Name: visualization of atp synthase dimers in mitochondria by electron cryo-tomography
Uploaded: 2014-09-14T14:00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography at JoVE.com

इस काम के मैक्स प्लैंक सोसायटी (KMD, बीडी, AWM, टीबी, TBB, DJM, और विकेटकीपर), ड्यूश Forschungsgemeinschaft (विकेटकीपर) और एक postdoctoral EMBO दीर्घकालिक द्वारा वित्त पोषित उत्कृष्टता फ्रैंकफर्ट &quot;macromolecular परिसर&quot; के क्लस्टर द्वारा समर्थित किया गया फैलोशिप (VAMG).

     

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल और माइटोकॉन्ड्रिया की subtomogram औसतन एट क्रायो के लिए एक परिचय प्रदान करता है, लेकिन अनिवार्य रूप से एक ही प्रक्रिया किसी भी अन्य सेल कम्पार्टमेंट या झिल्ली के लिए लागू किया जा सकता है. सबसे अच्छा संभव डेटा प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण कदम नमूना तैयार करने, डुबकी जमने की प्रक्रिया और डाटा अधिग्रहण रणनीति है. सफलता के लिए महत्वपूर्ण है जो नमूना गुणवत्ता, अच्छी छवि के विपरीत के लिए सर्वोपरि महत्व का है, जो उपयुक्त बर्फ की मोटाई, यह सुनिश्चित करने के लिए एक अनुकूलित ठंड प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है. इष्टतम डाटा अधिग्रहण रणनीति साधन और नमूना पर निर्भर करता है. अनुकूलित किया जाना पैरामीटर छवि प्रति इलेक्ट्रॉन खुराक, झुकाव योजना और defocus शामिल हैं. एक अच्छा नमूना का एक अच्छा रण हासिल सब आगे की प्रक्रिया आसान कदम और एक संतोषजनक अंत परिणाम सुनिश्चित करता है. क्रायो एट subtomogram औसत और परमाणु मॉडल फिटिंग के साथ संयुक्त प्रोटीन परिसरों वीं में व्यवस्थित कर रहे हैं कि कैसे की जानकारी प्रदान करता हैEIR देशी सेलुलर वातावरण. तकनीक ऐसी सांस की श्रृंखला supercomplexes (1.7 एमडीए), एटीपी synthase dimers (2x500 केडीए), या परमाणु ताकना जटिल (~ 120 एमडीए) 8, 9, 17 के रूप में बड़े झिल्ली प्रोटीन परिसरों की संरचना की जांच के लिए समान रूप से उपयुक्त है. डिमर पंक्तियों अलगाव में एक आवश्यक कदम है जो डिटर्जेंट निकासी, द्वारा बाधित कर रहे हैं क्योंकि पंक्तियों में एटीपी synthase dimers के संगठन, एक्स रे क्रिस्टलोग्राफी, एनएमआर या एकल कण क्रायो ईएम के रूप में उच्च संकल्प तकनीक से देखा नहीं जा सकता और झिल्ली प्रोटीन परिसरों की शुद्धि. cristae लकीरें साथ dimers की पंक्तियों में एटीपी synthase की व्यवस्था सभी प्रजातियों में माइटोकॉन्ड्रिया की एक सार्वभौमिक आयोजन सिद्धांत है. इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के प्रोटॉन पंप परिसरों, विशेष रूप से जटिल में मैं (NADH डिहाइड्रोजनेज), दोनों ओर पंक्तियों 8 की झिल्ली क्षेत्रों में स्थित हैं9. सांस की श्रृंखला के इस संगठन mitochondrial बायोइनरजेटिक्स पर गहरा प्रभाव पड़ता है. डिमर पंक्तियों के कारण डिमर विशेष प्रोटीन के अभाव के फार्म नहीं कर सकते, तो चित्रा 3 41 में दिखाया खमीर उत्परिवर्ती में मनाया के रूप में, सेल, अब पीढ़ी समय और कम सेलुलर फिटनेस दिखा रहे हैं. माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों में बढ़ती रुचि के साथ एक विस्तृत माइटोकॉन्ड्रियल फैटी और समारोह गवर्निंग आणविक आधार को समझने के लिए