Name: adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications
Uploaded: 2014-02-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;Institut ontarien de recherche sur le cancer (# 08NOV230), la Fondation canadienne pour l&#39;innovation (# 13199), Cancer de la Prostate Canada, Janssen-oncologie, le London Regional Cancer Program, et le soutien des bailleurs de fonds de John et Donna Bristol grâce la London Health Sciences Foundation (ALA). LIE est soutenu par une Frederick Banting et Charles Best canadienne des bourses d&#39;études supérieures au doctorat. ALA est soutenu par une bourse de nouveau chercheur des IRSC et une bourse de nouveau chercheur du ministère de la Recherche et de l&#39;Innovation de l&#39;Ontario.

Toutes les études humaines décrites dans ce manuscrit ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le Comité d&#39;éthique de la recherche humaine de l&#39;Université Western. Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les recommandations du Conseil canadien de protection des animaux, selon des protocoles approuvés par le Sous-Comité d&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université Western. Une. Norme CTC énumération des échantillons d...

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Malgré le développement de nombreuses technologies nouvelles de la CCT depuis l&#39;introduction de la CSS en 2004, cette technique est encore la seule technologie cliniquement approuvé sur le marché aujourd&#39;hui et il est donc considéré comme l&#39;étalon-or actuel pour la détection et le dénombrement de la CCT. Ce manuscrit a démontré que, bien que le CSS a des normes de contrôle de qualité rigoureuses, il peut être sujet à des biais d&#39;interprétation et que l&#39;identification de la CCT dans le...

