Name: high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

نشكر الدكتور إيف ل جانين لتعليقاته واقتراحات مثمرة. نود أن نشكر سمو جاد للتشيك / رن وC. Combredet لها الدعم التقني. وأيد هذا العمل من قبل معهد باستور والمركز الوطني للبحوث العلميه (CNRS)، والمعهد الوطني للسانتيه إت دي لا بحوث MEDICALE (INSERM)، ومعهد كارنو - باستور علل Infectieuses (STING برنامج لبوف وHM- L)، والوكالة الوطنية صب لا بحوث (ANR-RPIB، STING برنامج 2.0 إلى بوف)، و &quot;CONSEIL الجهوي كوت إيل دو فرانس&quot; (مشروع المكتبة الكيميائية والمنح رقم 06-222 I / R وأنا 09-1739 / R إلى HM-L). وأيد العمل على CHIKV / رن من قبل ArbOAS مشروع (منحة ANR-2010-INTB 1601-1602).

1. إعداد 96 جيدا لوحات مركبات مع ابنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحات الأم 96 جيدا تحتوي على 10 ملي الحلول الأسهم من المركبات الكيميائية في DMSO من -20 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة. تمييع المركبات 5X في DMSO المتوسطة للحصول على لوحات التخفيف 96 جيد?...

<ol>
	<li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+drugs+in+current+clinical+use.">Antiviral drugs in current clinical use.</a> J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).</li><li>Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervention+strategies+for+emerging+viruses:+use+of+antivirals.">Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals.</a> Curr Opin Virol. , (2013).</li><li>Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+to+inhibit+the+replication+of+RNA+viruses.">Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses.</a> Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).</li><li>Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predominant+mechanism+by+which+ribavirin+exerts+its+antiviral+activity+in+vitro+against+flaviviruses+and+paramyxoviruses+is+mediated+by+inhibition+of+IMP+dehydrogenase.">The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase.</a> J Virol. 79, 1943-1947 (2005).</li><li>Wang, B. X., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+viruses+and+interferons.">The yin and yang of viruses and interferons.</a> Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).</li><li>Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+advances+in+the+treatment+and+prevention+of+respiratory+syncytial+virus.">Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus.</a> Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).</li><li>Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+and+the+host+response+to+viral+infection.">Systems biology and the host response to viral infection.</a> Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).</li><li>Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Approaches+towards+the+Development+of+Host-Directed+Antiviral+Therapeutics.">Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics.</a> Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).</li><li>Connolly, D. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+Toll-like+receptor+targeted+therapeutics.">New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2012).</li><li>Thakur, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+activators+of+RNase+L+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).</li><li>Shoji-Kawata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+therapeutic+autophagy-inducing+peptide.">Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide.</a> Nature. 494, 201-206 (2013).</li><li>Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+analyst's+couch:+TLR-targeted+therapeutics.">From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).</li><li>Bonavia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+broad-spectrum+antiviral+compounds+and+assessment+of+the+druggability+of+their+target+for+efficacy+against+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).</li><li>Rider, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+therapeutics.">Broad-spectrum antiviral therapeutics.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Krumm, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+host-directed+small-molecule+inhibitors+of+myxovirus+RNA-dependent+RNA-polymerases.">Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).</li><li>Harvey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK983:+a+novel+compound+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity.</a> Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).</li><li>Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+high-throughput+screening+to+quantify+antiviral+activity+against+viruses+that+induce+limited+CPE.">A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE.</a> J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Panchal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+high-content+imaging+assays+for+lethal+viral+pathogens.">Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens.</a> J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).</li><li>Pohjala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+alphavirus+entry+and+replication+identified+with+a+stable+Chikungunya+replicon+cell+line+and+virus-based+assays.">Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening.">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).</li><li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology.">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem Biol. 17, 646-657 (2010).</li><li>Komarova, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+virus-host+interactions+in+an+infectious+context+using+recombinant+viruses.">Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses.</a> Mol Cell Proteomics. , (2011).</li><li>Henrik Gad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E2-E166K+substitution+restores+Chikungunya+virus+growth+in+OAS3+expressing+cells+by+acting+on+viral+entry.">The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry.</a> Virology. 434, 27-37 (2012).</li><li>Wang, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dengue+virus+through+suppression+of+host+pyrimidine+biosynthesis.">Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis.</a> J Virol. 85, 6548-6556 (2011).</li><li>Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D282,+a+non-nucleoside+inhibitor+of+influenza+virus+infection+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Qing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dengue+virus+resistance+to+brequinar+in+cell+culture.">Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).</li><li>Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+dihydroorotate+dehydrogenases+and+their+inhibitors+and+uses.">On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses.</a> J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).</li><li>Yoon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening-based+identification+of+paramyxovirus+inhibitors.">High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors.</a> J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).</li><li>Mar&#233;chal, E., Roy, S., Lafanech&#232;re, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , (2011).</li><li>Gentzsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+complete+life+cycle+screen+for+identification+of+small+molecules+with+pro-+or+antiviral+activity.">Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity.</a> Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).</li><li>Caignard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V+protein+of+Tioman+virus+is+incapable+of+blocking+type+I+interferon+signaling+in+human+cells.">The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li></ol>

