最適量を使用するなど、verslippingは、完璧に練習が必要な技術である。 </li></ol>正と負の結果4。識別マニュアルの解釈<ol><li>ビューには、暗い部屋に置か蛍光顕微鏡でスライドさせる。蛍光の細胞分布と均一性を評価するために20倍または25倍を目的に、全ウェルのスキャンを実行する</li><li>陽性とパターンに関する最終解釈を作るために40倍の対物レンズに切り替えます。 </li><li>ポジティブ及びネガティブコントロールを見てください。 1 + 4 +からの反応度評価尺度を使用したグレードの陽性。注：ネガティブコントロールは、完全に暗く表示されない場合がありますが、多くの場合、低レベルの非特異的な蛍光を表示します。ポジティブコントロールは、核内の明るいアップルグリーン蛍光（ 図1）が表示されます。 </li></ol>自動化された解釈注意：additiでNOVAビュー自動蛍光顕微鏡やその他の自動化されたデジタル画像機器による手動の解釈、負荷およびスキャンスライドへの上;何暗室は必要ありません。適切なスライド式を選択して、プロジェクトを作成した後、測定器は、各ウェル内の細胞の高解像度デジタル画像を取得して記憶する。さらに、NOVAビュー蛍光強度を測定し、陽性または陰性として結果を分類し、陽性サンプルのためのパターン認識を提供する。画像はNOVAの表示結果の最終的な解釈は、改訂、確認を可能にし、高解像度のコンピュータモニタ上のオペレータが見られる。レポートは、確認された結果に生成することができます。それは結果の解釈を助けるために意図されているデジタル顕微鏡は、経験豊かな検査技師に関連して使用されるべきである。

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+scleroderma+sera+contain+autoantibodies+to+protein+components+specific+to+the+UC+small+nucleolar+RNP+complex.">Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex.</a> Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).</li><li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis.">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li></ol>

著者ガブリエラLakos、カサンドラ·ブライアント、キャロルブフナー、とアンナEslamiはINOVA診断の従業員です。

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the &#8220;gold standard&#8221; for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns. 
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells. 
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

長期抗核抗体（ANA）は、DNA、タンパク質およびリボ核タンパク質1、2を含む細胞核の成分と反応する自己抗体の様々を説明しています。 HEP-2細胞、抗原の何百もの天然のタンパク質配列は、全日空1の検出のための理想的な基板を提供する。ヒト血清中のANAの検出は、結合組織疾患のための重要なスクリーニングツールであり、IIFは、ANA 1を試験するための参照方法である。最近では、HEp-2細胞でのIIFは、抗原特異的免疫アッセイおよび多重方法でいくつかの研究室で置き換えられました。原因偽陰性の結果に対する懸念や臨床医への透明性の欠如のために、米国リウマチ学会は、HEp-2細胞を用いて、IIFは、ANAは1をスクリーニングするための「ゴールドスタンダード」であるべきと結論付けたタスクフォースを結成した。 ANAによるスクリーニングの主観的な性質のために、HEp-2細胞の品質である結果の正確かつ自信を持って報告にtegral。有糸分裂細胞の高い数が、最適な細胞形態、十分なコンフルエン、関連抗原の発現の存在は特に重要である。 IIFパターン認識は、患者の診断を支援するための重要なツールとして機能する。様々なパターンの重要性を理解することは、臨床医や検査技師が診断を確定するために、適切なフォローアップのテストを実行することができます。例えば、均質ANAパターンは、抗dsDNA又はクロマチン抗体の存在下で起こり得る、および全身性エリテマトーデス（SLE）3に関連付けることができる。反対側から、近年、一般に、ルーチンサンプルの最大12％において見られる、いわゆる緻密な微細な斑点模様（DFS​​）は、主に抗DFS70抗体と関連していることが記載されている。 （他の疾患特異的ANAずに）単独で見られるこれらの自己抗体は、全身性の自己免疫リウマチ性疾患と関連していない&lt;&gt; 4-9 SUP。それによって、抗DFS70抗体に対する確認検査は、不要な反射テストを減らす大幅なコスト削減を提供し、患者の不安を和らげることができます。 IIFは、自己抗体を検出するための最初の行のスクリーニング方法であることを考えると、ユーザは、試薬および組織基質の選択は結果に影響を与えることができる方法を理解することが最も重要である。 IIF技術は本質的に主観的であるので、使用する試薬は、最高品質の結果を提供することが重要である。 このビデオプロトコルのこの目標は、IIF法、ANAに関連する共通のパターンを実行するために必要な正しい手順をユーザに慣れるために、実験のワークフローを合理化し、結果を標準化することができる新しい進歩を導入することである。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)</td>
			<td style="width:189px;">INOVA Diagnostics</td>
			<td style="width:135px;">708102</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NOVA View Instrument</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>NV2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation License</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barcode Scanner</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells

ANAのテストにリウマチのポジションステートメントのアメリカの大学は、全日空が1をスクリーニングするためのゴールドスタンダード方式としてIIFの使用を規定している。 IIFは、専門家の手の中に優れたスクリーニング検査ではあるが、加工、IIFを読み取る技術的な問題は、スライドさせる - このような労働集約型スライド処理、マニュアル読書、経験豊富なの必要性、訓練を受けた技術者や暗い部屋の使用など - IIFメソッドを作る近代的な、自動化された実験室のワークフローにフィットするのが難しい。 高品質のANAスクリーニングに向けた最初の重要なステップとは、慎重なスライド処理である。この手順では、労働集約的であり、完全なプ​​ロセスの理解だけでなく、細部や経験に注意を払う必要があります。 スライド読み出しが暗い部屋で蛍光顕微鏡によって行われ、細胞周期との関連で、様々なパターンに精通した技術者によって行われそして間期と分裂細胞の形態。 IIFは、SARDのための最初の行のスクリーニングツールであるという条件で、正確にこの手法を実行するための手順を理解することが重要です。 近年、デジタルイメージングシステムは、IIFスライドの自動読み取りのために開発されている。このような、NOVAビュー自動蛍光顕微鏡のようなこれらのシステムは、ルーチンのIIFのワークフローを合理化するために設計されています。 NOVAを表示することにより、読影からの画像取得を分離し、ウェルの高解像度デジタル画像を取得し、記憶する。画像は、高解像度のコンピュータモニタ上で解釈見られる。それは、今後の参考のために画像を格納し、画像上の蛍光強度データを提供することで、オペレータの解釈をサポートしています。また、予備的に正または負のような結果を分類し、陽性サンプルのためのパターン認識を提供しています。要約すると、IIF readiを暗室の必要性を排除し、自動化し、合理化NG /解釈ワークフロー。最も重要なことは、読者と読みの間の一貫性を向上させます。また、スライドバーコードを用いて、転写エラーがサンプルのトレーサビリティと、正の患者識別を提供することによって除去される。これは増加した患者データの整合性と安全性をもたらす。 このビデオの全体的な目標は、スライド処理、共通IIFパターンの識別、およびこの手法を簡素化し、調和させる新たな進歩の導入など、IIFの手順を示すことである。

