Name: anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells
Uploaded: 2014-06-23T18:15:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells at JoVE.com

Мы благодарим Cassandra Брайант для проведения эксперимента IIF и Кэрол Buchner для ее экспертной технического обзора.

1. Подготовка образцов и подложки Selection <ol><li> Удалить реагенты из упаковки и позволяют каждый элемент до комнатной температуры. Подготовка реагентов и разбавить сывороток пациентов в соответствии с направлением вставки. Примечание: NOVA Lite слайды штрих и может быть легко интегрирован в автоматизированные системы в сочетании с Лабораторная информационная система ЛИС. Эта процедура иллюстрирует ручной обработки слайд; высокие лаборатории пропускной, однако, может выбрать для автоматизированной технологического оборудования слайд. </li></ol> 2. Добавление контролей и образцов <ol><li> Внесите 1 каплю положительного контроля и 1 каплю отрицательного контроля в соответствующие слайд скважин. Внесите 20-25 мкл разбавленной сыворотки пациента в оставшиеся лунки. Процесс один слайд в то время. </li><li> Поместите слайд (ы) в окрашивания контейнер с влажным бумажным полотенцем на дне. Крышка контейнера и инкубировать слайд (ы) в течение 30 мин. Примечание: влажных условиях будетпредотвратить субстрат от высыхания. Сушка скважин может привести к артефактом окрашивания. В течение этого инкубационного периода антиядерные антитела в сыворотке пациента, связываются с антигенами клеток, устраняемых в каждую лунку. </li><li> После инкубационного периода, смойте сыворотку с помощью нежный поток промывочного буфера. Во избежание повреждения подложки и предотвратить перекрестное за кадром образцов между скважинами, угол скольжения слегка чтобы избежать направления потока непосредственно на скважинах. Нажмите лишнюю промывочный буфер и поместить слайд в банку Коплин содержащей промывочного буферного раствора в течение примерно 5 мин. </li></ol> 3. Добавление люминесцентных конъюгата <ol><li> Один за другим, удалить слайды из буфера мытья и слегка постучите, чтобы удалить избыток промывочного буфера. Нанести 1 каплю флуоресцентного конъюгата (FITC с надписью анти-человеческий IgG) в каждую лунку. Инкубируйте слайды в течение 30 мин в увлажненной контейнера, и не забудьте заменить окрашиваниекрышка контейнера. Примечание: Для тестирования ANA, использование в конкретной сопряженных IgG Fc рекомендуется. Сопряженная является светочувствительным, и крышка защитит слайды от воздействия света в дополнение к поддержанию во влажной среде. В течение этого периода инкубации, сопряженное будет связываться с анти-ядерных антител пациента, которые связаны с клеточными антигенами. Этот связывающий конъюгат результаты в присутствии флуоресценции в лунках. </li><li> Промыть и мыть слайд, как описано выше. </li><li> Поместите покровное на бумажное полотенце и применять монтажную среду в сплошной линией на нижнем краю покровного стекла. </li><li> Удалить каждый слайд из буфера мытья и нажмите слайд осторожно, чтобы удалить лишнюю промывочный буфер. Нажмите нижний край слайда к краю покровного стекла. </li><li> Осторожно опустить слайд на покровное таким образом, что монтажная среда на покровное течет в верхней кромки ползуна без образования пузырьков воздуха. Примечание: Соverslipping, в том числе с использованием оптимального количества монтажной среды, является метод, который требует практики, чтобы усовершенствовать. </li></ol> 4. Выявление положительных и отрицательных результатов Руководство Интерпретация <ol><li> Просмотр слайдов с флуоресцентным микроскопом, расположенный в темной комнате. Выполните сканирование всего скважины с 20-кратным или 25X цели для оценки распределения клеток и однородность флуоресценции </li><li> Переключитесь на цели 40Х, чтобы сделать окончательный интерпретацию о положительности и рисунок. </li><li> Посмотрите на положительных и отрицательных контролей. Оценка положительность использованием реактивности бальной шкале от 1 + до 4 +. Примечание: отрицательный контроль может не появиться совсем темно, но будет часто демонстрируют неспецифическую флуоресценцию низкий уровень. Положительный контроль покажет яркий яблочный зеленую флуоресценцию в ядре (рис. 1). </li></ol> Автоматизированная интерпретация Примечание: В дополнительна ручной интерпретации, нагрузки и сканирования слайдов по NOVA Посмотреть автоматизированной флуоресцентного микроскопа или другого автоматизированного цифрового прибора формирования изображения; не фотолаборатории не требуется. После создания проекта, выбрав подходящий тип слайд, прибор приобретает и сохраняет с высоким разрешением цифровые изображения клеток в каждой лунке. Кроме того, NOVA Посмотреть измеряет интенсивность флуоресценции света, и классифицирует результаты как позитивные или негативные, и обеспечивает распознавание образов для положительных образцов. Изображения просматриваться оператором на мониторе компьютера с высоким разрешением, что позволяет окончательной интерпретации, пересмотра и подтверждения NOVA Посмотреть результат. Отчеты можно создавать на подтвержденных результатов. Цифровая микроскопия должен быть использован в сочетании с опытным лаборанта так как он предназначен для помощи в интерпретации результатов.

