Name: in vivo sirna transfection and gene knockdown in spinal cord via rapid noninvasive lumbar intrathecal injections in mice
Uploaded: 2014-03-22T14:00:00
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Tutte le procedure di utilizzo di animali erano in conformità con le linee guida etiche stabilite dal Consiglio di amministrazione locale (Regierungspräsidium Karlsruhe, Karlsruhe, Germania). 1. Preparazione di siRNA / PEI Complex La soluzione complesso siRNA / PEI viene preparato utilizzando le indicazioni del produttore come segue: <ol><li> Soluzione A: Diluire la quantità desiderata di siRNA con acqua sterile (se necessario) fino ad un quarto del volum...

<ol>
	<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).</li><li>Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+tactile+allodynia+following+intrathecal+puncture+in+mouse:+contributions+of+Toll-like+receptor+signaling.">Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling.</a> Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).</li><li>Goula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+intravenous+delivery+of+transgenes+to+mouse+lung.">Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung.</a> Gene Ther. , 1291-1295 (1998).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).</li><li>Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+modulation+of+wide+dynamic+range+neurons+in+the+lumbar+dorsal+horn+of+the+rat+by+spinally+administered+WIN55,212-2.">Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2.</a> Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).</li><li>Song, Z. H., Takemori, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+spinal+kappa+opioid+receptors+in+the+antinociception+produced+by+intrathecally+administered+corticotropin-releasing+factor+in+mice.">Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).</li><li>Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+cannabinoid+(CB1)-receptors+in+the+development+and+maintenance+of+opioid+tolerance.">Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance.</a> Neuroscience. , 1275-1288 (2007).</li><li>Yaksh, T. L., Rudy, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+catheterization+of+the+spinal+subarachnoid+space.">Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space.</a> Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).</li><li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain.">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. , 677-681 (2006).</li><li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+the+Cav3.2+T-type+calcium+channel+gene+in+sensory+neurons+demonstrates+its+major+role+in+nociception.">Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception.</a> EMBO J. 24, 315-324 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+dorsal+root+ganglia+by+intrathecal+injection:+effects+on+regeneration+of+peripheral+nerves.">Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves.</a> Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).</li><li>Wigdor, S., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+and+systemic+morphine-induced+antinociception+in+mice:+contribution+of+descending+serotonergic+and+noradrenergic+pathways.">Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).</li></ol>

Pertanto, la tecnica di iniezioni intratecale aghi sopra descritta è efficace, veloce, specificamente localizzate, e non distruttivo. Tecnicamente, l&#39;aspetto più critico di questa procedura è il punto di inserimento dell&#39;ago nella scanalatura. E &#39;fondamentale che questa procedura è fatta con le mani molto calma e pazienza. Come molte procedure chirurgiche, la formazione migliora la velocità di iniezione di successo. Questo è importante anche perché durante un esperimento reale, questa tecnica non forn...

