Name: in vivo sirna transfection and gene knockdown in spinal cord via rapid noninvasive lumbar intrathecal injections in mice
Uploaded: 2014-03-22T14:00:00
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Todos los procedimientos de uso de animales estaban en conformidad con las normas éticas establecidas por la Junta de Gobierno Local (Regierungspräsidium Karlsruhe, Karlsruhe, Alemania). 1. Preparación del Complejo siRNA / PEI La solución de complejo de ARNsi / PEI se prepara utilizando las instrucciones del fabricante de la siguiente manera: <ol><li> Solución A: Diluir la cantidad deseada de siRNA con agua estéril (si es necesario) hasta una cuarta pa...

<ol>
	<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+morphine+in+mice:+a+new+technique.">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).</li><li>Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+tactile+allodynia+following+intrathecal+puncture+in+mouse:+contributions+of+Toll-like+receptor+signaling.">Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling.</a> Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).</li><li>Goula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+intravenous+delivery+of+transgenes+to+mouse+lung.">Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung.</a> Gene Ther. , 1291-1295 (1998).</li><li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia.">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).</li><li>Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+modulation+of+wide+dynamic+range+neurons+in+the+lumbar+dorsal+horn+of+the+rat+by+spinally+administered+WIN55,212-2.">Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2.</a> Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).</li><li>Song, Z. H., Takemori, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+spinal+kappa+opioid+receptors+in+the+antinociception+produced+by+intrathecally+administered+corticotropin-releasing+factor+in+mice.">Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).</li><li>Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+cannabinoid+(CB1)-receptors+in+the+development+and+maintenance+of+opioid+tolerance.">Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance.</a> Neuroscience. , 1275-1288 (2007).</li><li>Yaksh, T. L., Rudy, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+catheterization+of+the+spinal+subarachnoid+space.">Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space.</a> Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).</li><li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain.">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. , 677-681 (2006).</li><li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+the+Cav3.2+T-type+calcium+channel+gene+in+sensory+neurons+demonstrates+its+major+role+in+nociception.">Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception.</a> EMBO J. 24, 315-324 (2005).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+dorsal+root+ganglia+by+intrathecal+injection:+effects+on+regeneration+of+peripheral+nerves.">Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves.</a> Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).</li><li>Wigdor, S., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+and+systemic+morphine-induced+antinociception+in+mice:+contribution+of+descending+serotonergic+and+noradrenergic+pathways.">Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).</li></ol>

Por lo tanto, la técnica de inyecciones intratecales de aguja anteriormente descrito es eficaz, rápido, específicamente localizada-, y no destructiva. Técnicamente, el aspecto más crítico de este procedimiento es el punto de inserción de la aguja en el surco. Es crucial que este procedimiento se realiza con las manos muy tranquilas y paciencia. Como muchos procedimientos quirúrgicos, la formación mejora la tasa de éxito de la inyección. Esto también es importante porque durante un experimento real, esta téc...