ويهدف خط أنابيب الفحص وصفها هنا في اختيار مركبات مع لمحة مناسبة باسم مثبطات واسعة الطيف من فيروسات الحمض النووي الريبي. ، وسجل أي تثبيط MV تكرار متفوقة على 75٪، و 40 مركبات (0.4٪) إيجابية عندما تم فحص مكتبة من 10،000 مركبات مع هذا البروتوكول وطبقت معايير التصفية المذكور?...

فيروسات الحمض النووي الريبي هي المسؤولة عن مجموعة كبيرة ومتنوعة من الإصابات البشرية، ويكون لها تأثير كبير على السكان في جميع أنحاء العالم سواء من حيث الصحة العامة والتكلفة الاقتصادية. وقد تم تطوير لقاحات فعالة ضد العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي الإنسان، وتستخدم على نطاق واسع كعلاج وقائي. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص حاد في الأدوية العلاجية ضد عدوى فيروس الحمض النووي الريبي. في الواقع، لقاحات فعالة ليست متاحة ضد مسببات الأمراض البشرية الرئيسية، مثل فيروس حمى الضنك وفيروس التهاب الكبد C أو الجهاز التنفسي المخلوي الفيروس الإنسان (hRSV). الى جانب ذلك، فيروسات الحمض النووي الريبي هي المسؤولة عن غالبية الأمراض المستجدة، والتي تزايدت وتيرتها بسبب البورصات العالمية وتأثير الإنسان على النظم الايكولوجية. ضد هذا التهديد التي تمثل فيروسات الحمض النووي الريبي، ترسانة العلاجية لدينا محدودة للغاية وغير فعالة نسبيا 1-3. وتقوم العلاجات الحالية أساسا على نوع المؤتلف أنا إنترفيرون (الإنترفيرون α / β) لتحفيز المناعة الفطرية،أو إدارة ريبافيرين. على الرغم من أن طريقة عمل هذا ريبونوكليوزيد التناظرية مثيرة للجدل ويعتمد على آليات مختلفة ربما، وتثبيط IMPDH الخلوية (إينوزين أحادي هيدروجين)، والذي يستنزف حمامات GTP داخل الخلايا، أمر ضروري بشكل واضح 4. ريبافيرين، بالاشتراك مع مضاد للفيروسات الإنترفيرون α، هو العلاج الرئيسي ضد فيروس التهاب الكبد الوبائي C. ومع ذلك، والعلاج الإنترفيرون α / β وريبافيرين هي فعالية فقيرة نسبيا في الجسم الحي ضد معظم الفيروسات الحمض النووي الريبي لأنها حادة كفاءة الإنترفيرون α / β يشير من خلال التعبير عن عوامل الفوعة 5 وغالبا ما يفلتون من ريبافيرين 3. وأضاف هذا إلى حقيقة أن العلاج ريبافيرين يثير قضايا هامة السمية، على الرغم من أنه تمت الموافقة مؤخرا ضد مرض hRSV شديدة مع فوائد مثيرة للجدل 6. في الآونة الأخيرة، وقد تم تسويق بعض العلاجات الفيروس محددة، ولا سيما ضد فيروس الانفلونزا مع س التنميةو مثبطات النورامينيداز 3. ومع ذلك، فإن التنوع الكبير وظهور دائم للفيروسات الحمض النووي الريبي يحول دون تطوير علاجات محددة ضد كل واحد منهم في مستقبل قريب نسبيا. تماما، وهذا يؤكد الحاجة إلى استراتيجيات فعالة لتحديد وتطوير جزيئات مضادة للفيروسات قويا في المستقبل القريب. فمن تافهة القول بأن المانع واسع الطيف فعال ضد فريق كبير من فيروسات الحمض النووي الريبي من شأنه أن يحل هذه المشكلة. على الرغم من أن مثل هذا الجزيء لا يزال حلم عالم الفيروسات، وفهم أفضل لدينا من آليات الدفاع الخلوية ونظام المناعة الفطرية تشير إلى أن بعض الاحتمالات موجودة 7،8. العديد من المختبرات الأكاديمية والصناعية يسعون الآن الجزيئات التي تحفز جوانب محددة من آليات الدفاع الخلوية أو المسارات الأيضية لفظة تكاثر الفيروس. على الرغم من أن هذه المركبات ربما تظهر آثار جانبية كبيرة، وعلاجات ضد الالتهابات الفيروسية الحادة تكون الادارىإد لفترة قصيرة نسبيا، مما يجعلها مقبولة على الرغم من بعض السمية المحتملة على المدى الطويل. وقد وضعت استراتيجيات مختلفة لتحديد مثل هذه واسعة الطيف الجزيئات المضادة للفيروسات. تهدف بعض البرامج البحثية في إيجاد الجزيئات التي تستهدف الدفاع أو التمثيل الغذائي مسارات محددة. وهذا يشمل، على سبيل المثال، المستقبلات الاعتراف الممرض للحصول المضادة للفيروسات التعبير الجيني 9 وتفعيل العوامل المضادة للفيروسات مثل RNaseL 10، والآلات الالتهام الذاتي لتعزيز تدهور الفيروس 11، والتوليف نوكليوزيد مسارات 12،13، أو شلالات أفكارك لترسيب موت الخلايا المصابة بالفيروسات 14. وقد وضعت مجموعات أخرى شاشات المظهرية التي لا تستهدف المستندة 13،15-17. في هذه الحالة، يتم تحديد الجزيئات المضادة للفيروسات ببساطة عن طريق قدرتها على منع تكاثر الفيروس في نظام الهاتف الخلوي معين. الافتراض العام هو أن مركب تثبيط 2-3 فيروسات الحمض النووي الريبي لا علاقة لها سيكون له الشخصى مناسبة ل-SP واسعةectrum جزيء مضاد للفيروسات. يتم تحديد طريقة عمل مركبات ضرب المحدد مع هذا النهج التجريبية فقط في المرة الثانية، وفي نهاية المطاف، قد يؤدي إلى تحديد أهداف الخلوية رواية لمضادات الفيروسات. ومن المثير للاهتمام، وقد أظهرت تحليل بأثر رجعي من الأدوية الجديدة التي وافقت عليها إدارة الغذاء والدواء الأمريكية بين عامي 1999 و 2008 أنه في عام، مثل هذه الفحوصات المظهرية تميل إلى