Name: anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells
Uploaded: 2014-06-23T18:15:00
Duration: 13 min 1 s
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Damos las gracias a Cassandra Bryant para realizar el experimento IIF y Carol Buchner por su revisión técnica de expertos.

1. Preparación de la muestra y la selección del sustrato <ol><li> Extraiga los reactivos del paquete y permitir que cada elemento a la temperatura ambiente. Preparar los reactivos y diluir el suero del paciente de acuerdo con la dirección de inserción. Nota: Las diapositivas NOVA Lite se un código de barras y se puede integrar fácilmente en los sistemas automatizados en conjunto con el Sistema de Información de Laboratorio LIS. Este procedimiento ilustra el procesamiento manual de diapositivas; laboratorios de alto rendimiento, sin embargo, pueden optar por un equipo automático de procesamiento de diapositivas. </li></ol> 2. Adición de controles y muestras <ol><li> Dispensar 1 gota de control positivo y 1 gota de control negativo a los pocillos apropiados de diapositivas. Pipeta 20-25 l de suero diluido de paciente a los pocillos restantes. Procesar una diapositiva a la vez. </li><li> Coloque la diapositiva (s) en un recipiente de tinción con una toalla de papel húmeda en la parte inferior. Cubrir el recipiente y incubar el portaobjetos (s) durante 30 min. Nota: Las condiciones de humedad seevitar que el sustrato se seque. El secado de los pozos podría resultar en artefactos de tinción. Durante este período de incubación, los anticuerpos anti-nucleares en el suero del paciente se unirán a los antígenos de las células que se fijan en cada pocillo. </li><li> Después del periodo de incubación, enjuague el suero utilizando un chorro suave de tampón de lavado. Con el fin de evitar daños en el sustrato y evitar cruzado de las muestras entre los pozos, ángulo de la corredera ligeramente para evitar dirigir la corriente directamente sobre los pocillos. Elimine el exceso de tampón de lavado y colocar la placa en una jarra Coplin con tampón de lavado durante aproximadamente 5 min. </li></ol> 3. Adición de conjugado fluorescente <ol><li> Uno por uno, retire las diapositivas de la solución de lavado y golpear suavemente para eliminar el exceso de tampón de lavado. Aplicar 1 gota de conjugado fluorescente (marcado con FITC anti-IgG humana) a cada pocillo. Incubar los portaobjetos durante 30 minutos en el recipiente humidificado, y asegúrese de reemplazar la tincióntapa del recipiente. Nota: Para la prueba de ANA, se recomienda el uso de un conjugado de IgG específica de Fc. El conjugado es sensible a la luz, y la cubierta protegerá las diapositivas de la exposición a la luz, además de mantener el medio ambiente humidificado. Durante este periodo de incubación, el conjugado se unirá a los anticuerpos anti-nucleares del paciente que se han unido a los antígenos de las células. Este conjugado de unión resultados en la presencia de fluorescencia en los pocillos. </li><li> Enjuagar y lavar el portaobjetos como se describe anteriormente. </li><li> Coloque un cubreobjetos sobre una toalla de papel y aplicar el medio de montaje en línea continua hasta el borde inferior del cubreobjetos. </li><li> Retire cada diapositiva de la solución de lavado y golpee suavemente el portaobjetos para retirar el exceso de tampón de lavado. Toque el borde inferior de la diapositiva en el borde del cubreobjetos. </li><li> Bajar suavemente el portaobjetos sobre el cubreobjetos de tal manera que el medio de montaje sobre el cubreobjetos fluye hacia el borde superior de la corredera y sin la formación de burbujas de aire. Nota: Coverslipping, incluyendo el uso de la cantidad óptima de medio de montaje, es una técnica que requiere de práctica para perfeccionar. </li></ol> 4. Identificación de los resultados positivos y negativos Interpretación Manual <ol><li> Ver desliza con un microscopio de fluorescencia, que se encuentra en un cuarto oscuro. Realizar el análisis de todo el pozo con un objetivo 20X o 25X para evaluar la distribución de células y la uniformidad de la fluorescencia </li><li> Cambiar a un objetivo de 40X para hacer la interpretación final con respecto a la positividad y el patrón. </li><li> Mira los controles positivos y negativos. Positividad Grado usando una escala de clasificación reactividad de 1 + a 4 +. Nota: El control negativo no puede aparecer completamente a oscuras, pero a menudo mostrará fluorescencia inespecífica de bajo nivel. El control positivo se mostrará manzana brillante fluorescencia verde en el núcleo (Figura 1). </li></ol> Interpretación automatizada Nota: En additien la interpretación manual, carga y diapositivas de escaneo por NOVA Ver Automatizado microscopio de fluorescencia o de otro instrumento de imagen digital automatizado; sin cuarto oscuro es necesario. Después de crear un proyecto mediante la selección del tipo de deslizamiento adecuado, el instrumento adquiere y almacena imágenes digitales de alta resolución de las células en cada pocillo. Además, NOVA Ver mide la intensidad de la luz fluorescente, y clasifica los resultados como positivos o negativos, y proporciona el reconocimiento de patrones para las muestras positivas. Las imágenes se visualizan por el operador en un monitor de ordenador de alta resolución, lo que permite la interpretación final, revisión y confirmación de NOVA Ver resultado. Se pueden generar informes sobre los resultados confirmados. Microscopía digital debe ser usado en conjunción con un técnico de laboratorio experimentado, ya que está destinado a ayudar en la interpretación de los resultados.