सबसे ज्यादा महत्वपूर्ण है. इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी नैनोमीटर के पैमाने पर झिल्ली में प्रोटीन उच्च संकल्प तरीकों से निर्धारित संरचना, और वितरण और इन प्रोटीनों की व्यवस्था के बीच एक लिंक प्रदान करता है. इस क्रायो एट स्वास्थ्य और रोग में mitochondrial संरचना और समारोह को समझने के लिए एक अनिवार्य उपकरण बनाती है. क्रायो एट में आगे तकनीकी विकास और सुधार protei की स्थिति की पहचान करने के लिए प्रोटीन लेबलिंग रणनीति में शामिलmacromolecular परिसर में एन सब यूनिटों या कोशिकाओं में छोटे या कम विशिष्ट प्रोटीन का स्थान (&lt;0.5 एमडीए). इसके अलावा, एक कण विश्लेषण या पेचदार पुनर्निर्माण साथ subtomogram औसतन गठबंधन जो संकर ईएम प्रसंस्करण विधियों, हाल ही में प्रोटीन संरचनाओं निर्धारित किया है एक 42, 43 8 ~ करने के लिए. ये प्रसंस्करण विधियों वर्तमान में अच्छी तरह से बर्फ में अलग या पेचदार विधानसभाओं फार्म और वर्तमान में माइटोकॉन्ड्रिया की तरह भीड़ सेलुलर वातावरण के लिए लागू नहीं कर रहे हैं और झिल्ली cristae रहे हैं जो शुद्ध प्रोटीन, तक ही सीमित हैं. डेटा संग्रह के लिए, नई कंप्यूटिंग और हार्डवेयर उपकरणों, स्वचालित रण अधिग्रहण सक्षम छवि के विपरीत बढ़ाने के लिए और कुल आवश्यकता इलेक्ट्रॉन खुराक को कम करने के लिए विकसित किया जा रहा है. क्रायो एट में केवल बुनियादी सीमा इलेक्ट्रॉन बीम द्वारा नमूना के लिए विकिरण क्षति है. यह केवल बहुत कम इलेक्ट्रॉन खुराक गरीब संकेत टी, जिसके परिणामस्वरूप एक tomographic झुकाव श्रृंखला के प्रत्येक छवि को रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैओ शोर अंततः प्राप्त संकल्प है कि सीमा अनुपात. एक साल पहले की तुलना में कम जारी नए प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों, वर्तमान एकल कण क्रायो ईएम 44, 45 के क्षेत्र में क्रांति कर रहे हैं. इन नए डिटेक्टरों कम इलेक्ट्रॉन मात्रा में उच्च विपरीत और बेहतर समाधान प्रदान करते हैं. इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी के लिए, यह अत्यधिक विकिरण क्षति (एक सीसीडी छवि 5 प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर छवियों इलेक्ट्रॉन खुराक में बराबर है) के बारे में चिंताओं के बिना एकत्र किया जा सकता है छोटे कदम आकार या भी दोहरी अक्ष tomograms साथ कि झुकाव श्रृंखला का मतलब है. इन डिटेक्टरों द्वारा उत्पादित डेटा की विशाल मात्रा को पार करना होगा, जो डेटा को संभालने, प्रसंस्करण और भंडारण में उनकी खुद की चुनौतियों, बनाएँ. इसके अलावा, चरण विपरीत बढ़ाने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी में नियमित तौर पर इस्तेमाल उन लोगों के रूप में इसी तरह के सिद्धांतों पर काम जो चरण प्लेटें, वर्तमान ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 46, 4 के लिए विकसित किया जा रहा है7. इस tomograms ध्यान केंद्रित करने के लिए करीब एकत्र की है और इसलिए उच्च संकल्प पर, एक ही समय में कम संकल्प जबकि संरक्षण संरेखण और tomographic संस्करणों की व्याख्या के लिए आवश्यक सुविधाओं करने की अनुमति चाहिए. साथ में ले ली, इन तकनीकी विकास बहुत क्रायो ईटी ने संबोधित किया जा सकता है कि जैविक सवालों की सीमा का विस्तार होगा.

