Name: adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications
Uploaded: 2014-02-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Ontario Institute for Cancer Research (# 08NOV230), Canada Foundation for Innovation (# 13199), prostatakræft Canada, Janssen Oncology, London Regional Cancer Program, og donorstøtte fra John og Donna Bristol gennem London Health Sciences Foundation (ALA). LEL er understøttet af en Frederick Banting og Charles Best Canada Graduate Scholarship Doctoral Award. ALA er understøttet af en CIHR New Investigator Award og en tidlig forsker Award fra Ontario Ministeriet for Forskning og Innovation.

Alle humane undersøgelser, der er beskrevet i dette manuskript blev udført under protokoller godkendt af Western University Human Research Ethics Board. Alle Dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med anbefalingerne fra den canadiske Rådet om Animal Care, under protokoller godkendt af Western University Animal Brug underudvalget. 1.. Standard CTC Enumeration fra patient Blodprøver Brug af CSS 1.. Menneskeblod Prøvetagning og forberedelse til forarbejdnin...

<ol>
	<li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> 63 (1), 11-30 (2013).</li><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li><li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metastatic+cascade.">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nat. Rev. Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).</li><li>Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells,+disease+progression,+and+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).</li><li>De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li><li>Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer.">Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.</a> Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).</li><li>Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+at+each+follow-up+time+point+during+therapy+of+metastatic+breast+cancer+patients+predict+progression-free+and+overall+survival.">Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival.</a> Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).</li><li>Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+versus+imaging--predicting+overall+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer.</a> Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).</li><li>Olmos, D., Arkenau, H. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cell+(CTC)+counts+as+intermediate+end+points+in+castration-resistant+prostate+cancer+(CRPC):+a+single-centre+experience.">Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience.</a> Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).</li><li>De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li><li>Allan, A. L., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+analysis:+technical+and+statistical+considerations+for+application+to+the+clinic.">Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic.</a> J. Oncol. 2010, 426218 (2010).</li><li>Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+cytometry+analysis+of+circulating+tumor+cells.">Image cytometry analysis of circulating tumor cells.</a> Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).</li><li>Lianidou, E. S., Markou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+in+breast+cancer:+detection+systems,+molecular+characterization,+and+future+challenges.">Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges.</a> Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).</li><li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells:+liquid+biopsy+of+cancer.">Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer.</a> Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).</li><li>Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+in+the+development+of+circulating+tumor+cell+technology+for+clinical+use.">Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use.</a> J. Transl. Med. 10, 138 (2012).</li><li>Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=User-defined+protein+marker+assay+development+for+characterization+of+circulating+tumor+cells+using+the+CellSearch+system.">User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system.</a> Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).</li><li>Fehm, T., M&#252;ller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+status+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+breast+cancer:+a+prospective,+multicenter+trial.">HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial.</a> Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).</li><li>Liu, Y., Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+in+HER2-positive+metastatic+breast+cancer+patients:+a+valuable+prognostic+and+predictive+biomarker.">Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker.</a> BMC Cancer. 13, 202 (2013).</li><li>Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chemotherapy+plus+a+monoclonal+antibody+against+HER2+for+metastatic+breast+cancer+that+overexpresses+HER2.">Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.</a> New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).</li><li>Marty, M., Cognetti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+phase+II+trial+of+the+efficacy+and+safety+of+trastuzumab+combined+with+docetaxel+in+patients+with+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-positive+metastatic+breast+cancer+administered+as+first-line+treatment:+the+M77001+study+group.">Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group.</a> J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).</li><li>Slamon, D., Eiermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+trastuzumab+in+HER2-positive+breast+cancer.">Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer.</a> New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).</li><li>Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+considerations+for+studying+cancer+metastasis+in+vivo.">Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo.</a> Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).</li><li>Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+tumor+cell+dissemination+patterns+in+preclinical+models+of+cancer+metastasis+using+flow+cytometry+and+laser+scanning+cytometry.">Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry.</a> Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).</li><li>Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+escape+from+EpCAM-based+detection+due+to+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition.</a> BMC Cancer. 12, 178 (2012).</li><li>Eliane, J. -. P., Repollet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+serial+changes+in+circulating+human+breast+cancer+cells+in+murine+xenograft+models.">Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models.</a> Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).</li><li>Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+yield+of+circulating+tumour+cells+facilitates+molecular+characterisation+and+recognition+of+discordant+HER2+amplification+in+breast.">Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast.</a> 102 (10), 1495-1502 (2010).</li><li>Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+circulating+tumor+cells+in+large+quantities+of+contaminating+leukocytes+by+a+multiplex+real-time+PCR.">Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR.</a> Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).</li><li>Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+circulating+tumor+cells+to+tumor+response,+progression-free+survival,+and+overall+survival+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer.">Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer.</a> J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).</li><li>Allard, W. J., Matera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).</li><li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139 (5), 871-890 (2009).</li><li>Yang, J., Weinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Epithelial-mesenchymal+transition:+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis.">A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).</li><li>Gradilone, A., Raimondi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+lacking+cytokeratin+in+breast+cancer:+the+importance+of+being+mesenchymal.">Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).</li><li>K&#246;nigsberg, R., Obermayr, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+EpCAM+positive+and+negative+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer+patients.">Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients.</a> Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).</li><li>Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+markers+in+primary+breast+cancer+patients+with+circulating+tumor+cells.">Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells.</a> Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).</li><li>Mego, M., Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-inducing+transcription+factors+in+primary+breast+cancer:+The+effect+of+neoadjuvant+therapy.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy.</a> Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).</li><li>Yu, M., Bardia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition.">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li><li>Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+patients+with+advanced+prostate+and+breast+cancer+display+both+epithelial+and+mesenchymal+markers.">Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers.</a> Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).</li></ol>