、均質な斑点、セントロメア、核小体、核ドット：HEP-2のための細胞染色結果を評価する際に、5の主な核のパターンが最も一般的に報告されます。これらのパターンは、自己抗体は、核の特定の構成成分への結合の結果である。 ANAテストは、核構造に特異的であるが、細胞質構造体に対する自己抗体に関連する細胞質パターンも観察することができる。いくつかの場合において、いくつかの自己抗体がサンプル中に存在し得る、画像が混在パターンとして現れることができる。 他のそれほど頻繁に観察され、IIF法によって検出することができるしばしば細胞周期の特定パターンがある;最近では、特殊な臨床的意義を持つ、いわゆる密集細かい斑点パターンはいくつかのANA陽性血清に記載されている。 均質パターン均質なパターンを識別するために、十分にスキャンして、有糸分裂または分割を識別細胞。有糸分裂細胞の凝縮クロマチン（ 図2、オレンジ色の矢印）は、多くの場合、均質なパターン、休止細胞を呈する均一、全体の核の拡散蛍光（ 図 nuclei.In休止菌に比べてより顕著である固体、均一な蛍光を示す2、白矢印）。この特徴的なパターンは、多くの場合、抗dsDNA抗体10の結果である。 まだら模様粗い斑点のパターンでは、有糸分裂細胞が凝縮した染色体領域（ 図3、オレンジ色の矢印）の染色を示さない。休止細胞は、全体の核を通して粒状蛍光を示す。核斑点が粗いか細かいとして定義することができます。粗い斑点パターンは、多くの場合、抗Sm及び抗RNP 11の結果である。 微細な斑点パターンでは、休止細胞は、典型的には均一dにおいて、核全体に細かい又はびまん性斑点を示すistribution（ 図4、白矢印）。細かい斑点模様は、多くの場合、抗SSAand抗SSB 12の結果である。 密な微細斑入りパターン現在では、密な細かい斑点模様（DFS​​）は、通常の試験では一般的であり、サンプルの限り12％が抗DFS70自己抗体陽性であることが認識されている。しかし、単独で見られるこれらの自己抗体は、全身性の自己免疫リウマチ性疾患4 -6に関連付けられていません。これらの抗体は、健常者とSARD 6とは無関係の病気を持つ患者では普及している。抗DFS70抗体についての確認試験は、不要な反射テストを減らすのに役立ち、かなりのコスト削減を提供し、患者の不安を和らげることができます。 DFSパターンを識別することは困難であると、ANA陽性が患者と医師の両方に不安を引き起こす可能性がありますので、それは非常にidenti後の確認検査を行うことをお勧めします<html>全日空positivty 5,6の臨床的意義を明確にする抗DFS70抗体を示唆するパターンをfying。 細胞核（ 図5、白矢印）核全体に展示均一に分布細かいスペックルを休んでいる間、このパターンでは、有糸分裂細胞（ 図5、オレンジ色の矢印）は、中期クロマチンの正斑点染色を示す。 セントロメアパターン 、動原体パターンを識別井戸をスキャンして、有糸分裂または分裂している細胞を同定した。有糸分裂細胞（ 図6、オレンジ色の矢印）では、これらの個別のスペックルが密接にしばしば「中期バー」と記載されているものの中に会合するようになる。セントロメアパターンでは、休止細胞（ 図6、白矢印）は、核全体に分布し、約40〜60の個別スペックルを示しています。セントロメアパターンは、抗CENP A、Bの結果であり、C 13抗体。 ステップ」&gt;核小体のパターン他nucleolearパターンは染色体領域の陽性染色を表示しながら、いくつかの核小体のパターンは、有糸分裂細胞におけるびまん性細胞質染色（ 図7、オレンジ色の矢印）と負の染色体領域に関連付けられています。核小体パターンが弱い斑入りや核質の均一な染色とともに、核小体の均質または斑点染色（ 図7、白矢印）に関連付けられています。これらのパターンは、抗RNAポリメラーゼIII、抗フィブリラリン、anti-Th/Toとanti-PM/Scl抗体14,15に関連している。 核ドット柄核ドットパターンは、負の中期分裂細胞（ 図8、オレンジ色の矢印）とし、安静時の細胞核内のいくつかの個別の斑点（ 図8、白矢印）に関連付けられています。この特徴的なパターンは、多くの場合、SP-100、PML、またはP80コリン自己抗体の結果である。これらの抗体は以下のとおりです。<html>原発性胆汁性肝硬変や自己免疫性肝炎16とsociated。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> 図1ネガティブコントロール（左）：細胞は、低レベルの非特異的な蛍光を表示しませんが、具体的な核染色陽性対照（右）：細胞は、アップルグリーン、核の蛍光を表示します。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。均質パターン。有糸分裂細胞（orangearrow）固体蛍光を示す。休止細胞でも、びまん性染色（whitearrow）を示す。 &quot;幅=&quot; 500 &quot;/&gt; 図3。粗い斑点模様。有糸分裂細胞（オレンジの矢印）は、負の染色を示す。休止細胞は、異なる斑点汚れ（白い矢印）を示している。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> 図4。ファイン斑点模様。有糸分裂細胞（オレンジの矢印）は、負の染色を示す。休止細胞は、明確な細かい斑点染色（白矢印）を示している。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> 図5。高密度細かい斑点模様。有糸分裂細胞（オレンジの矢印）細かい粒状の固形染色を示す。休止細胞は、非常に微細な、びまん性斑点汚れ（whitearrow）を示す。 図6。セントロメアパターン。有糸分裂細胞（orangearrow）均一、離散スペックルを示しています。細胞（whitearrowを）休んでは、細胞核あたり40〜60の個別スペックルを示しています。 <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> 図7。核小体のパターン。有糸分裂細胞（orangearrow）は顆粒状染色のような大きなクラスタを表示されます。核小体で休んセルnucleishows蛍光（whitearrow）。 <img alt="図8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> 図8。原子力ドットパターン。有糸分裂細胞（orangearrow）は負に表示されます。休止細胞は、いくつかのDISCRを表示核（whitearrow）中のETEの斑点が。また、nucelarドットパターンは、ミトコンドリア抗原（赤い矢印）に対する自己抗体に関連する細胞質染色と共存させることができます。

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Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

間接免疫蛍光（IIF）のアッセイは伝統的に、ヒト血清中の抗核抗体（ANA）の検出のために使用されてきた。これらの抗体の存在が全身性自己免疫リウマチ性疾患（SARD）の診断を助けることができる。このプロトコルは、効果的に正確にこれらの自己抗体を検出するために、IIF法を実行する方法を示しています。

抗核抗体のHE​​p-2細胞を用いたスクリーニング

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

anti-nuclear-antibody-screening-using-hep-2-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

生物学

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

ミッションLentiPlexは、哺乳動物細胞ではshRNAライブラリースクリーニングをプールされた

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

抗体染色中<em&gt; C.虫</em&gt;「フリーズクラッキング」使用

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

マルチ酵素ハイスループット遺伝的酵素スクリーニングシステムを用いたスクリーニング

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

抗核抗体のHE​​p-2細胞を用いたスクリーニング

抗核抗体のHEp-2細胞を用いたスクリーニング