माइटोकॉन्ड्रिया कोशिका की बिजली घरों हैं. रासायनिक बंधन ऊर्जा में भीतरी mitochondrial झिल्ली भर में एक विद्युत प्रोटॉन ढाल परिवर्तित करके, mitochondrial एटीपी synthase सेलुलर प्रक्रियाओं है कि ड्राइव एटीपी की सबसे पैदा करता है. Mitochondrial ऊर्जा रूपांतरण के पीछे तंत्र को समझने के लिए, हम बगल में एटीपी synthase की संरचना निर्धारित करने के लिए, और यह व्यवस्था की है और भीतरी mitochondrial झिल्ली में वितरित किया जाता है कैसे पता लगाने की जरूरत है. पूरे परिसर 4 की mitochondrial एटीपी synthase घटकों 1-3 और कम संकल्प नक्शे के सबसे उच्च संकल्प संरचनाओं उपलब्ध हैं, यद्यपि यह झिल्ली में काम कर एंजाइम की संरचना और रचना की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है. भीतरी mitochondrial झिल्ली में एटीपी synthase के वितरण में व्यापक रूप से यादृच्छिक मान लिया, लेकिन 6 इस टी नहीं है संकेत दिया कि 5 और हमारे अपने प्रारंभिक परिणाम को खोजने के लिए एक प्रारंभिक किया गया हैवह मामला. इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के प्रोटॉन पंप या तो किनारे पर स्थित होना दिखाई देते हैं, जबकि बाद के हमारे समूह से अध्ययन और दूसरों 7, एटीपी synthase भीतरी mitochondrial झिल्ली cristae 8 से कसकर घुमावदार लकीरें साथ dimers की लंबी पंक्तियों में व्यवस्था की है कि पुष्टि की है पंक्तियों 9 की. यह व्यवस्था mitochondrial ऊर्जा रूपांतरण के तंत्र के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है. हम इस व्यवस्था का निर्धारण किया जाता है तकनीक इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी (क्रायो ईटी) है. क्रायो एट वर्तमान में आणविक प्रस्ताव पर कोशिकाओं, सेलुलर डिब्बों या organelles की सटीक तीन आयामी (3 डी) संस्करणों उद्धार कि एकमात्र तरीका है. झिल्ली अच्छा विपरीत के साथ दिखाई देते हैं और 3 डी tomographic मात्रा में पता लगाने के लिए आसान कर रहे हैं क्योंकि क्रायो एट, जैविक झिल्लियों में बड़े परिसरों के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है. अन्य तरीकों कोशिकाओं या organell की 3 डी संरचना का अध्ययन करने के लिएतों आणविक विस्तार प्रदान नहीं करते हैं. सुपर संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी 10, 11 स्थिति या एनएम के दसियों की एक परिशुद्धता के साथ ब्याज की प्रोटीन से जुड़े प्रकाश उत्सर्जक लेबल के बीच दूरी खुलासा में शानदार है, लेकिन यह भी कम संकल्प पर, प्रोटीन खुद की संरचना प्रकट नहीं करता . प्लास्टिक एम्बेडेड जैविक नमूने की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 13 को स्कैन करके धारावाहिक वर्गों 12 या ब्लॉक चेहरा इमेजिंग के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेलुलर मात्रा के कम संकल्प विचार प्रदान करते हैं लेकिन इसी तरह आणविक विस्तार प्रकट नहीं करते. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी 14 सिद्धांत में आणविक या यहां तक कि परमाणु संकल्प उद्धार, लेकिन केवल एक atomically फ्लैट, ठोस समर्थन पर वस्तुओं की सतह पर कर सकते हैं. अंत में, एक्स रे टोमोग्राफी 15 या मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर से तीव्र एक्स रे दालों के बिखरने 16 ऐसे मीटर की ऊंचाई पर पूरे कोशिकाओं या अंगों के रूप में बड़े, जटिल, aperiodic वस्तुओं की संरचना को प्रकट करने की संभावना नहीं हैनिकट भविष्य में olecular संकल्प. इस प्रकार वर्तमान में, नैनोमीटर प्रस्ताव पर कोशिकाओं या अंगों के 3D संरचना के अध्ययन के लिए एट क्रायो का कोई विकल्प नहीं है. क्रायो एट परमाणु ताकना जटिल 17, इन्फ्लूएंजा कील 18 परिसरों सहित झिल्ली जुड़े प्रोटीन विधानसभाओं की संरचना