Name: brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons
Uploaded: 2014-04-03T15:00:00
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Questo lavoro è stato finanziato dal NIH sovvenzioni DA15169 e DA035224 di HEM

Tutti movimentazione degli animali e la raccolta dei tessuti è stata effettuata in conformità con le linee guida della University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care Comitato Usa (IACUC), seguendo il protocollo # approvato A1506 (Melikian, PI). Soluzioni necessarie Liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) - Make fresco tutti i giorni 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2<...

<ol>
	<li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+portals+of+entry+into+the+cell.">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li><li>Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway.">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li><li>Leto, D., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+transport+by+insulin:+traffic+control+of+GLUT4.">Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4.</a> Nat. Rev. Mol. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+trafficking+and+the+plasticity+of+excitatory+synapses.">Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).</li><li>Bredt, D. S., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+trafficking+at+excitatory+synapses.">AMPA receptor trafficking at excitatory synapses.</a> Neuron. 40, 361-379 (2003).</li><li>Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+synapses+and+the+emergence+of+a+postsynaptic+mechanism+for+LTP.">Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).</li><li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity.">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).</li><li>Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+the+ventral+tegmental+area:+electrophysiological+and+behavioral+correlates+in+individual+rats.">Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats.</a> J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+dopamine+neurons:+Behavioral+correlates+in+GluRA(-/-)+mice.">Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice.</a> PNAS. 101, 14282-14287 (2004).</li><li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+mechanisms+of+addiction:+the+role+of+reward-related+learning+and+memory.">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).</li><li>Thomas, M. J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+the+mesolimbic+dopamine+system.">Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).</li><li>Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+and+protein+kinase+C-induced+internalization+of+the+dopamine+transporter+is+mediated+by+a+clathrin-dependent+mechanism.">Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism.</a> Traffic. 6, 157-170 (2005).</li><li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical,+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li><li>Melikian, H. E., Buckley, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+trafficking+regulates+the+activity+of+the+human+dopamine+transporter.">Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter.</a> J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).</li><li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+trafficking+of+the+human+dopamine+transporter.+Clathrin-mediated+internalization+and+lysosomal+degradation+in+response+to+phorbol+esters.">Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters.</a> J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).</li><li>Sorkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+screen+reveals+an+essential+role+of+Nedd4-2+in+dopamine+transporter+ubiquitination+and+endocytosis.">RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis.</a> J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).</li><li>Eriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+dopamine+transporter+trafficking+in+live+neurons+by+use+of+fluorescent+cocaine+analogs.">Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs.</a> J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).</li><li>Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subcellular+distribution+of+endosomal+compartments+and+the+dopamine+transporter+in+dopaminergic+neurons.">Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).</li></ol>

Nonostante la conoscenza di lunga data che il traffico endocytic criticamente l&#39;impatto segnalazione sinaptica nel cervello, si è dimostrato impegnativo per misurare quantitativamente cambiamenti nell&#39;espressione superficie della proteina nei neuroni adulti. In questo lavoro, riportiamo un metodo affidabile per etichettare proteina di superficie ex vivo in fettine cerebrali acute. Preparazioni fetta cervello hanno una lunga storia di utilità per le registrazioni elettrofisiologiche, in quanto mantengo...