أداء أفضل من النهج القائم على الهدف لاكتشاف أول في فئة المخدرات جزيء صغير 18 . عادة ما يتم تحديده تكاثر الفيروس في المقايسات خلية مقرها الإنتاجية العالية من الفيروس آثار الاعتلال الخلوي. والخلايا المصابة والمثقف في 96 - أو لوحات 384 جيدا في وجود مركبات اخضعت للاختبار. بعد بضعة أيام، يتم إصلاح الطبقات الخلوية وملطخة الأصباغ مثل الكريستال البنفسجي. أخيرا، يتم تحديد الامتصاصية مع تحديد قارئ لوحة ومركبات تثبيط تكاثر الفيروس عن طريق قدرتها على الحفاظ على الطبقات الخلوية جيئة وذهاباتأثير الاعتلال الخلوي الناجم عن الفيروس م. بدلا من ذلك، يتم تقييم آثار الاعتلال الخلوي بوساطة فيروسي باستخدام فحوصات سلامة قياسية مثل تخفيض MTS. هذه القياسات ليست لين العريكة للغاية وفعالة من حيث التكلفة، ولكن تعاني من القيود الرئيسية الثلاثة. الأولى، فإنها تتطلب مجموعة خلايا الفيروس حيث تكاثر الفيروس هو الاعتلال الخلوي في أيام قليلة فقط ولكن هذا ليس ممكنا دائما، وبالتالي الدعوة إلى النهج البديلة 19. الثانية، فهي الكمي سيئة لأنها تستند إلى مقياس غير مباشر من تكاثر الفيروس. أخيرا، ومركبات سامة يمكن سجل الزيارات كما إيجابية، وبالتالي يجب القضاء مع شاشة العداد قياس الجدوى الخلوية. للتغلب على بعض هذه العقبات، قد تم تصميمها من الفيروسات أو المؤتلف replicons بواسطة الوراثة العكسية للتعبير عن البروتينات المراسل، مثل EGFP أو luciferase المراسل، من وحدة النسخ إضافية أو في الإطار مع جينات البروتين الفيروسي (أمثلة قليلة هي 20-23). عند تكرار هذه الفيروسات، مراسل الأسبوعيةويتم إنتاج oteins جنبا إلى جنب مع البروتينات الفيروسية نفسها. وهذا يوفر مقايسة الكمية جدا لقياس تكاثر الفيروس وتقييم النشاط المثبطة الجزيئات مرشح. هذا صحيح بصفة خاصة للبحث عن الفيروسات المؤتلف معربا عن luciferase المراسل (أو الإنزيمات الأخرى قادرة على تلألؤ بيولوجي) لأن هذا النظام مراسل المعروضات مجموعة واسعة ديناميكية مع حساسية عالية ويكاد لا توجد خلفية هذا. وعلاوة على ذلك، لا يوجد أي مصدر للضوء الإثارة، وبالتالي منع التداخل مع مضان مجمع 24. هنا، لدينا بروتوكول الإنتاجية العالية من التفصيل لفحص المكتبات الكيميائية لمثبطات واسعة الطيف من فيروسات الحمض النووي الريبي. يتم اختبار المركبات الأولى على الخلايا البشرية المصابة بفيروس الحصبة المؤتلف (MV) معربا عن يراعة luciferase المراسل 25 (rMV2/Luc، الشكل 1، الشاشة الرئيسية). MV ينتمي إلى Mononegavirales النظام، وغالبا ما تعتبر عضوا تنميط فيروس RNA سلبي حبلاوفاق. على هذا النحو، يتم استخدام MV الجينوم كقالب من قبل البلمرة الفيروسية لتجميع جزيئات مرنا ترميز للبروتينات الفيروسية. في سلالة MV المؤتلف دعا rMV2/Luc، وأعرب عن التعبير luciferase المراسل من وحدة النسخ الإضافية تدرج بين P والجينات M (الشكل 2A). في موازاة ذلك، يتم اختبار المركبات السمية على الخلايا البشرية باستخدام كاشف القائم على luciferase المراسل التجارية التي يقيم، من خلال القياس الكمي ATP، وعدد من خلايا نشطة عملية الأيض في الثقافة (الشكل 1، الشاشة الرئيسية). المكتبات الكيميائية بالكامل يمكن فرزهم بسهولة مع هذه المقايسات اثنين من أجل تحديد المركبات التي ليست سامة ومنع بكفاءة MV النسخ المتماثل. ثم، يتم اختبارها إصابات لتثبيط الاستجابة للجرعة من MV النسخ المتماثل، وعدم وجود سمية فضلا عن قدرتها على إضعاف الفيروس شيكونغونيا (CHIKV) التكرار (الشكل 1، وشاشة ثانوية). CHIKV هو عضو في عائلة الفيروسات الطخائية والجينوم هو أبositive منفردة الجديلة جزيء الحمض النووي الريبي. على هذا النحو، فمن لا علاقة لها تماما لالحصبة ومركبات تثبيط كلا MV وCHIKV تقف فرصة كبيرة لمنع لوحة كبيرة من فيروسات الحمض النووي الريبي. يتم تحويل البروتينات ابنيوي CHIKV مباشرة من الجينوم الفيروسي، في حين يتم ترميز البروتينات الهيكلية التي كتبها النسخ والترجمة من جزيء الرنا subgenomic. ويستند لدينا في المختبر تكرار الفحص لCHIKV على سلالة المؤتلف دعا CHIKV / رن، الذي يعبر عن Renilla انزيم luciferase المراسل كجزء المشقوق من polyprotein ابنيوي من خلال إدخال الجين المراسل بين nsP3 وتسلسل nsP4 26 (الشكل 2B). مقياس Renilla luciferase النشاط يسمح للرصد تكاثر الفيروس في مرحلة مبكرة من دورة حياة CHIKV. وقد استخدم هذا البروتوكول الإنتاجية العالية لتحديد المركبات بسرعة مع لمحة مناسبة لمضادات الفيروسات واسع الطيف في مكتبة تجارية من 10،000 molecالمخصب ules للتنوع الكيميائية. مركبات كانوا يتبعون أساسا حكم يبينسكي من خمسة، مع الأوزان الجزيئية تتراوح 250-600 دالتون، وتسجيل القيم D أقل من 5. وكان معظم هذه الجزيئات كيانات كيميائية جديدة غير متوفرة في المكتبات التجارية الأخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