और रचना की जांच के लिए पसंद की विधि, और flagella मोटर प्रोटीन 22, 23 बल्कि पूरे बैक्टीरियल कोशिकाओं 19 का संगठन है कोशिकाओं 20-23 में एचआईवी जैसे रोगजनक वायरस की और प्रवेश. क्रायो एट एक्टिन तंतु 24 या axonemes 25 सहित filamentous प्रोटीन और सेल में उनकी बातचीत, दृश्यमान करने के लिए अमूल्य है. संकल्प दोहराया, नियमित रूप से सुविधाओं की subvolumes एकल कण छवि समर्थक द्वारा एक tomographic मात्रा से बाहर कटौती और औसत निकाला जाता है जिससे subtomogram, 26 के औसत से 2 एनएम या बेहतर करने के लिए बढ़ाया जा सकता हैcessing तकनीक. क्रायो एट एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (मंदिर) में अलग झुकाव कोण पर लिया एक पतली नमूना (&lt;250nm) के प्रक्षेपण छवियों की एक श्रृंखला का अधिग्रहण शामिल है. मामले से दृढ़ता से बातचीत जो इलेक्ट्रॉनों, एक बार से अधिक नहीं हुए हैं कि इतने नमूना पतली होना चाहिए. एकाधिक बिखरने की व्याख्या करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप छवियों कठिन बना देता है और इसके विपरीत कम कर देता है. चयनित नमूना क्षेत्र की छवियाँ एक दूसरे के सापेक्ष गठबंधन और नमूना की एक 3 डी मात्रा पैदा करने, एक उपयुक्त कंप्यूटर प्रोग्राम द्वारा एक 3 डी अंतरिक्ष में पेश कर रहे हैं. छवियों के संरेखण ठंड से पहले नमूने के साथ मिलाया जाता है जो सोने मापकला मार्करों, द्वारा सहायता प्राप्त है. आदर्श रूप में 10 या उससे अधिक समान रूप से वितरित मापकला मार्कर एक अच्छा संरेखण को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक छवि में मौजूद होना चाहिए. आणविक विस्तार का पालन करने के लिए, नमूने डुबकी जमी उनके देशी हाइड्रेटेड राज्य को बरकरार रखता है, जो तरल एटैन में हैं. तरल में ठंडएटैन इतनी जल्दी है (~ 5 ° 10 सी / सेकंड) पानी मणिभ लेकिन एक vitrified, कांच की तरह राज्य में रहता नहीं है कि 27. आइस क्रिस्टल गठन हर्जाना संवेदनशील जैविक संरचनाओं. जैविक नमूने विकिरण क्षति से पीड़ित के रूप में, नमूना बर्दाश्त कर सकते हैं बिखरने घटनाओं की कुल संख्या की एक सीमा होती है. छवियाँ इस प्रकार कम खुराक मोड में अर्जित कर रहे हैं: ब्याज की एक क्षेत्र 1 ई नीचे एक इलेक्ट्रॉन खुराक के साथ कम बढ़ाई (1,500X) में पहचाना जाता है - / एनएम 2 (खोज मोड). छवि तो ब्याज (फोकस मोड) के क्षेत्र से दूर, एक उच्च बढ़ाई केंद्रित है. एक छवि का अधिग्रहण किया है, केवल जब ब्याज के क्षेत्र में एक उच्च इलेक्ट्रॉन खुराक (जोखिम मोड) के साथ विकिरणित है. यहाँ, हम एक उदाहरण के रूप में आंतरिक mitochondrial झिल्ली में एटीपी synthase dimers का उपयोग, इकट्ठा करने और प्रक्रिया इलेक्ट्रॉन क्रायो tomograms करने का एक सिंहावलोकन प्रस्तुत करते हैं. निम्नलिखित प्रोटोकॉल क्रायो एट के लिए माइटोकॉन्ड्रिया तैयार करने के लिए कैसे का वर्णन करता है, कैसे स्थापित करने के लिएऔर एक विशिष्ट कुल इलेक्ट्रॉन खुराक, और कैसे ब्याज के क्षेत्र की एक 3 डी की मात्रा प्राप्त करने के लिए झुकाव श्रृंखला पर कार्रवाई करने के साथ एक झुकाव श्रृंखला इकट्ठा. प्रक्रिया का अवलोकन चित्रा 1 में सचित्र है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sucrose</td>
			<td style="width:235px;">ROTH</td>
			<td style="width:119px;">4621.2</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trehalose</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">HEPES</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Zymolase</td>
			<td style="width:235px;">biomol</td>