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+scleroderma+sera+contain+autoantibodies+to+protein+components+specific+to+the+UC+small+nucleolar+RNP+complex.">Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex.</a> Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).</li><li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis.">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li></ol>

Los autores Gabriella Lakos, Cassandra Bryant, Carol Buchner, y Anna Eslami son empleados de INOVA Diagnostics.

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the &#8220;gold standard&#8221; for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns. 
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells. 
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

El término anticuerpos antinucleares (ANA) describe una variedad de autoanticuerpos que reaccionan con constituyentes de los núcleos de células incluyendo ADN, proteínas y ribonucleoproteínas 1, 2. La célula HEp-2, una matriz de proteína nativa con cientos de antígenos, proporciona un sustrato ideal para la detección de ANA 1. La detección de anticuerpos antinucleares en el suero humano es una herramienta de detección importante para enfermedades del tejido conectivo, y IIF es el método de referencia para la prueba ANA 1. Recientemente, IIF en células HEp-2 ha sido sustituido en algunos laboratorios con inmunoensayos específicos de antígenos y métodos múltiplex. Debido a la preocupación por los resultados negativos falsos y la falta de transparencia de los médicos, el Colegio Americano de Reumatología formó un Grupo de Trabajo que concluyó que IIF utilizando células HEp-2 debe ser el &quot;estándar de oro&quot; para la detección de ANA 1. Debido a la naturaleza subjetiva de la detección de ANA, la calidad de células HEp-2 se encuentra engral de informes precisos y confiado de los resultados. La presencia de un alto número de células mitóticas, la morfología óptima de células, suficiente confluencia, y la expresión de antígenos relevantes son particularmente importantes. IIF reconocimiento de patrones sirve como una herramienta importante para ayudar en el diagnóstico del paciente. Comprender el significado de varios patrones permite a los médicos y personal de laboratorio para llevar a cabo la adecuada prueba de seguimiento para confirmar el diagnóstico. Por ejemplo, el patrón de ANA homogéneo puede ocurrir en la presencia de anticuerpos anti-ADN de doble cadena de la cromatina o, y puede ser asociado con el lupus eritematoso sistémico (LES) 3. Desde el otro lado, recientemente se ha descrito que el llamado patrón denso fino moteado (DFS) que se ve comúnmente en hasta el 12% de las muestras de rutina, sobre todo se ha asociado con anticuerpos anti-DFS70. Estos autoanticuerpos, cuando se encuentran en forma aislada (sin otra ANA específica de la enfermedad) no están asociados con enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas &lt;sup&gt; 4-9. De esta manera la prueba confirmatoria de anticuerpos anti-DFS70 puede ayudar a reducir el reflejo de las pruebas innecesarias, ofrecen un considerable ahorro de costes, y calmar la ansiedad del paciente. Dado que el IIF es la primera metodología de selección de línea para detectar autoanticuerpos, es primordial que el usuario entiende cómo la selección de los reactivos y sustratos de tejidos puede afectar los resultados. Dado que la técnica IIF es inherentemente subjetiva, es importante que los reactivos utilizados proporcionan los resultados más altos de calidad. Este objetivo de este protocolo de vídeo es familiarizar al usuario con los pasos correctos necesarios para llevar a cabo el método de IFI, los patrones comunes asociados con ANA, e introducir los nuevos avances que pueden agilizar el flujo de trabajo de laboratorio y estandarizar los resultados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)</td>
			<td style="width:189px;">INOVA Diagnostics</td>
			<td style="width:135px;">708102</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NOVA View Instrument</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>NV2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QUANTA Link Workstation License</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barcode Scanner</td>
			<td>INOVA Diagnostics</td>
			<td>LINK019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anti-nuclear antibody screening using hep-2 cells