فيروسات الحمض النووي الريبي هي المسؤولة عن الأمراض التي تصيب الإنسان الرئيسية مثل الانفلونزا والتهاب الشعب الهوائية وحمى الضنك والتهاب الكبد C أو الحصبة. كما أنها تمثل تهديدا الناشئة بسبب زيادة التبادلات في جميع أنحاء العالم والبشر اختراق النظم الإيكولوجية أكثر وأكثر طبيعية. وخير مثال على مثل هذا الوضع الناشئ هو أوبئة فيروس شيكونغونيا من 2005-2006 في المحيط الهندي. تقدمات الأخيرة في فهمنا للمسارات الخلوية السيطرة على تكاثر الفيروس تشير إلى أن المركبات التي تستهدف وظائف الخلية المضيفة، وليس الفيروس نفسه، يمكن أن تمنع لوحة كبيرة من فيروسات الحمض النووي الريبي. وقد تم تحديد بعض المركبات المضادة للفيروسات واسع الطيف مع مضيفه المقايسات الموجهة المستهدفة. ومع ذلك، وقياس تثبيط تكاثر الفيروس في مزارع الخلايا باستخدام الحد من آثار الاعتلال الخلوي بمثابة قراءات لا يزال يمثل استراتيجية الفحص قصوى. وقد مثل شاشات الوظيفية تحسنت كثيرا من خلال تطوير فيروسات المؤتلف معربا عن مراسل الانزيمات كاليفورنياpable من تلألؤ بيولوجي مثل luciferase المراسل. في هذا التقرير، ونحن من التفصيل خط أنابيب الفرز الفائق الإنتاجية، والذي يجمع بين الحصبة المؤتلف والفيروسات شكونغنا مع المقايسات الجدوى الخلوية، لتحديد المركبات مع واسعة الطيف الشخصي المضادة للفيروسات.