			<td style="width:119px;">Z1000.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Density gradient medium</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D1556 or P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Protein A gold</td>
			<td style="width:235px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">810.111</td>
			<td>10 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Ethane</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">P0502S02R0A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">I4150RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Consumables</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Filter paper</td>
			<td style="width:235px;">Whatman, GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">1004 090</td>
			<td>Nr 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tweezers</td>
			<td style="width:235px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">T506</td>
			<td>Non-magnetic, pattern #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">EM combined test grid</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">S142</td>
			<td>grapite and gold islands on holey carbon film</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Holey carbon grids</td>
			<td style="width:235px;">Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>R2/2 300 Cu mesh&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryo grid boxes</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">160-42</td>
			<td>Alternative home-made metal boxes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Potter</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender</td>
			<td style="width:235px;">Waring</td>
			<td style="width:119px;">8011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glass bead mill - bead beater</td>
			<td style="width:235px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:119px;">1107900-105</td>
			<td>Including 0.5 mm beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ball-bearing (Balch) homogeniser</td>
			<td style="width:235px;">isobiotec</td>
			<td style="width:119px;">H8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:235px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46915</td>
			<td>Sorvall RC6+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glow-discharge apparatus</td>
			<td style="width:235px;">Bal-Tec A.G.</td>
			<td style="width:119px;">CTA 010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Grid vitrification device</td>
			<td style="width:235px;">FEI, Gatan or Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Alternative home-made plunger</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:235px;">FEI or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Direct electron detector (CMOS)</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4k x 4k pixels, counted mode</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Charge coupled device</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Energy filter</td>
			<td style="width:235px;">Gatan or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Software</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram processing software</td>