La médula espinal es un centro muy importante en una variedad de procesos biológicos fundamentales y funciones fisiológicas, incluyendo el procesamiento y la transmisión de entradas dolorosas (nociceptivo) 4-7. Diversas técnicas experimentales se han desarrollado para facilitar la modulación farmacológica de la médula espinal, tales como la implantación crónica de catéteres intratecales 8, la microinyección de la médula espinal, intratecal y la aguja de inyección 9. Cada técnica tiene sus propias ventajas y desventajas, y dependiendo del paradigma experimento Una técnica podría ser más adecuado que los otros. Considerando que la implantación crónica de los catéteres intratecales es fácilmente factible en la rata, este método es muy difícil en el ratón, dadas las restricciones de tamaño. El índice de éxito es muy baja y el déficit motor a menudo se producen debido a la presencia voluminosa de un catéter en el espacio subdural severamente limitado en el ratón. Además, la administración a largo plazo de medicamentos se hace debido a la coagulación frecuentesde implantado crónicamente catéteres. Finalmente, las reacciones inmunes son comunes. Estos problemas pueden ser evitados utilizando el método de la inyección intratecal aguda a través de una aguja en la ausencia de un catéter preimplanted, que permite una aplicación rápida y anatómicamente limitado de medicamentos y reactivos a la médula espinal en ratones. Este método mantiene plenamente los beneficios de la entrega intratecal sobre otras rutas de administración sistémica (por ejemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, etc) tales como especificidad de la modulación espinal, que permite la reducción de las dosis y los efectos secundarios límite, así como la capacidad para entregar sustancias no hacen normalmente no atraviesan la barrera hematoencefálica ya que durante la inyección intratecal, se inserta la aguja entre la duramadre y la médula espinal. Es importante destacar sin embargo, en comparación con otros métodos de entrega intratecal, el método de inyección de aguja intratecal es el menos invasivo, lo que permite numerosas aplicaciones en lamismo animal sin causar ningún daño tisular considerable o evocando reacción inmune debido a la implantación de material extraño. Sin embargo, requiere habilidades técnicas para una orientación muy precisa de la aguja para permitir la eficacia. Este sentido, demostrar visualmente el método para alcanzar una tasa óptima de éxito para la orientación específica de la médula espinal lumbar. El sitio de la inyección que se elige en este experimento es el surco entre L5 y L6 columna de vertebrados, cerca de donde termina la médula espinal, para reducir al mínimo la posibilidad de dañar la columna vertebral. Por otra parte, se demuestra el uso de esta técnica para derribar los genes en la médula espinal utilizando siRNAs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1012">
	<colgroup>
		<col /> 
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:283px;">in vivo-jetPEI</td>
			<td style="width:255px;">Polyplus</td>
			<td style="width:288px;">201-10G</td>
			<td style="width:188px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">WAVE1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-36832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Control siRNA-A</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-&#223;-Tubulin III antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-WAVE1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF5514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast green dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane setup</td>
			<td>Dr&#228;ger L&#252;beck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaver</td>
			<td>Wella</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hamilton syringe Gastight 1702</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30G 1/2, 0,3 * 13mm Needle</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope Leica MS5</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">WAVE1 forward primer for qRT-PCR</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>cacagagcctcaggacagg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">WAVE1 reversed primer for qRT-PCR</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>cttttcaccaacggcatctt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FastStart Essential DNA Green Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6402712001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo sirna transfection and gene knockdown in spinal cord via rapid noninvasive lumbar intrathecal injections in mice

En este informe se describe una guía paso a paso a la técnica de inyecciones intratecales agujas agudas de una manera no invasiva, es decir, independiente de la implantación del catéter. La limitación técnica de esta técnica quirúrgica se encuentra en la finura de las manos. La inyección es rápida, sobre todo para un investigador entrenado, y dado que la interrupción del tejido con esta técnica es mínima, las inyecciones repetidas son posibles; reacción además inmune a las herramientas de extranjeros (por ej. Catéter) no ocurre, dando así una mejor y más específica leer en voz de la modulación de la médula espinal. Dado que la aplicación de la sustancia se limita en gran parte a la región diana de la médula espinal, los fármacos no necesitan ser aplicado en grandes dosis, y efectos más importante no deseados en otro tejido, como se observa con un suministro sistémico, pueden ser eludidas 1, 2. Además, combinamos esta técnica con la transfección in vivo de ácido nucleico con la ayuda de polyethylenimINE (PEI) de reactivo 3, que proporciona una gran versatilidad para el estudio de funciones de la médula a través de la administración de agentes farmacológicos, así como de genes, ARN, y moduladores de proteínas.

Con el fin de ilustrar una inyección de éxito, se realizó esta técnica usando Fast tinte verde FCF en ratones adultos C57Bl6 (8-10 semanas de edad). El animal se le permitió recuperarse durante unos minutos después de la inyección para dar tiempo suficiente para que el tinte se extendió y luego mató con una sobredosis de CO 2. Posteriormente, la columna de la vertebrado fue disecada y la médula espinal se expuso. El puntos lagrimales azul correspondiente al colorante difusa, marcó el sitio de la in...

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In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

Este informe describe una técnica sencilla y rápida de la aguja de punción intratecal para una transfección localizada de siRNA en la médula espinal lumbar de ratón bajo anestesia de corta luz duradera.

En Vivo transfección siRNA y Gene Derribo en la médula espinal a través de Rapid no invasiva lumbar intratecal inyecciones en ratones

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

Spinal Cord Electrophysiology

La médula espinal de Electrofisiología

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Investigación

Biología

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi mediada por Gene y Derribo<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo de diuresis en Mujeres Adultas<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Los mosquitos

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

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