En 2013, on estime que 580 350 personnes mourront du cancer et que 1.660.290 nouveaux cas de cette maladie sera diagnostiquée aux États-Unis seulement 1. La majorité de ces décès surviennent à la suite de l&#39;apparition de la maladie métastatique 2. L&#39;absence actuelle de traitements efficaces dans le traitement des métastases et une compréhension limitée de la cascade métastatique rend ce stade de la maladie souvent mortelle. La présence de cellules tumorales circulantes (CTC) dans le sang ont été démontrées en corrélation avec une maladie métastatique 3. Ces cellules sont extrêmement rares et leur détection est indicatif de la survie globale dans le sein métastatique 4, 5 prostate, colorectal et le cancer 6. Chez ces patients, la présence de ≥ 5 ≥ 3 (colorectal) CTC dans 7,5 ml de sang (sein et prostate) ou est indicatif de moins bon pronostic par rapport aux patients avec peu ou pas du CTC détectables dans le samle volume de courrier de sang. En outre, le changement du nombre de CTC pendant ou après une intervention thérapeutique a été démontrée comme étant utile en tant que prédicteur de la réponse au traitement, souvent plus rapidement que les techniques actuellement utilisées 7-10. Il a été estimé que, chez les patients atteints d&#39;un cancer métastatique, CTC se produisent à une fréquence d&#39;environ 1 CTC par 10 5 à 10 7 cellules mononucléées du sang et chez les patients présentant une maladie localisée, cette fréquence peut être encore plus faible (~ 1 à 10 8). La rareté de ces cellules, il peut être difficile à détecter avec précision et de manière fiable et analyser CTC 11. Plusieurs méthodes (examen préalable 12-14) ont été utilisées pour enrichir et de détecter ces cellules en exploitant les propriétés qui les différencient des environs composants sanguins. En général, la CCT énumération est un processus en deux parties qui nécessite à la fois une étape d&#39;enrichissement et une étape de détection. Traditionnellement, les étapes d&#39;enrichissement s&#39;appuient sur les différences dans l&#39;éducation physiqueques des propriétés CTC (taille des cellules, la densité, la déformabilité) ou sur l&#39;expression du marqueur de protéine (par exemple la molécule d&#39;adhésion des cellules épithéliales [EpCAM], de cytokératine [CK]). À la suite de l&#39;enrichissement, la détection de CTC peut être effectuée dans un certain nombre de façons différentes, dont les plus courantes sont les dosages à base d&#39;acide nucléique et / ou des méthodes de cytométrie. Chacune de ces stratégies sont uniques, présentant des avantages et des inconvénients distincts, mais ils manquent tous de normalisation; une nécessité pour l&#39;entrée dans le milieu clinique. Le système CellSearch (CSS) a donc été développé pour fournir une méthode normalisée pour la recherche et le dénombrement des CTC rares dans le sang humain en utilisant la microscopie par fluorescence et des techniques à base d&#39;anticorps 4-6. Cette plate-forme est actuellement considéré comme l&#39;étalon-or dans la CCT énumération et est la seule technique approuvé par la US Food and Drug Administration (FDA) pour une utilisation dans la clinique 15. Le CSS est une plate-forme à deux composants consisting de, (1) le système CellTracks AutoPrep (ci-après dénommé l&#39;instrument de préparation), qui automatise la préparation des échantillons de sang humain, et (2) la CellTracks Analyzer II (ci-après dénommé l&#39;instrument d&#39;analyse), qui numérise ces échantillons suivants préparation. Pour distinguer les CTC de leucocytes contaminants de l&#39;instrument de préparation emploie un anticorps médiée, l&#39;approche de séparation magnétique à base ferrofluide et différencié coloration fluorescente. Initialement, le système CTC étiquettes en utilisant des anticorps anti-EpCAM conjugués à des nanoparticules de fer. L&#39;échantillon est ensuite incubé dans un champ magnétique, et toutes les cellules non marquées sont aspirés. Cellules tumorales sélectionnées sont remises en suspension, et on les incube dans un colorant de fluorescence différentielle, constitué d&#39;anticorps marqués par fluorescence et un réactif de coloration nucléaire. Enfin, l&#39;échantillon est transféré à une cartouche magnétique, appelé magnest (ci-après dénommé le dispositif magnétique), et scanned en utilisant l&#39;instrument d&#39;analyse. L&#39;instrument d&#39;analyse est utilisé pour numériser les échantillons préparés en utilisant les filtres de fluorescence différents, chacun optimisé pour la particule fluorescente appropriée, en utilisant une lentille d&#39;objectif 10X. CTC sont identifiées comme des cellules qui sont liées par des anticorps anti-EpCAM, l&#39;anti-pan-CK-phycoérythrine (PE) (CK8, 18, et 19), et la coloration nucléaire 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). A l&#39;inverse, les leucocytes contaminants sont identifiées comme des cellules qui sont liées par l&#39;anti-CD45-allophycocyanine (APC) et DAPI. À la suite de l&#39;analyse, les cellules tumorales possibles définis par l&#39;ordinateur sont présentées à l&#39;utilisateur. A partir de ces images, l&#39;utilisateur doit employer une analyse qualitative en utilisant les paramètres définis et coloration différentielle décrits ci-dessus afin de déterminer quels événements sont CTC. En plus de fournir une méthode standardisée de dénombrement CTC, le CSS permet la caractérisation moléculaire des CTC sur la base de marqueurs de protéines d&#39;intérêt. Cette interrogation cun être effectuée au niveau de la cellule, à l&#39;aide d&#39;un isothiocyanate de fluorescéine (FITC) canal de fluorescence n&#39;est pas nécessaire pour l&#39;identification de la CCT 16. Bien que cette plate-forme fournit la capacité pour la caractérisation moléculaire, le processus détaillé de développement de protocole et l&#39;optimisation n&#39;est pas bien définie. Trois marqueurs disponibles dans le commerce ont été mis au point par le fabricant pour l&#39;utilisation avec le CSS, incluant récepteur épidermique de facteur de croissance (EGFR), récepteur humain de croissance épidermique de facteur 2 (HER2), et le facteur de croissance analogue à l&#39;insuline 1 receptor (IGF-1R). analyse de HER2, en combinaison avec le CSS, a été utilisé par plusieurs groupes pour illustrer le potentiel pour la caractérisation de la CCT pour éclairer la prise de décision clinique et de modifier potentiellement des directives de traitement existantes. Par exemple, Fehm et al. 17 démontré que près d&#39;un tiers des patients atteints de cancer du sein avec des tumeurs HER2-primaire avait HER2 + CTC. En outre, Liu et al.18 récemment rapporté que jusqu&#39;à 50% des patients atteints de SA + cancer du sein métastatique HER2 n&#39;a pas eu + CTC. Herceptin, un récepteur HER2 interférer anticorps monoclonal démontré à bénéficier grandement les patients dont les tumeurs expriment des niveaux suffisants de HER2, est un traitement couramment utilisé pour les patients atteints de HER2 + tumeurs primaires 19-21. Cependant, ces études suggèrent que Herceptin peut être étant sous-utilisés de manière optimale et que la CCT caractérisation peut aider à prédire la réponse