<ol>
	<li>Meroni, P. L., Schur, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANA+screening:+an+old+test+with+new+recommendations.">ANA screening: an old test with new recommendations.</a> Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).</li><li>Tan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+nuclear+antigens+(ANA):+Their+immunobiology+and+medicine.">Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine.</a> Advances in immunology. 33, 167-240 (1982).</li><li>Sack, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+detection+using+indirect+immunofluorescence+on+HEp-2+cells.">Autoantibody detection using indirect immunofluorescence on HEp-2 cells.</a> Ann NY Acad Sci. 1173, 166-173 (2009).</li><li>Watanabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70+antibodies+in+597+healthy+hospital+workers.">Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers.</a> Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).</li><li>Mahler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+dense+fine+speckled+pattern+on+HEp-2+cells+and+anti-DFS70+antibodies+for+the+diagnosis+of+systemic+autoimmune+diseases.">Importance of the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells and anti-DFS70 antibodies for the diagnosis of systemic autoimmune diseases.</a> Autoimmun Revi. 11 (9), 642-645 (2012).</li><li>Mahler, M., Fritzler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+significance+of+the+dense+fine+speckled+immunofluorescence+pattern+on+HEp-2+cells+for+the+diagnosis+of+systemic+autoimmune+diseases.">The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence pattern on HEp-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li><li>Miyara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+phenotypes+of+patients+with+anti-DFS70/LEDGF+antibodies+in+a+routine+ANA+referral+cohort.">Clinical phenotypes of patients with anti-DFS70/LEDGF antibodies in a routine ANA referral cohort.</a> Clin Dev Immunol. , (2013).</li><li>Mariz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+on+the+antinuclear+antibody-HEp-2+test+is+a+critical+parameter+for+discriminating+antinuclear+antibody+positive+healthy+individuals+and+patients+with+autoimmune+rheumatic+diseases.">Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).</li><li>Muro, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concomitance+of+disease+marker+autoantibodies+in+anti-DFS70/LEDGF+autoantibody-positive+patients+with+autoimmune+rheumatic+disease.">High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease.</a> Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).</li><li>Agmon-Levin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+recommendations+for+the+assessment+of+autoantibodies+to+cellular+antigens+referred+to+as+anti-nuclear+antibodies.">International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies.</a> Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).</li><li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U2+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+as+an+autoantigen.">The U2 small nuclear ribonucleoprotein particle as an autoantigen.</a> J Clin Invest. 81 (6), 1716-1724 (1998).</li><li>Salomonsson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serologic+marker+for+fetal+risk+of+congenital+heart+block.">A serologic marker for fetal risk of congenital heart block.</a> Arthritis Rheum. 46 (5), 1233-1241 (2002).</li><li>Miyawaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+serological+heterogeneity+in+patients+with+anticentromere+antibodies.">Clinical and serological heterogeneity in patients with anticentromere antibodies.</a> J Rheumatology. 32 (8), 1488-1494 (2005).</li><li>Raijamkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PM-Scl-75+is+the+main+autoantigen+in+patients+with+the+polymyositis/scleroderma+overlap+syndrome.">PM-Scl-75 is the main autoantigen in patients with the polymyositis/scleroderma overlap syndrome.</a> Arthritis Rheum. 50 (2), 565-569 (2004).</li><li>Yang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+scleroderma+sera+contain+autoantibodies+to+protein+components+specific+to+the+UC+small+nucleolar+RNP+complex.">Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex.</a> Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).</li><li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis.">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li></ol>

Авторы Габриэлла Lakos, Кассандра Брайант, Кэрол Бюхнера, и Анна Ислами являются сотрудниками INOVA Diagnostics.