			<td style="width:235px;">FEI, UCSF or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Subtomogram averaging software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, or University of Basel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Tomogram visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, FEI, or University of Utah</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">visualisation software plugin</td>
			<td style="width:235px;">Goethe university</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Structure visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UCSF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Numerical calculation software</td>
			<td style="width:235px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.mathworks.de/academia/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of atp synthase dimers in mitochondria by electron cryo-tomography

इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी ऐसे आणविक विस्तार में कोशिकाओं, organelles, झिल्ली पुटिकाओं, या वायरस के रूप में जैविक नमूने, के तीन आयामी संरचना visualizing में सक्षम संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक शक्तिशाली उपकरण है. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, जलीय नमूना तेजी से एक बंद करने वाली देशी, स्थिर हाइड्रेटेड राज्य में यह बरकरार रखता है जो तरल एटैन, में vitrified है. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में, झुकाव श्रृंखला 3 डी tomograms खंगाला रहे हैं जिसमें से तरल नाइट्रोजन तापमान, पर दर्ज की गई हैं. tomographic मात्रा का संकेत करने वाली शोर अनुपात स्वाभाविक रूप से कम है. पहचानने, आवर्ती सुविधाओं व्यक्ति subvolumes, बाहर कटौती गठबंधन और शोर को कम करने के लिए औसत निकाला जाता है जिसके द्वारा subtomogram औसत से बढ़ा रहे हैं. इस तरह, 3 डी प्राप्त किया जा सकता 2 एनएम या बेहतर के एक संकल्प के साथ नक्शे. 3 डी की मात्रा को उपलब्ध उच्च संकल्प संरचनाओं का एक फिट तो उनके पैतृक वातावरण में प्रोटीन परिसरों के परमाणु मॉडल का उत्पादन. यहाँ हम हम इलेक्ट्रॉन क्रायो tomograp उपयोग कैसे दिखानेहरियाणा माइटोकॉन्ड्रिया में बड़ी झिल्ली प्रोटीन परिसरों के बगल में संगठन का अध्ययन करने के लिए. हम जटिल मैं बेतरतीब ढंग पंक्तियों के दोनों तरफ झिल्ली क्षेत्रों में वितरित किया जाता है, जबकि एटीपी synthases, भीतरी झिल्ली cristae की अत्यधिक घुमावदार apices साथ dimers की पंक्तियों में संगठित कर रहे हैं. Subtomogram औसत से हम cristae झिल्ली के भीतर mitochondrial एटीपी synthase डिमर की एक संरचना प्राप्त की.

माइटोकॉन्ड्रिया के इलेक्ट्रॉन क्रायो tomograms स्पष्ट रूप से (चित्रा 2) organelle की 3 डी आकारिकी प्रकट करते हैं. एक tomographic मात्रा में झिल्लियों के मैनुअल विभाजन एक माइटोकांड्रिया में cristae की संरचना को दिखाता है. कुछ प्रोटीन घटकों की कमी है कि अलग खमीर पीटकर उपभेदों से माइटोकॉन्ड्रिया इमेजिंग द्वारा, cristae आकारिकी पर इन प्रोटीन के प्रभाव का आकलन करके कर सकते हैं. 3 एटीपी synthase सबयूनिट ई की कमी एक खमीर तनाव से एक माइटोकांड्रिया से पता चलता है. एटीपी synthase परिसर के इस घटक mitochondrial एटीपी synthase के dimerization के लिए आवश्यक है. इस तनाव से mitochondria (चित्रा 2) wildtype माइटोकॉन्ड्रिया के सामान्य तहदार cristae कमी और बजाय भीतरी झिल्ली डिब्बों की एक संख्या में होते हैं. इन डिब्बों cristae की या तो रहित हैं या छोटे गुब्बारे के आकार झिल्ली invaginations (चित्रा 3) के होते हैं. टॉम मेंograms इस मामले एटीपी synthase dimers में अच्छा