Il midollo spinale è un centro molto importante in una varietà di processi biologici chiave e funzioni fisiologiche, tra cui l&#39;elaborazione e la trasmissione di dolorose (nocicettivi) ingressi 4-7. Sono state sviluppate varie tecniche sperimentali per facilitare modulazione farmacologica del midollo spinale, come impianto cronica di cateteri intratecali 8, microiniezione del midollo spinale, e intratecale ago di iniezione 9. Ogni tecnica ha i suoi vantaggi e svantaggi, e in funzione del paradigma esperimento una tecnica potrebbe essere più adatto rispetto agli altri. Considerando impianto cronica di cateteri intratecali è facilmente realizzabile in ratto, questo metodo è molto difficile nel topo, dato restrizioni di dimensione. Tasso di successo è molto bassa e deficit motori spesso si verificano a causa della presenza ingombrante di un catetere nello spazio subdurale fortemente confinato nel topo. Inoltre, la consegna a lungo termine di farmaci è resa a causa di frequenti coagulazionedi cronicamente impiantati cateteri. Infine, reazioni immunitarie sono comuni. Questi problemi possono essere aggirate utilizzando il metodo di iniezione intratecale acuta tramite un ago in assenza di un catetere preimplanted, che permette un facile e anatomicamente limitata applicazione di farmaci e reagenti per midolli spinali di topi. Questo metodo mantiene pienamente i vantaggi della somministrazione intratecale su altri percorsi di consegna sistemici (per esempio orale, endovenosa, intraperitoneale, ecc) come specificità di modulazione spinale, che permette dosaggi ridotti ed effetti collaterali limite, così come la capacità di fornire sostanze non fanno normalmente non attraversa la barriera ematoencefalica in quanto durante l&#39;iniezione intratecale, l&#39;ago viene inserito tra la dura madre e il midollo spinale. Importante, tuttavia, in confronto ad altri metodi di somministrazione intratecale, il metodo di iniezione dell&#39;ago intratecale è la meno invasiva, consentendo numerose applicazioni nelstesso animale senza causare notevoli danni ai tessuti o evocando reazione immunitaria a causa di impianto di materiale estraneo. Tuttavia, esso richiede competenze tecniche per una targeting preciso dell&#39;ago per permettere efficacia. Qui, dimostriamo visivamente il metodo per raggiungere un tasso ottimale di successo per specificamente rivolti midollo spinale lombare. Il sito di iniezione che viene scelto in questo esperimento è il solco tra L5 e L6 colonna vertebrato, vicino a dove termina il midollo spinale, per minimizzare la possibilità di danneggiare il dorso. Inoltre, dimostriamo l&#39;uso di questa tecnica per abbattere i geni nel midollo spinale con siRNA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1012">
	<colgroup>
		<col /> 
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:283px;">in vivo-jetPEI</td>
			<td style="width:255px;">Polyplus</td>
			<td style="width:288px;">201-10G</td>
			<td style="width:188px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">WAVE1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-36832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Control siRNA-A</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-&#223;-Tubulin III antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-WAVE1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast green dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane setup</td>
			<td>Dr&#228;ger L&#252;beck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaver</td>
			<td>Wella</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hamilton syringe Gastight 1702</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30G 1/2, 0,3 * 13mm Needle</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope Leica MS5</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">WAVE1 forward primer for qRT-PCR</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>cacagagcctcaggacagg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">WAVE1 reversed primer for qRT-PCR</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>cttttcaccaacggcatctt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FastStart Essential DNA Green Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6402712001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo sirna transfection and gene knockdown in spinal cord via rapid noninvasive lumbar intrathecal injections in mice

Questo rapporto descrive una guida step-by-step per la tecnica di iniezioni ago intratecale acuti in maniera non invasiva, cioè indipendente catetere impianto. La limitazione tecnica di questa tecnica chirurgica consiste nella finezza delle mani. L&#39;iniezione è rapida, soprattutto per un sperimentatore addestrato, e poiché rottura dei tessuti con questa tecnica è minima, iniezioni ripetute sono possibili; reazione peraltro immune agli strumenti stranieri (. Es. catetere) non si verifica, dando così una migliore e più specifica leggere di modulazione del midollo spinale. Dato che l&#39;applicazione della sostanza è in gran parte limitata alla regione bersaglio del midollo spinale, farmaci non devono essere applicati in grandi dosi, e soprattutto effetti indesiderati su altri tessuti, come osservato con una consegna sistematica, potrebbero essere aggirate 1, 2. Inoltre, si combinano questa tecnica con transfezione in vivo di acido nucleico con l&#39;aiuto di polyethylenimine (PEI) reagente 3, che prevede la versatilità tremenda per studiare le funzioni spinali via la consegna di agenti farmacologici così come gene, RNA, proteine ​​e modulatori.

Al fine di illustrare una iniezione di successo, abbiamo eseguito questa tecnica usando rapidi colorante verde FCF in adulti C57BL6 topi (8-10 settimane di età). L&#39;animale è stato permesso di recuperare per pochi minuti dopo l&#39;iniezione di fornire tempo sufficiente per il colorante di diffondersi e poi ucciso con una overdose di CO 2. Successivamente, la colonna vertebrato stato dissezionato e il midollo spinale è stato esposto. Il puncta blu corrispondente alla tintura diffusa, ha segnato il sito ...

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In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

Questo rapporto descrive una tecnica semplice e rapida di intratecale ago puntura per una trasfezione di siRNA localizzato nel midollo spinale lombare nel topo sotto breve anestesia leggera durata.

In Vivo trasfezione di siRNA e Gene Knockdown in Spinal Cord via rapida non invasiva lombare spinale iniezioni nei topi

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Research

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Biology

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

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