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the &#8220;gold standard&#8221; for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns. 
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells. 
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

Термин антинуклеарных антител (АНА) описывает разнообразные аутоантител, реагирующих с компонентами клеток ядер в том числе ДНК, белков и рибонуклеопротеинов 1, 2. Нер-2 клеток, уроженец массив белка с сотнями антигенов, представляет собой идеальную подложку для обнаружения АНА 1. Обнаружение ANA в сыворотке человека является важным инструментом скрининга для заболеваний соединительной ткани, и IIF является эталонным методом для тестирования ANA 1. Недавно IIF на Нер-2 клеток была заменена в некоторых лабораторий с антиген-специфических иммунологических и мультиплексных методами. Из-за опасений по поводу ложных отрицательных результатов и отсутствия прозрачности для клиницистов, Американский колледж ревматологии сформировали целевую группу, что к выводу, что IIF использованием клеток Нер-2 должен быть &quot;золотым стандартом&quot; для ANA скрининг 1. Из-за субъективного характера ANA скрининга, качество Нер-2 в клеткахинтегральную к точной и уверенной отчетности о результатах. Присутствие большого количества митотических клеток, оптимальная морфология клеток, достаточное сплошности и экспрессию соответствующих антигенов являются особенно важными. IIF распознавания образов служит в качестве важного инструмента для оказания помощи в диагностике пациентов. Понимание значения различных форм позволяет клиницисты и персонал лаборатории для выполнения соответствующего Последующие испытания, чтобы подтвердить диагноз. Например, однородный образец ANA может происходить в присутствии анти-дцДНК или хроматина антител, и могут быть связаны с системной красной волчанкой (СКВ) 3. С другой стороны, недавно было описано, что так называемые плотные мелкий пестрый рисунок (DFS), что обычно наблюдается в до 12% рутинных проб, в основном были связаны с анти-DFS70 антител. Эти аутоантитела, когда найдено в изоляции (без других конкретных заболеваний АНА) не связаны с системными аутоиммунными ревматическими заболеваниями &lt;вир&gt; 4-9. Таким образом подтверждающее тестирование на анти-DFS70 антител может помочь уменьшить ненужных испытаний рефлекс, предложить значительную экономию средств, и ослабить беспокойство пациента. Учитывая, что IIF является первым методология линия скрининг для выявления аутоантител, чрезвычайно важно, чтобы пользователь понимает, как выбор реагентов и тканей субстратов может повлиять на результаты. Поскольку методика IIF по своей сути субъективны, важно, чтобы реагенты, используемые обеспечивают самые высокие качественные результаты. Эта цель этого видео протокола является ознакомление пользователя с правильными шаги, необходимые для выполнения способа IIF, распространенные паттерны, связанные с АНА, и ввести новые достижения, которые могут рационализации лабораторный рабочий процесс и стандартизации результатов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)</td>
			<td style="width:189px;">INOVA Diagnostics</td>
			<td style="width:135px;">708102</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NOVA View Instrument</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>NV2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation License</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barcode Scanner</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells

Американский колледж Положении ревматологии по тестированию ANA предусматривает использование IIF в качестве метода золотой стандарт для ANA скрининг 1. Хотя IIF является отличным скрининг-тест в опытных руках, технические трудности обработки и чтения IIF скользит - таких, как трудоемкой обработки слайд, ручного считывания, потребность в опытных, обученных технологов и использование темной комнате - сделать метод IIF трудно вписать в рабочий процесс современных, автоматизированных лабораторий. Первый и наиболее важный шаг на пути к высококачественной ANA скрининга осторожны обработки слайд. Эта процедура является трудоемкой и требует полного понимания процесса, а также внимание к деталям и опыта. Презентация считывание выполняется методом флуоресцентной микроскопии в темных комнатах, и делается обученным технологов, которые знакомы с различными узорами, в контексте клеточного циклаи морфология интерфазы и делящихся клеток. При условии, что IIF является первой линией инструмент скрининга для САРД, понимая шаги правильно выполнять эту технику имеет решающее значение. В последнее время цифровые системы визуализации были разработаны для автоматизированного чтения IIF слайдов. Эти системы, такие как NOVA Посмотреть автоматизированной флуоресцентного микроскопа, предназначены для упрощения рутинной рабочий процесс IIF. NOVA Посмотреть приобретает и сохраняет с высоким разрешением цифровые изображения лунок, тем самым отделяя получение изображений от интерпретации; просмотре изображений интерпретируется на компьютерных мониторах высокого разрешения. Он хранит изображения для использования в будущем и поддерживает интерпретацию оператора, предоставляя флуоресцентные данные интенсивности света на изображениях. Он также предварительно классифицирует результаты как позитивные или негативные, и обеспечивает распознавание образов для положительных образцов. Таким образом, это устраняет необходимость в темной комнате, и автоматизирует и упрощает Readi IIFнг / интерпретация рабочий процесс. Самое главное, что увеличивает согласованность между читателями и чтениях. Кроме того, с использованием штрих слайдов, ошибки транскрипции устраняются путем предоставления образца отслеживаемости и положительной идентификации пациента. Это приводит к увеличению пациента целостности и безопасности данных. Общая цель этого видео, чтобы продемонстрировать процедуру IIF, включая обработку слайд, выявление общих моделей IIF, и внедрения новых достижений упрощения и согласования эту технику.