خط الأنابيب هذا الفحص تعتمد أولا على اختيار المركبات التي تمنع تكرارها وMV لا تظهر أي سمية الخلوية كبيرة (الشكل 1، الشاشة الرئيسية). فإنه يستفيد من فحوصات على أساس luciferase المراسل لتحديد السمية الخلوية وتثبيط تكاثر الفيروس. جميع الخطوات pipetting لاقتناء والبيانات ...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

في فحوصات المختبر لقياس تكاثر الفيروس قد تحسنت إلى حد كبير من خلال تطوير فيروسات الحمض النووي الريبي المؤتلف معربا عن luciferase المراسل أو الإنزيمات الأخرى قادرة على تلألؤ بيولوجي. نحن هنا من التفصيل خط أنابيب الفرز الفائق الإنتاجية التي تجمع بين هذه السلالات المؤتلف من الحصبة والفيروسات شكونغنا لعزل الأدوية المضادة للفيروسات واسع الطيف من المكتبات الكيميائية.

الإنتاجية العالية للفحص واسع الطيف الكيميائية مثبطات الحمض النووي الريبي الفيروسات

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

الفحص السريع للفيروس نقص المناعة البشرية والناسخ العكسي مثبطات Integrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (NAME) الفحص يسمح للتحديد السريع لHIV-1 قفيصة منواة مثبطات

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

بكتيريا الاصطناعية الكروموسومات: أداة علم الجينوم وظيفية لدراسة الفيروسات RNA إيجابي حبلا

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

فحوصات القائم على الفحص المجهري لفحص عالية الإنتاجية من العوامل المضيفة المعنية في<em&gt; البروسيلا</em&gt; إصابة خلايا هيلا

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا<em&gt; المتفطرة السلية</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Cre-لوكس الفائق تنشيط الإنزيم الانصهار الغشاء الفيروسي التعرف على مثبطات للانصهار الغشاء الفيروسي فيروس نقص المناعة البشرية-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...