El Colegio Americano de Reumatología declaración de posición sobre las pruebas de ANA estipula el uso de la IFI como el método estándar de oro para ANA proyección 1. Aunque IIF es una excelente prueba de detección en manos expertas, las dificultades técnicas de procesamiento y lectura IIF diapositivas - tales como el procesamiento de mano de obra intensiva de diapositivas, la lectura manual, la necesidad de experiencia, los técnicos capacitados y el uso de la cámara oscura - hacer que el método IIF difícil de encajar en el flujo de trabajo de, laboratorios automatizados modernos. El primer y crucial paso para la detección de ANA es de alta calidad de procesamiento de diapositivas cuidado. Este procedimiento es laborioso y requiere una comprensión completa del proceso, así como la atención a los detalles y la experiencia. Slide lectura se realiza mediante microscopía de fluorescencia en habitaciones oscuras, y se lleva a cabo por técnicos capacitados que están familiarizados con los diversos patrones, en el contexto del ciclo celulary la morfología de la interfase y las células en división. Siempre que IIF es la primera herramienta de líneas para la ADRS, la comprensión de los pasos para realizar correctamente esta técnica es fundamental. Recientemente, los sistemas de imágenes digitales se han desarrollado para la lectura automatizada de diapositivas IIF. Estos sistemas, como el NOVA Ver automatizada fluorescente Microscopio, están diseñados para agilizar el flujo de trabajo de rutina IIF. NOVA Ver adquiere y almacena de alta resolución las imágenes digitales de los pozos, separando de este modo la adquisición de imágenes de la interpretación; imágenes se ven un interpretados en los monitores de ordenador de alta resolución. Almacena imágenes para futuras referencias y apoyan la interpretación del operador, proporcionando datos de intensidad de luz fluorescentes en las imágenes. También clasifica preliminarmente resultados como positivos o negativos, y proporciona el reconocimiento de patrones para las muestras positivas. En resumen, se elimina la necesidad de cuarto oscuro, y automatiza y agiliza el readi IIFng / flujo de trabajo de interpretación. Lo más importante, aumenta la coherencia entre los lectores y las lecturas. Por otra parte, con el uso de diapositivas con códigos de barras, los errores de transcripción se eliminan, proporcionando trazabilidad de las muestras y la identificación positiva del paciente. Esto se traduce en una mayor integridad de los datos y seguridad del paciente. El objetivo general de este video es para demostrar el procedimiento IIF, incluyendo el procesamiento de diapositivas, la identificación de patrones comunes IIF, y la introducción de nuevos avances para simplificar y armonizar esta técnica.