På trods af udviklingen af ​​mange nye CTC teknologier siden indførelsen af ​​CSS i 2004, denne teknik er stadig den eneste klinisk godkendte teknologi på markedet i dag, og derfor betragtes som den aktuelle gold standard for CTC påvisning og tælling. Dette håndskrift har vist, at selv om CSS har strenge krav til kvalitetskontrol kan det være genstand for fortolkning bias og at CTC identifikation i patientprøver er meget anderledes fra identifikation i spidse prøver. Blev identificeret seks kategorier a...

I 2013 anslås det, at 580.350 personer vil dø af kræft, og at 1.660.290 nye tilfælde af denne sygdom vil blive diagnosticeret i USA alene 1. De fleste af disse dødsfald sker efterfølgende til udviklingen af metastatisk sygdom 2. Den nuværende mangel på effektive behandlinger i behandling af metastaser og en begrænset forståelse af den metastatiske kaskade gør denne fase af sygdommen meget dødelig. Tilstedeværelsen af cirkulerende tumorceller (CTCs) i blodbanen har vist sig at korrelere med metastatisk sygdom 3. Disse celler er ekstremt sjældne, og deres opdagelse er betegnende for den samlede overlevelse i metastatisk brystkræft 4, prostata 5, og kolorektal 6 cancer. Hos disse patienter er tilstedeværelsen af ​​≥ 5 (bryst og prostata), eller ≥ 3 (kolorektal) CTCs i 7,5 ml blod er tegn på dårligere prognose sammenlignet med de patienter med færre eller ingen påviselige CTCs i SAMe blodvolumen. Endvidere har ændringen i CTC antal under eller efter terapeutisk intervention vist sig at være nyttig som en indikator for behandlingsrespons, ofte hurtigere end de nuværende anvendte teknikker 7-10. Det er blevet anslået, at i metastatiske cancerpatienter CTCs sted med en frekvens på cirka 1 CTC per 10 5 -10 7 mononukleare celler og i patienter med lokaliseret sygdom, kan denne frekvens være endnu lavere (~ 1 i 10 8). Den sjældne art af disse celler kan gøre det vanskeligt præcist og pålideligt registrere og analysere CTCs 11. Flere metoder (tidligere 12-14 revideret) er blevet udnyttet til at berige og afsløre disse celler ved at udnytte egenskaber, der adskiller dem fra omgivende blodkomponenter. I almindelighed CTC tælling er en todelt proces, der kræver både en trin berigelse og påvisningstrin. Traditionelt berigelse skridt afhængige forskelle i physgiske egenskaber CTCs (cellestørrelse, densitet, deformerbarhed) eller på proteinmarkør ekspression (dvs. epitelcelleadhæsionsmolekyle [EpCAM] cytokeratin [CK]). Efter opformering kan CTC påvisning udføres på en række forskellige måder, hvoraf den mest almindelige er nukleinsyrebaserede assays og / eller cytometriske metoder. Hver af disse strategier er unikke, idet forskellige fordele og ulemper, men de mangler alle standardisering en nødvendighed for indgangen til det kliniske miljø. Den CellSearch systemet (CSS) blev derfor udviklet til at give en standardiseret metode til påvisning og tælling af sjældne CTCs i humant blod ved hjælp af fluorescens mikroskopi og antistof-baserede teknikker 4-6. Denne platform er i øjeblikket betragtes som den gyldne standard i CTC opregning og er den eneste teknik, der er godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) til brug i klinikken 15. CSS er en to komponent platform consisting, (1) den CellTracks AutoPrep systemet (herefter benævnt forberedelse instrument), som automatiserer forberedelsen af humane blodprøver, og (2) den CellTracks Analyzer II (i det følgende benævnt analyse instrument), der scanner disse prøver efter forberedelse. For at skelne CTCs kontaminerende leukocytter forberedelse instrument anvender et antistof medieret, Ferrofluid-baserede magnetiske separation tilgang og differentieret fluorescens farvning. Indledningsvis etiketter systemet CTCs anvendelse af anti-EpCAM antistoffer konjugeret til jern nanopartikler. Prøven inkuberes derefter i et magnetfelt, og alle ikke-mærkede celler aspireres. Udvalgte tumorceller resuspenderet og inkuberet i en differentieret fluorescens plet bestående af fluorescens-mærkede antistoffer og en nuklear farvningsreagens. Endelig er prøven overført til en magnetisk patron, der kaldes en MagNest (i det følgende benævnt den magnetiske enhed), og scanned hjælp analyseinstrumentet. Analysen instrument anvendes til at scanne fremstillede prøver ved hjælp af forskellige fluorescens-filtre, der hver er optimeret til den relevante fluorescerende partikel ved hjælp af en 10X objektiv. CTCs er identificeret som celler, der er bundet af anti-EpCAM, anti-pan-CK-phycoerythrin (PE) (CK8, 18 og 19), og det nukleare bejdse 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Omvendt er kontaminerende leukocytter identificeret som celler, der er bundet af anti-CD45-allophycocyanin (APC) og DAPI. Efter scanning, er computer-definerede potentielle tumorceller præsenteres for brugeren. Fra disse billeder skal brugeren anvende kvalitativ analyse under anvendelse af de definerede parametre og differentialfarvning diskuteret ovenfor for at bestemme, hvilke hændelser er CTCs. Ud over at give en standardiseret metode til CTC optælling, CSS giver mulighed for molekylær karakterisering af CTCs baseret på proteinmarkører af interesse. Denne forespørgsel cen udføres på enkelt-celle niveau, ved hjælp af et fluoresceinisothiocyanat (FITC) fluorescens kanal ikke påkrævet for CTC identifikation 16. Selv om denne platform giver evnen til molekylær karakterisering, den detaljerede proces protokol udvikling og optimering er ikke veldefineret. Tre kommercielt tilgængelige markører er blevet udviklet af producenten til brug med CSS, herunder epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) og insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF-1R). HER2-analyse, i kombination med CSS, er blevet brugt af flere grupper til at illustrere potentialet for CTC karakterisering at informere den kliniske beslutningsproces og potentielt ændre de eksisterende retningslinjer for behandling. For eksempel Fehm et al. 17 viste, at cirka en tredjedel af brystkræftpatienter med HER2-primær tumorer havde HER2 + CTCs. Desuden Liu et al.18 for nylig rapporteret, at op til 50% af patienter med HER + metastatisk brystkræft ikke havde HER2 + CTCs. Herceptin, et HER2 receptor forstyrrende monoklonalt antistof påvist at være til fordel patienter, hvis tumorer udtrykker tilstrækkelige niveauer af HER2, er et almindeligt brugt til behandling af patienter med HER2 + primære tumorer 19-21. Men disse undersøgelser tyder på, at Herceptin kan være sub-optimalt udnyttet, og