इसके विपरीत, बड़े mitochondrial प्रोटीन परिसरों, साथ, आसानी से दिखाई दे रहे हैं (चित्रा 4, मूवी 1). (; मूवी 2 चित्रा 5) परिसरों की संरचनाओं subtomogram औसत से 2-3 एनएम संकल्प पर निर्धारित किया जा सकता है. (; मूवी 3 चित्रा 6) औसत मात्रा में झिल्ली में एक दूसरे के रिश्तेदार और अन्य प्रोटीन परिसरों को व्यक्तिगत परिसरों के संगठन का आकलन करने के क्रम में रण में वापस रखा जा सकता है. <img alt="चित्रा 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" /> इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी के चरणों दिखा 1 फ्लो चार्ट चित्रा. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a> Wildtype एस. Cerevisiae से एक माइटोकांड्रिया चित्रा 2 आकृति विज्ञान. एक wildtype एस के tomographic मात्रा के माध्यम से केन्द्रीय टुकड़ा cerevisiae माइटोकांड्रिया (बाएं) और इसी सतह प्रदान की गई मात्रा (दाएं). बाहरी झिल्ली की खंडों मात्रा ग्रे में दिखाया गया है और आंतरिक सीमा की मात्रा और हल्के नीले रंग में झिल्ली cristae है. डेविस एट अल 8 से अनुकूलित. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a> <img alt="चित्रा 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" /> एक एस से 3 माइटोकांड्रिया चित्रा. Cerevisiae तनाव के लिए आवश्यक एक सबयूनिट कमीएटीपी synthase dimerization. Tomographic मात्रा (बाएं) और एक एस से एक माइटोकांड्रिया की सतह प्रदान की गई मात्रा (दाएं) के साथ के माध्यम से टुकड़ा. एटीपी synthase dimerization के लिए आवश्यक प्रोटीन सबयूनिट ई कमी cerevisiae तनाव. चित्रा 2 के साथ तुलना में, उत्परिवर्ती तनाव से माइटोकांड्रिया wildtype माइटोकॉन्ड्रिया के सामान्य तहदार cristae का अभाव है. इसके बजाय, माइटोकांड्रिया कोई cristae या गुब्बारे के आकार का cristae या तो साथ कई भीतरी झिल्ली डिब्बों है. इस प्रकार इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी जीन विलोपन के कारण झिल्ली आकारिकी में परिवर्तन पर प्रकाश डाला गया. डेविस एट अल 8 से अनुकूलित. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a> <img alt="चित्रा 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" /> Figurकवक पी से ई 4 माइटोकांड्रिया anserina. filamentous कवक पी से एक माइटोकांड्रिया की tomographic मात्रा (बाएं) और (दाएं) साथ सतह प्रदान की मात्रा के माध्यम से टुकड़ा anserina. इस रण में, 10 एनएम कणों (पीले तीर) की पंक्तियों भीतरी झिल्ली cristae में अत्यधिक घुमावदार झिल्ली लकीरें ऊपर स्थित हैं (1 मूवी देखें). इन कणों subtomogram औसत से एटीपी synthase dimers के रूप में पहचान की गई. डेविस एट अल 9. से <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a> <img alt="चित्रा 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" /> Mitochondrial एटीपी synthase की चित्रा 5 संरचना और संगठन. साइड और एस से एक एटीपी synthase डिमर का इलेक्ट्रॉन घनत्व दिखा शीर्ष देखें ग<html> erevisiae सज्जित परमाणु मॉडल (बाएं) के साथ subtomogram औसत से निर्धारित रूप में. पंक्तियाँ (दाएं) में एटीपी synthase dimers के संगठन दिखा mitochondrial भीतरी झिल्ली पुटिका. आंकड़ा औसतन दौरान गणना निर्देशांक का उपयोग कर, झिल्ली पुटिका के खंडों मात्रा में एटीपी synthase डिमर की subtomogram औसत स्थिति से उत्पन्न किया गया था. डेविस एट अल 8 से अनुकूलित. परमाणु मॉडल: एफ 1 / रोटर अंगूठी [PDB: 2WPD] 39 (नीले और बैंगनी); संवेदनशील प्रदान प्रोटीन OSCP oligomycin [PDB: 2BO5] 40 (हरा); परिधीय डंठल टुकड़ा [PDB: 2CLY] से एन टर्मिनल अवशेषों के साथ 1 [PDB: 2WSS] 2 (पीले और लाल) (2 मूवी देखें). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a> <html> _upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg &quot;चौड़ाई =&quot; 500 &quot;/&gt; एक पी से 6 चित्रा पृथक शिखा पुटिका anserina माइटोकांड्रिया. स्लाइस पी से एक शिखा पुटिका के tomographic मात्रा (बाएं) और (दाएं) साथ सतह प्रदान की गई मात्रा से anserina. झिल्ली से फैलने वाला प्रोटीन घनत्व स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. subtomogram औसत से पहचान के रूप में पीले तीर द्वारा संकेत घनत्व, एटीपी synthase dimers हैं. ग्रीन तीर NADH डिहाइड्रोजनेज के रूप में एंटीबॉडी लेबलिंग से पहचान घनत्व को इंगित (1 जटिल; विवरण 9 देखने के लिए). प्रोटीन घनत्व का विभाजन (देखें पंक्तियों के दोनों तरफ झिल्ली क्षेत्रों में अत्यधिक घुमावदार cristae लकीरें साथ पंक्तियों के गठन (लाल और पीले) एटीपी synthase dimers और NADH डिहाइड्रोजनेज परिसरों (हरा) के साथ, cristae में उनके संगठन का पता चलता है मूवी 3). डेविस एट अल 9 से.28 / 51228fig7highres.jpg &quot;लक्ष्य =&quot; _blank &quot;&gt; बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें. एक पी की मूवी 1 इलेक्ट्रॉन क्रायो रण anserina माइटोकांड्रिया. फिल्म filamentous कवक पी से एक माइटोकांड्रिया का लिया एक tomographic मात्रा के माध्यम से लगातार स्लाइस से पता चलता है anserina. एटीपी synthase की पंक्तियां पीले तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं. सतह से गाया, खंडों मात्रा 3 डी cristae संरचना के संबंध में एटीपी synthase (पीले क्षेत्रों) के स्थान से पता चलता है. बाहरी झिल्ली, ग्रे; आंतरिक सीमा झिल्ली, पारदर्शी नीले; झिल्ली, अपारदर्शी नीले cristae. डेविस एट अल 9 से. यह भी 4 आंकड़ा देखें. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a> एस से mitochondrial एटीपी synthase डिमर की मूवी 2 Subtomogram औसत. सज्जित परमाणु मॉडल के साथ cerevisiae. औसत था121 subvolumes से गणना की. घनत्व तीन समोच्च स्तर पर प्रदर्शित किया जाता है: 1s - मेष, 2s - प्रकाश ग्रे और 3S - डार्क ग्रे. परमाणु मॉडल कल्पना में अनुक्रमिक फिट दिनचर्या का उपयोग घनत्व में लगाया गया. परमाणु मॉडल: एफ 1 / रोटर अंगूठी [PDB: 2WPD] 39 (नीले और बैंगनी); संवेदनशील प्रदान प्रोटीन OSCP oligomycin [PDB: 2BO5] 40 (हरा); परिधीय डंठल टुकड़ा [PDB: 2CLY] से एन टर्मिनल अवशेषों के साथ 1 [PDB: 2WSS]. 2 (पीले और लाल) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a> डेविस एट अल 8 से अनुकूलित. भी 5 आंकड़ा देखें. एक पी से मूवी 3 पृथक cristae पुटिका anserina माइटोकांड्रिया. के बाद एक स्लाइस tomographic मात्रा के माध्यम से खंडित सतह प्रदान की मात्रा द्वारा पीछा किया, दिखाया जाता है. Membran से फैलने वाला प्रोटीन घनत्वई स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. लाल और पीले घनत्व एटीपी synthase dimers हैं. ग्रीन घनत्व एंटीबॉडी लेबलिंग द्वारा निर्धारित NADH डिहाइड्रोजनेज (जटिल मैं) कर रहे हैं. डेविस एट अल 9 से. भी 6 आंकड़ा देखें. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a>

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Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

हम इकट्ठा और पूरे माइटोकॉन्ड्रिया की प्रक्रिया इलेक्ट्रॉन क्रायो tomograms करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. तकनीक देशी जैविक झिल्लियों में बड़ी झिल्ली प्रोटीन परिसरों की संरचना, समारोह, और संगठन में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.

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