Al evaluar los resultados de la tinción de células de HEp-2, cinco grandes patrones nucleares son más comúnmente reportados: homogénea, pintados centrómero, nucleolar, y los puntos nucleares. Estos patrones son el resultado de la unión de autoanticuerpos con constituyentes específicos del núcleo. Aunque la detección de ANA es específica a las estructuras nucleares, también se pueden observar los patrones citoplasmáticas asociadas con autoanticuerpos contra estructuras citoplasmáticas. En algunos casos, varios autoanticuerpos pueden estar presentes en una muestra, y la imagen pueden aparecer como un patrón mixto. Hay otra, observado con menos frecuencia y, a menudo patrones específicos del ciclo celular que pueden ser detectados por el método IIF; más recientemente, una llamada densa patrón moteado fino con significado clínico especial ha sido descrita en algunos sueros ANA positiva. Homogénea Patrón Para identificar un patrón homogéneo, escanee el bien e identificar mitótico o divisoriacélulas. La cromatina condensada de las células mitóticas (Figura 2, flecha naranja) exhibe fluorescencia sólido, uniforme que a menudo es más pronunciada que en la célula en reposo nuclei.In el patrón homogéneo, la exposición uniforme de las células en reposo, la fluorescencia difusa de todo el núcleo (Figura 2, flecha blanca). Este patrón característico es a menudo el resultado de los anticuerpos anti-dsDNA 10. Patrón moteado En el patrón moteado grueso, las células mitóticas muestran ninguna tinción de las regiones cromosómicas condensadas (Figura 3, flecha naranja). Las células en reposo exhiben fluorescencia granular a través de todo el núcleo. El moteado nuclear puede ser definido como grueso o fino. El patrón moteado grueso es a menudo el resultado de anti-Sm y anti-RNP 11. En el patrón moteado fino, las células en reposo muestran un moteado fino o difusa a través de los núcleos, por lo general en uniforme dISTRIBUCIÓN (Figura 4, flecha blanca). El patrón moteado fino es a menudo el resultado de la lucha contra SSAand anti-SSB 12. Dense Pattern Fine manchada Ahora se reconoce que el denso patrón moteado fino (DFS) es común en las pruebas de rutina, y hasta un 12% de las muestras son positivas para autoanticuerpos anti-DFS70. Sin embargo, estos autoanticuerpos, cuando se encuentran en forma aislada, no se asocian con enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas 4 -6. Estos anticuerpos son frecuentes en las personas y los pacientes portadores de enfermedades no relacionadas con la ADRS 6 sanas. Las pruebas de confirmación para los anticuerpos anti-DFS70 puede ayudar a reducir el reflejo de las pruebas innecesarias, ofrecen un considerable ahorro de costes, y calmar la ansiedad del paciente. Dado el patrón de DFS es difícil de identificar y la positividad de ANA puede causar ansiedad a los pacientes y médicos, es muy recomendable realizar una prueba de confirmación al cabo de identificación<html> ficar un patrón sugestivo de anticuerpos anti-DFS70 para aclarar el significado clínico de ANA positivty 5,6. En este modelo, las células mitóticas (Figura 5, naranja de flecha) muestran tinción positiva moteada de la cromatina metafase, mientras descansa núcleos de las células (Figura 5, flecha blanca) exhiben manchas finas uniformemente distribuidas por todo el núcleo. Patrón Centrómero Para identificar el patrón centrómero, mira los pozos e identificar mitótico o células en división. En células mitóticas (Figura 6, naranja de flecha), estos se convierten en manchas aisladas estrechamente asociados en lo que a menudo se describe como un &quot;bar metafase&quot;. En el patrón de centrómero, células en reposo (Figura 6, flecha blanca) muestran aproximadamente 40-60 manchas discretas distribuidas a lo largo de los núcleos. El patrón centrómero es el resultado de anti-CENP A, B, C anticuerpos 13. paso &quot;&gt; Nucleolar Patrón Algunos patrones nucleolar se asocian con la tinción citoplásmica difusa en las células mitóticas (Figura 7, flecha naranja) y la región cromosómica negativo, mientras que otros patrones nucleolear muestran tinción positiva de la región cromosómica. El patrón nucleolar se asocia con la tinción homogénea o moteado de los nucleolos (figura 7, flecha blanca), junto con moteado débil o tinción homogénea de la nucleoplasma. Estos patrones están asociados con anti-ARN polimerasa III, anti-fibrilarina, anti-Th/To y anti-PM/Scl anticuerpos 14,15. Modelo de punto Nuclear El modelo de punto nuclear se asocia con células mitóticas en metafase negativos (Figura 8, naranja de flecha) y con pocas manchas discretas en los núcleos de las células en reposo (Figura 8, flecha blanca). Este patrón característico es a menudo el resultado de la sp-100, PML, o p80 autoanticuerpos colin. Estos anticuerpos son como<html> asociadas con la cirrosis biliar primaria y la hepatitis autoinmune 16. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . Figura 1 Control negativo (izquierda): Las células muestran bajo nivel de fluorescencia no específica, pero sin tinción nuclear específico de control positivo (derecha):. Las células muestran fluorescencia nuclear de manzana verde. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Patrón homogéneo. Células mitóticas (orangearrow) muestran fluorescencia sólido. Las células en reposo muestran incluso, la tinción difusa (whitearrow). &quot;Width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 3. Gruesa moteado patrón. Células mitóticas (flecha naranja) muestran tinción negativa. Las células en reposo muestran una mancha moteado distinta (flecha blanca). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Patrón moteado fino. Células mitóticas (flecha naranja) muestran tinción negativa. Las células en reposo muestran una tinción moteada fina distinta (flecha blanca). <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Patrón denso fino moteado. Células mitóticas (flecha naranja) muestran una tinción sólida granular fino. Las células en reposo muestran un muy fino, mancha moteado difuso (whitearrow). Figura 6. Patrón centrómero. Células mitóticas (orangearrow) Mostrar uniforme, manchas aisladas. Descansar células (whitearrow) muestra 40-60 manchas aisladas por núcleo celular. <img alt="La figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Patrón nucleolar. Células mitóticas (orangearrow) aparecen como grandes grupos de tinción granular. Descansar celular nucleishows fluorescencia en los nucleolos (whitearrow). <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8. Patrón de puntos Nuclear. Células mitóticas (orangearrow) parece negativo. Las células en reposo muestran algunos DISCRmotas ete en el núcleo (whitearrow). Además, el patrón de puntos nucelar pueden coexistir con tinción citoplásmica asociada con autoanticuerpos a antígenos mitocondriales (flecha roja).

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Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFI) se han utilizado tradicionalmente para la detección de anticuerpos antinucleares (ANA) en el suero humano. La presencia de estos anticuerpos puede ayudar en el diagnóstico de enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas (ADRS). Este protocolo se muestra cómo realizar efectivamente la técnica de IFI para detectar con precisión estos autoanticuerpos.

Antinuclear Anticuerpo de detección sistemática mediante células Hep-2

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

La disección en vivo de Drosophila Los embriones: métodos simplificados para la detección colecciones mutantes tinción con anticuerpos

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Investigación

Biología

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISIÓN esiRNA sobre el cribado del ARNi en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISIÓN combinados de detección del shRNA biblioteca en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

La conversión de un ELISA de captura para un ensayo de Luminex xMAP utilizando un anticuerpo Multiplex Método de detección

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Tinción de anticuerpos en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso de &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificación de los pares quinasa-sustrato Usando selección de alto rendimiento


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multienzimático de detección sistemática mediante un sistema de cribado genético de la enzima de alto rendimiento

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...