at CTC karakterisering kan støtte i at forudsige behandlingsrespons. I sidste ende kan CTC karakterisering har potentiale til at forbedre personlig pleje. CTC forskning er enestående, fordi det har i høj grad udnyttet en seng-til-bord-tilgang. Denne metode, i modsætning til benchtop-til-bedside forskning, som ofte kan tage år at påvirke patientpleje, har tilladt CTCs hurtig indtræden i kliniske omgivelser. Men læger er tilbageholdende med at bruge resultaterne fra CTC-analyse i patientbehandlingen beslutningsprocessen MAKning på grund af en manglende forståelse af deres underliggende biologi. Derfor bør relevante prækliniske musemodeller for metastaser og supplerende CTC analyseteknikker skal udnyttes med henblik på at undersøge disse udestående spørgsmål. Generelt er der to typer af prækliniske modeller, der anvendes til at studere den metastatiske kaskade, (1) spontan metastase modeller, som giver mulighed for undersøgelse af alle de trin i den metastatiske kaskade, og (2) eksperimentelle metastase modeller, som kun giver mulighed for studiet af senere trin i den metastatiske proces såsom ekstravasation og sekundær tumor dannelse 22. Spontan metastase modeller involverer tumorcellevacciner injektioner i passende ortotopisk steder (f.eks injektion af prostatakræft celler i prostata for studiet af prostatakræft). Celler bliver derefter givet tid til at danne primære tumorer og spontant metastaserer til sekundære steder, såsom knogle, lunge og lymfeknuder. IDerimod eksperimentelle metastase modeller indebærer direkte indsprøjtning af tumorceller i blodbanen (fx via halevenen eller intrakardiel injektion til at målrette celler til specifikke steder), og derfor springe de indledende trin i intravasation og formidling til sekundære organer 22. Således Langt størstedelen af CTC-analyse in vivo modelsystemer er blevet udført ved hjælp af enten cytometri-baserede 23 eller tilpasset menneske-baserede CTC-teknikker (f.eks AdnaTest) 24. Selvom nyttigt, ingen af ​​disse teknikker i tilstrækkelig grad afspejler CTC optælling ved hjælp af guldstandarden CSS. Baseret på den kliniske godkendelse, standardiseret karakter, og udbredt brug af CSS, vil udviklingen af en CTC opsamling og afsløring teknik til in vivo modellering, der bruger tilsvarende prøveforberedelse, forarbejdning og identifikationskriterier være fordelagtig, da resultaterne ville være sammenlignelige med de indhentet fra patientprøver. Men på grund af mængden REQuirements af præparatet instrument er det ikke muligt at bearbejde små volumener af blod ved hjælp af denne automatiske platform. . Desuden har tidligere arbejde af Eliane et al 25 viste, at kontaminering af prøverne med muse epithelceller (som også opfylder standarden CTC definition [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) kan føre til forkert klassifikation af muse pladeepitelceller som CTCs. For at løse disse problemer en tilpasset teknik, der tillader udnyttelse af CSS CTC reagenser kombineret med en manuel isolation procedure blev udviklet. Tilføjelsen af ​​en FITC-mærket human leukocyt antigen (HLA)-antistof til Analysen tillader humane tumorceller kan skelnes fra muse pladeepitelceller. Dette håndskrift beskriver standard kommercielt udviklet og optimeret CSS protokol til behandling af patientens blodprøver og almindelige faldgruber, som kan opstå, herunder discrepant elementer, der kan føre til CTC Fejlklassificering fejl. Desuden er tilpasning af CSS assay at undersøge brugerdefinerede protein karakteristika tilfangetagne CTCs og en tilsvarende tilpasset CSS teknik, der giver mulighed for berigelse og påvisning af CTCs fra små volumener af blod i prækliniske musemodeller for metastase beskrevet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-FITC</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-PE</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human HLA-AlexaFluor488</td>
			<td style="width:175px;">BioLegend</td>
			<td style="width:161px;">311415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-mouse CD45-APC</td>
			<td style="width:175px;">eBioscience</td>
			<td style="width:161px;">17-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Bond Primary Antibody Diluent</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:161px;">AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:267px;">CellSave Preservative Tubes</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">952820 (20 pack)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 79100005 (100 pack)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900018RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900017RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Instrument Buffer</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7901003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Streck Cell Preservative (aka CytoChex)</td>
			<td style="width:175px;">Streck</td>
			<td>213350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">10 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1000&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1000&#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">12 x 75mm flow tubes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">200&#181;l gel loading tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">200&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">22 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">5 3/4&#34; disposible pasteur pipet</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">5 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Automated pipettor</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Capillary Blood Collection Tube (EDTA)</td>
			<td style="width:175px;">BD Microtainer</td>
			<td style="width:161px;">365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch Analyzer II</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9555</td>
			<td rowspan="2" style="width:188px;">Includes magnests and verification cartirdges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CellSearch AutoPrep System</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9541</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MagCellect Magnet&#160;</td>
			<td style="width:175px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:161px;">MAG997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Small Latex Bulb</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Vortex</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications

Størstedelen af ​​cancer-relaterede dødsfald sker efterfølgende til udviklingen af ​​metastatisk sygdom. Denne meget dødelige sygdom fase er forbundet med tilstedeværelsen af ​​cirkulerende tumorceller (CTCs). Disse sjældne celler har vist sig at være af klinisk betydning for metastatisk brystkræft, prostata-og tarmkræft. Den nuværende guldstandarden i klinisk CTC påvisning og tælling er FDA-godkendt CellSearch systemet (CSS). Dette håndskrift skitserer den standard protokol anvendes af denne platform, samt to yderligere tilpassede protokoller, der beskriver den detaljerede proces brugerdefineret markør optimering for protein karakterisering af patientens CTCs og en sammenlignelig protokol for CTC fange i meget lave mængder af blod, ved hjælp af standard CSS reagenser til at studere in vivo prækliniske musemodeller af metastaser. Derudover har forskellene i CTC kvalitet mellem rask donor blod tilsat celler fra vævskultur versus patient blod Samples fremhæves. Endelig er flere almindeligt afvigende elementer, der kan føre til CTC fejltarifering fejl skitseret. Tilsammen vil disse protokoller give en nyttig ressource for brugere af denne platform er interesseret i præklinisk og klinisk forskning vedrørende metastaser og CTCs.