au traitement. En fin de compte, la caractérisation de la CCT peut avoir le potentiel d&#39;améliorer les soins personnalisé. Recherche de la CCT est unique en ce qu&#39;il a largement utilisé une approche chevet à paillasse. Cette méthode, contrairement paillasse au chevet du patient recherche, qui peut souvent prendre des années à l&#39;impact des soins aux patients, a permis CTC entrée rapide dans le cadre clinique. Toutefois, les médecins hésitent à utiliser les résultats de l&#39;analyse de la CCT dans le traitement des patients prise de décisionment en raison d&#39;un manque de compréhension de la biologie sous-jacente. Par conséquent modèles murins précliniques appropriées des techniques de métastases et d&#39;analyse complémentaire CTC doivent être utilisés afin d&#39;étudier ces questions en suspens. En général, il existe deux types de modèles précliniques utilisés pour étudier la cascade métastatique, (1) les modèles de métastase spontanée, qui permettent l&#39;étude de toutes les étapes de la cascade métastatique, et (2) des modèles de métastases expérimentales qui ne permettent l&#39;étude des étapes ultérieures du processus métastatique tels que extravasation et la formation secondaire de la tumeur 22. Des modèles de métastase spontanée, impliquent des injections de cellules tumorales dans des emplacements appropriés (par exemple orthotopique d&#39;injection de cellules de cancer de la prostate dans la prostate pour l&#39;étude du cancer de la prostate). Les cellules sont alors données de temps pour former des tumeurs primaires et des métastases spontanément à des sites secondaires, tels que l&#39;os, le poumon et les ganglions lymphatiques. Dansrevanche, les modèles de métastases expérimentales impliquent l&#39;injection directe de cellules tumorales dans la circulation sanguine (par exemple, via la veine caudale ou par injection intracardiaque de cellules cibles à des emplacements spécifiques) et donc sauter les étapes initiales de intravasation et la diffusion d&#39;organes secondaires 22. Jusqu&#39;à présent, la majorité de l&#39;analyse CTC in vivo des systèmes modèles a été réalisée en utilisant soit 23 ou adaptés techniques CCT basée sur les droits, sur la base de cytométrie (p. ex AdnaTest) 24. Bien qu&#39;utile, aucune de ces techniques reflètent adéquatement CTC énumération en utilisant le CSS de l&#39;étalon-or. Sur la base de l&#39;approbation clinique, la nature standardisée, et l&#39;utilisation généralisée de la CSS, le développement d&#39;une capture et la détection technique CTC pour la modélisation in vivo qui utilise la préparation de l&#39;échantillon équivalent, le traitement et les critères d&#39;identification serait avantageux que les résultats seraient comparables à ceux obtenu à partir d&#39;échantillons de patients. Toutefois, en raison de la req de volumeuirements de l&#39;instrument de préparation, il n&#39;est pas possible de traiter des petits volumes de sang à l&#39;aide de cette plate-forme automatisée. . Par ailleurs, des travaux antérieurs par Eliane et al 25 a démontré que la contamination des échantillons avec des cellules épithéliales de la souris (qui répondent aussi à la définition standard de la CCT [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) peut conduire à des erreurs de classification des cellules épithéliales squameuses de la souris comme CTC. Pour répondre à ces questions une technique adaptée qui permet l&#39;utilisation des réactifs du kit CSS CCT combinés avec un manuel de procédure d&#39;isolement a été développé. L&#39;addition d&#39;un antigène de leucocyte humain marqué au FITC (HLA) de l&#39;anticorps à l&#39;essai permet de cellules tumorales humaines pour les distinguer des cellules épithéliales squameuses de souris. Ce manuscrit décrit la norme, développée commercialement et protocole CSS optimisé pour le traitement des échantillons de sang des patients et les pièges courants qui peuvent être rencontrés, y compris discrepant des éléments qui peuvent conduire à des erreurs de classification de la CCT. Par ailleurs, la personnalisation de l&#39;essai de CSS pour examiner les caractéristiques de protéines définies par l&#39;utilisateur de CTC capturées et une technique comparable CSS adapté qui permet l&#39;enrichissement et la détection de CTC à partir de petits volumes de sang chez les souris modèles précliniques de métastase sont décrits.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-FITC</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-PE</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human HLA-AlexaFluor488</td>
			<td style="width:175px;">BioLegend</td>
			<td style="width:161px;">311415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-mouse CD45-APC</td>
			<td style="width:175px;">eBioscience</td>
			<td style="width:161px;">17-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Bond Primary Antibody Diluent</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:161px;">AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:267px;">CellSave Preservative Tubes</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">952820 (20 pack)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 79100005 (100 pack)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900018RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900017RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Instrument Buffer</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7901003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Streck Cell Preservative (aka CytoChex)</td>
			<td style="width:175px;">Streck</td>
			<td>213350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">10 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1000&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1000&#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">12 x 75mm flow tubes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">200&#181;l gel loading tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">200&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">22 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">5 3/4&#34; disposible pasteur pipet</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">5 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Automated pipettor</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Capillary Blood Collection Tube (EDTA)</td>
			<td style="width:175px;">BD Microtainer</td>
			<td style="width:161px;">365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch Analyzer II</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9555</td>
			<td rowspan="2" style="width:188px;">Includes magnests and verification cartirdges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CellSearch AutoPrep System</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9541</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MagCellect Magnet&#160;</td>
			<td style="width:175px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:161px;">MAG997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Small Latex Bulb</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Vortex</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications

La majorité des décès liés au cancer surviennent à la suite de l&#39;apparition de la maladie métastatique. Ce stade de la maladie hautement létale est associée à la présence de cellules tumorales circulantes (CTC). Ces cellules rares ont été démontrés comme étant d&#39;importance clinique dans le sein métastatique, de la prostate et les cancers colorectaux. L&#39;étalon-or actuel dans la détection clinique de la CCT et le dénombrement est le système CellSearch approuvé par la FDA (CSS). Ce manuscrit décrit le protocole standard utilisé par cette plate-forme, ainsi que deux protocoles adaptés supplémentaires qui décrivent le processus détaillé de l&#39;optimisation de marqueur définie par l&#39;utilisateur pour la caractérisation des protéines de CTC patient et un protocole comparable pour CTC capture dans de très faibles volumes de sang, en utilisant la norme réactifs CSS, pour étudier dans des modèles murins précliniques in vivo de métastases. En outre, les différences de qualité entre les CTC sang de donneur sain dopés avec des cellules de culture de tissu par rapport à des patients samp de sangles sont mis en évidence. Enfin, plusieurs articles couramment discordants qui peuvent conduire à des erreurs de classification erronée de la CCT sont présentés. Pris ensemble, ces protocoles fourniront une ressource utile pour les utilisateurs de cette plate-forme intéressé dans la recherche préclinique et clinique relative à la métastase et CTC.

Norme CTC énumération Assay La sensibilité et la spécificité du CSS a été bien documenté dans la littérature. Toutefois, pour valider la récupération CTC équivalent, dopés (cellules de cancer de la prostate humain 1000 LNCaP) et non surchargés échantillons de sang humain provenant de donneurs volontaires en bonne santé ont été traitées sur le CSS en utilisant le protocole de CSSCTC standard. Comme prévu, les échantillons non dopés étaient libres de CTC, 0,00 ± 0,00%, et ...

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Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Cellules tumorales circulantes (CTC) sont pronostique dans plusieurs cancers métastatiques. Ce manuscrit décrit le système de l&#39;étalon-or CellSearch (CSS) CTC plate-forme d&#39;énumération et met en lumière les erreurs de classification communs. En outre, deux protocoles adaptés sont décrits pour défini par l&#39;utilisateur marqueur caractérisation des CTC et CTC énumération dans des modèles murins précliniques de métastases utilisant cette technologie.

Adaptation des semi-automatique de circulation des cellules tumorales (CTC) Essais pour les applications cliniques et précliniques de recherche

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Research

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Medicine

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