При оценке результатов окрашивания клеток для Нер-2, пять основных ядерных шаблоны наиболее часто встречающихся: однородная, в крапинку, центромеры, ядрышек, а ядерные точки. Эти модели являются результатом аутоантител связывания со специфическими компонентами ядра. Хотя тестирование ANA является специфическим для ядерных структур, цитоплазматические структуры, связанные с аутоантител против цитоплазматических структур также может наблюдаться. В некоторых случаях, несколько аутоантитела могут присутствовать в образце, и изображение может отображаться в виде смешанной формы. Есть и другие, менее часто наблюдается, и часто специфические клеточного цикла модели, которые могут быть обнаружены с помощью метода IIF; Совсем недавно так называемые плотные мелкий пестрый узор с особым клиническое значение было описано в некоторых ANA положительной сыворотки. Однородная Pattern Чтобы определить однородную картину, сканировать хорошо и определить митотических или делениемклетки. Конденсированного хроматина из делящихся клеток (рис. 2, оранжевая стрелка) имеет прочную, единую флуоресценции который часто сильнее, чем в покоящейся клетки nuclei.In однородной рисунком, покоящиеся клетки выставочная форме, диффузного флуоресценции всей ядра (рис. 2, белые стрелки). Это характерная картина часто является результатом анти-дц-ДНК антител 10. Пестрая Pattern В грубой пестрой картины, митотические клетки не проявляют окрашивание конденсированных участков хромосом (рис. 3, оранжевая стрелка). В покоящиеся клетки проявляют гранулированный флуоресценции в течение всего ядра. Ядерная зернистость может быть определен как грубой или штрафа. Грубый рисунок зернистость часто является результатом анти-Sm и анти-RNP 11. В изобразительном пестрой картины, то покоящиеся клетки отображения мелких или диффузное зернистость всей ядер, как правило, в едином гistribution (рис. 4, белые стрелки). Штраф в крапинку рисунок часто является результатом анти-SSAand анти-SSB 12. Плотные Изысканные Пестрая Pattern В настоящее время признано, что плотная тонкая пестрый узор (DFS) является общим в рутинного тестирования, и столько, сколько 12% проб положительны для анти-DFS70 аутоантител. Однако эти аутоантитела, когда найдено в изоляции, не связаны с системными аутоиммунными ревматическими заболеваниями 4 -6. Эти антитела, которые широко распространены в здоровых людей и пациентов, имеющих заболевания, не связанные с САРД 6. Подтверждающий тест на анти-DFS70 антител может помочь уменьшить ненужных испытаний рефлекс, предложить значительную экономию средств, и ослабить беспокойство пациента. Поскольку шаблон DFS трудно определить и ANA положительность может вызвать беспокойство в обоих пациентов и врачей, то настоятельно рекомендуем выполнить подтверждающий тест после отождествлении<html> фикации шаблон наводящий анти-DFS70 антител уточнить клиническое значение АНА positivty 5,6. В этом шаблоне митоза клетки (рис. 5, оранжевая стрелка) показать положительный пятнистые окрашивание метафазной хроматина, во время отдыха клеточные ядра (рис. 5, белая стрелка) экспонат равномерно распределенные мелкие крапинки по всему ядру. Центромера Pattern Чтобы определить модель центромер, сканировать скважин и определить митотических или делящиеся клетки. В митотических клеток (рис. 6, оранжевая стрелка), эти дискретные пятен стать тесно связана в том, что часто описывается как &quot;метафазной баре&quot;. В структуре центромеры, покоящиеся клетки (рис. 6, белая стрелка) показать около 40-60 дискретных пятен, распределенные по ядер. Шаблон центромеры является результатом анти-CENP A, B, C антитела 13. шаг &quot;&gt; ядрышковых Pattern Некоторые ядрышковые модели связаны с диффузной окрашивание цитоплазмы в митотических клеток (рис. 7, оранжевая стрелка) и отрицательной области хромосомы, в то время как другие nucleolear модели отображения положительное окрашивание хромосомной области. Ядрышковый шаблон связан с однородной или крапчатый окрашивания ядрышек (рис. 7, белая стрелка), а также слабой крапчатый или гомогенного окрашивания нуклеоплазме. Эти модели связаны с анти-РНК-полимеразы III, анти-фибрилларин, anti-Th/To и anti-PM/Scl антитела 14,15. Ядерная Dot Pattern Шаблон ядерной точка связана с отрицательными метафаза митотических клеток (рис. 8, оранжевая стрелка) и с несколькими дискретными крапинками в покое клеточных ядер (рис. 8, белая стрелка). Это характерная картина часто результат SP-100, ПМЛ, или P80 Колин аутоантител. Эти антитела также<html> sociated с первичным билиарным циррозом и аутоиммунным гепатитом 16. <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . Рисунок 1 Отрицательный контроль (слева): Клетки отображения низкий уровень неспецифического флуоресценции, но не конкретный ядерное окрашивание Положительный контроль (справа):. Клетки отображения яблочный зеленый ядерной флуоресценции. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> Рисунок 2. Однородная модель. Митотические клетки (orangearrow) показать твердую флуоресценции. Покоящиеся клетки показывают даже, диффузный окрашивания (whitearrow). &quot;Ширина =&quot; 500 &quot;/&gt; Рисунок 3. Грубый пятнистые картины. Митотические клетки (оранжевая стрелка) показать негативное окрашивание. Покоящихся клеток наблюдается отчетливая крапчатую пятно (белая стрелка). <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> Рисунок 4. Изысканные пестрый рисунок. Митотических клеток (оранжевая стрелка) показать негативное окрашивание. Покоящихся клеток наблюдается отчетливая тонкая крапчатую окрашивание (белая стрелка). <img alt="Рисунок 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> Рисунок 5. Плотные штраф в крапинку рисунок. Митотических клеток (оранжевая стрелка) показывают мелкозернистого твердого окрашивание. Покоящихся клеток показывают, очень тонкие, диффузный крапчатую пятно (whitearrow). Рисунок 6. Центромера рисунок. Митотические клетки (orangearrow) показать равномерным, дискретные пятен. Отдыхая клетки (whitearrow) показывает 40-60 дискретных пятен на клеточном ядре. <img alt="Рисунок 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> Рисунок 7. Ядрышковых рисунок. Митотические клетки (orangearrow) появляются как большие кластеры гранулированного окрашивания. Отдыхая клеток nucleishows флуоресценции в ядрышек (whitearrow). <img alt="Рисунок 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> Рисунок 8. Ядерная точка рисунок. Митотические клетки (orangearrow) появляются отрицательные. Покоящиеся клетки показывают несколько DISCRETE пятен в ядре (whitearrow). Кроме того, nucelar шаблон точка может сосуществовать с цитоплазматической окрашивания, связанной с аутоантител к митохондриальных антигенов (красная стрелка).

Watch this Scientific Journal Video about Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells at JoVE.com

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Косвенное иммунофлуоресцентный (IIF) анализы традиционно использовались для обнаружения антинуклеарных антител (АНА) в сыворотке крови человека. Присутствие этих антител может помочь в диагностике системных аутоиммунных ревматических заболеваний (САРД). Этот протокол демонстрирует, как эффективно выполнять технику IIF точно обнаружить эти аутоантитела.

Антиядерные антитела скрининг Использование клеток Нер-2

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Живая Препарирование Drosophila Эмбрионы: Упрощенная методы скрининга Мутант Коллекции антител Окрашивание

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

МИССИЯ esiRNA для скрининга RNAi в клетках млекопитающих

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

МИССИЯ LentiPlex Объединенные shRNA библиотеки Скрининг в клетках млекопитающих

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Преобразование Capture ИФА в Пробирной Luminex Xmap помощью скрининга Мультиплекс антител методом

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Высокая пропускная Функциональная Скрининг с использованием Домашнее двойного свечения люциферазы

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Антитела Окрашивание в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование &quot;Freeze-Крекинг&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Идентификация киназы-подложки пар Использование высокопроизводительного скрининга


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

Multi-фермента скрининга с использованием высокой пропускной Генетическая ферментного Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...