Traffico endocitico è un meccanismo cellulare ubiquitario che perfeziona la presentazione membrana plasmatica di una varietà di proteine ​​integrali di membrana. Endocitosi fornisce nutrienti vitali per l&#39;ambiente intracellulare 1 e desensibilizza segnalazione dei recettori in risposta all&#39;attivazione del recettore 2. Riciclo indietro alla membrana plasmatica endocitosi può inoltre migliorare segnalazione cellulare aumentando i livelli di espressione della proteina sulla superficie cellulare 3. Inoltre, perturbazioni traffico di membrana sono implicati in numerose malattie e condizioni patologiche 4,5, sottolineando la necessità di studiare i meccanismi molecolari che governano la proteina traffico endocitico. Mentre molte proteine ​​utilizzano meccanismi di internalizzazione classici clatrina-dipendente, prova di montaggio nel corso degli ultimi anni dimostra che più i meccanismi di endocitosi clatrina-indipendente governano il potenziale endocitica di una serie crescente diproteine ​​6,7. Quindi, la necessità di indagare i meccanismi endocitiche agevolare il traffico nei sistemi pertinenti fisiologici è cresciuta notevolmente. Nel cervello, il traffico endocitico dei recettori, canali ionici e trasportatori di neurotrasmettitori ha un ruolo primario nella creazione di plasticità sinaptica 8-11 e risposta ai farmaci d&#39;abuso 12-15, in ultima analisi, un impatto eccitabilità neuronale e risposte sinaptiche. Ad oggi la maggior parte degli studi di traffico neuronali contare su entrambi i sistemi di espressione eterologa o neuroni primari in coltura, nessuno dei quali può riflettere in maniera affidabile i meccanismi in gioco in neuroni adulti. Qui riportiamo un approccio che utilizza biotinilazione superficie per misurare quantitativamente i livelli di proteina di superficie in fettine cerebrali acute derivanti da roditori adulti. Usando questo approccio, presentiamo i dati che dimostrano che il topo striato trasportatore della dopamina interiorizza rapidamente in rerisposta a forbolo estere mediata proteina chinasi C (PKC) attivazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">sulfo NHS-SS-biotin</td>
			<td style="width:83px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">21331</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Streptavidin agarose</td>
			<td style="width:83px;">Pierce</td>
			<td>20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Vibrating microtome sectioner</td>
			<td style="width:83px;">Various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Shaking water bath</td>
			<td style="width:83px;">various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Milli-cell mesh-bottomed inserts (8&#181;m pore size)</td>
			<td style="width:83px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">PI8P 012 50</td>
			<td>These can be washed by hand and re-used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons

Traffico endocytic regolamentata è il meccanismo centrale facilitando una serie di eventi neuromodulatori, controllando dinamicamente recettore, canale ionico, e la cella presentazione superficie trasportatore su una scala minuti di tempo. C&#39;è una vasta diversità di meccanismi che controllano il traffico endocitico delle singole proteine. Gli studi che indagano le basi molecolari del traffico hanno fatto affidamento principalmente sulla biotinilazione superficie per misurare quantitativamente cambiamenti nell&#39;espressione superficiale proteina di membrana in risposta a stimoli esogeni e la manipolazione genetica. Tuttavia, questo approccio è stato limitato principalmente alle cellule coltivate, che potrebbero non riflettere fedelmente i meccanismi fisiologicamente rilevanti in gioco in neuroni adulti. Inoltre, gli approcci di cellule in coltura possono sottovalutare le differenze regionali specifici meccanismi di traffico. Qui, descriviamo un approccio che si estende biotinylation superficie cellulare per la preparazione fetta acuta cervello. Noidimostrano che questo metodo fornisce un approccio ad alta fedeltà per misurare rapidi cambiamenti nei livelli superficiali delle proteine ​​di membrana in neuroni adulti. Questo approccio rischia di avere un ampio programma di utilità nel campo del traffico endocytic neuronale.

Il trasportatore della dopamina neuronale è internalizzato in risposta all&#39;attivazione PKC in linee cellulari 16-20. Nonostante le molte relazioni che dimostrino la PKC-indotte perdite di superficie DAT in una varietà di linee cellulari e sistemi di espressione, è stato impegnativo per confermare questo dato nei neuroni dopaminergici in coltura 21-23. Abbiamo usato fettine striatali mouse per testare direttamente se DAT interiorizza in risposta all&#39;attivazione PKC nei neuroni dopaminergi...

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Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Traffico di membrana neuronale controlla dinamicamente la membrana plasmatica disponibilità di proteine ​​e gli impatti in modo significativo la neurotrasmissione. Ad oggi, è stato impegnativo per misurare neuronale traffico endocitico in neuroni adulti. Qui, descriviamo un metodo quantitativo altamente efficace per misurare rapidi cambiamenti nell&#39;espressione della proteina superficie ex vivo in fettine cerebrali acute.

Slice Cervello biotinilazione: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

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Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

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L&#39;utilizzo di un α-bungarotossina Binding Tag sito per studiare GABA un recettore di membrana localizzazione e il traffico

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