Standard CTC Enumeration Assay Følsomheden og specificiteten af ​​CSS er veldokumenteret i litteraturen. Men for at validere tilsvarende CTC opsving, spidse (1.000 LNCaP humane prostatacancerceller) og ikke-spikede blodprøver menneske fra raske frivillige donorer blev behandlet på CSS bruger standard CSSCTC protokollen. Som forventet, ikke-spikede prøver var fri for CTCs, 0,00 ± 0,00%, og CTC opsving blev påvist at være 86,9 ± 4,71% for spikede prøver (figur 1a). C...

Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications at JoVE.com

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Cirkulerende tumorceller (CTCs) er prognostisk i flere metastatiske cancere. Dette håndskrift beskriver guldstandarden CellSearch systemet (CSS) CTC tælling platform og fremhæver fælles misklassifikation fejl. Desuden er to tilpassede protokoller beskrevet for brugerdefineret markør karakterisering af CTCs og CTC optælling i prækliniske musemodeller af metastaser ved hjælp af denne teknologi.

Tilpasning af halvautomatiseret Cirkulerende Tumor Cell (CTC) analyser til kliniske og prækliniske forskning applikationer

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Generering af alginat mikrosfærer til biomedicinske anvendelser

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Behandling af primær hjernetumor Tissue for stamcelle Analyser og Flow Sortering

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Afledt Cellekultur og isolering af CD133<sup&gt; +</sup&gt; Formodede kræftstamceller fra melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MR for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Gene Transfer teknik og<em&gt; In vitro</em&gt; cellebaserede assays til undersøgelse af knogletab i Muskel-og skeletbesvær

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolation, Kryopræservering og dyrkning af humane amnion epitelceller ved kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Ex vivo-behandling Reaktion fra primære tumorer og / eller associerede Metastaser til præklinisk og klinisk udvikling af Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolation og formering af cirkulerende tumorceller fra en mus Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Generering af prostatakræft Patient Afledt xenograftmodeller fra Cirkulerende tumorceller

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Perkutan kontrast ekkokardiografi-styrede Intramyocardial injektion og celle levering i en stor prækliniske Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...