Name: adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications
Uploaded: 2014-02-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Ontario Institute of Cancer Research (# 08NOV230), Canada Foundation for innovasjon (# 13199), prostatakreft Canada, Janssen Oncology, London Regional Cancer Program, og giverstøtte fra John og Donna Bristol gjennom London Health Sciences Foundation (ALA). LEL er støttet av en Frederick Banting og Charles Best Canada Graduate Scholarship Doctoral Award. ALA er støttet av en CIHR New Investigator Award og en tidlig Forsker Award fra Ontario Ministry of Research and Innovation.

Alle studier på mennesker som er beskrevet i dette manuskriptet ble utført under protokoller godkjent av Western University Human forskningsetikk Board. Alle Dyrestudier ble utført i tråd med anbefalingene fra den kanadiske rådet på Animal Care under protokoller godkjent av Western University Animal Bruk Subcommittee. En. Standard CTC Enumeration fra Pasientblodprøver ved hjelp av CSS En. Human Blood Prøvetaking og klargjøring for prosessering på Forberedels...

<ol>
	<li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> 63 (1), 11-30 (2013).</li><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li><li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metastatic+cascade.">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nat. Rev. Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).</li><li>Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells,+disease+progression,+and+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).</li><li>De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li><li>Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer.">Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.</a> Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).</li><li>Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+at+each+follow-up+time+point+during+therapy+of+metastatic+breast+cancer+patients+predict+progression-free+and+overall+survival.">Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival.</a> Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).</li><li>Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+versus+imaging--predicting+overall+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer.</a> Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).</li><li>Olmos, D., Arkenau, H. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cell+(CTC)+counts+as+intermediate+end+points+in+castration-resistant+prostate+cancer+(CRPC):+a+single-centre+experience.">Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience.</a> Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).</li><li>De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li><li>Allan, A. L., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+analysis:+technical+and+statistical+considerations+for+application+to+the+clinic.">Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic.</a> J. Oncol. 2010, 426218 (2010).</li><li>Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+cytometry+analysis+of+circulating+tumor+cells.">Image cytometry analysis of circulating tumor cells.</a> Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).</li><li>Lianidou, E. S., Markou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+in+breast+cancer:+detection+systems,+molecular+characterization,+and+future+challenges.">Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges.</a> Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).</li><li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells:+liquid+biopsy+of+cancer.">Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer.</a> Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).</li><li>Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+in+the+development+of+circulating+tumor+cell+technology+for+clinical+use.">Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use.</a> J. Transl. Med. 10, 138 (2012).</li><li>Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=User-defined+protein+marker+assay+development+for+characterization+of+circulating+tumor+cells+using+the+CellSearch+system.">User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system.</a> Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).</li><li>Fehm, T., M&#252;ller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+status+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+breast+cancer:+a+prospective,+multicenter+trial.">HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial.</a> Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).</li><li>Liu, Y., Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+in+HER2-positive+metastatic+breast+cancer+patients:+a+valuable+prognostic+and+predictive+biomarker.">Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker.</a> BMC Cancer. 13, 202 (2013).</li><li>Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chemotherapy+plus+a+monoclonal+antibody+against+HER2+for+metastatic+breast+cancer+that+overexpresses+HER2.">Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.</a> New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).</li><li>Marty, M., Cognetti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+phase+II+trial+of+the+efficacy+and+safety+of+trastuzumab+combined+with+docetaxel+in+patients+with+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-positive+metastatic+breast+cancer+administered+as+first-line+treatment:+the+M77001+study+group.">Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group.</a> J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).</li><li>Slamon, D., Eiermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+trastuzumab+in+HER2-positive+breast+cancer.">Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer.</a> New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).</li><li>Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+considerations+for+studying+cancer+metastasis+in+vivo.">Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo.</a> Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).</li><li>Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+tumor+cell+dissemination+patterns+in+preclinical+models+of+cancer+metastasis+using+flow+cytometry+and+laser+scanning+cytometry.">Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry.</a> Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).</li><li>Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+escape+from+EpCAM-based+detection+due+to+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition.</a> BMC Cancer. 12, 178 (2012).</li><li>Eliane, J. -. P., Repollet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+serial+changes+in+circulating+human+breast+cancer+cells+in+murine+xenograft+models.">Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models.</a> Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).</li><li>Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+yield+of+circulating+tumour+cells+facilitates+molecular+characterisation+and+recognition+of+discordant+HER2+amplification+in+breast.">Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast.</a> 102 (10), 1495-1502 (2010).</li><li>Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+circulating+tumor+cells+in+large+quantities+of+contaminating+leukocytes+by+a+multiplex+real-time+PCR.">Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR.</a> Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).</li><li>Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+circulating+tumor+cells+to+tumor+response,+progression-free+survival,+and+overall+survival+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer.">Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer.</a> J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).</li><li>Allard, W. J., Matera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).</li><li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139 (5), 871-890 (2009).</li><li>Yang, J., Weinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Epithelial-mesenchymal+transition:+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis.">A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).</li><li>Gradilone, A., Raimondi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+lacking+cytokeratin+in+breast+cancer:+the+importance+of+being+mesenchymal.">Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).</li><li>K&#246;nigsberg, R., Obermayr, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+EpCAM+positive+and+negative+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer+patients.">Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients.</a> Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).</li><li>Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+markers+in+primary+breast+cancer+patients+with+circulating+tumor+cells.">Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells.</a> Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).</li><li>Mego, M., Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-inducing+transcription+factors+in+primary+breast+cancer:+The+effect+of+neoadjuvant+therapy.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy.</a> Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).</li><li>Yu, M., Bardia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition.">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li><li>Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+patients+with+advanced+prostate+and+breast+cancer+display+both+epithelial+and+mesenchymal+markers.">Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers.</a> Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).</li></ol>

Til tross for utviklingen av mange nye CTC teknologier siden innføringen av CSS i 2004, er denne teknikken fortsatt den eneste klinisk godkjent teknologien på markedet i dag, og derfor er det anses dagens gullstandard for CTC deteksjon og telling. Dette manuskriptet har vist at selv om CSS har strenge kvalitetskontroll standarder kan det være gjenstand for fortolkning skjevhet og at CTC identifikasjon i pasientprøver er mye forskjellig fra identifikasjon i piggete prøver. Det ble identifisert seks kategorier av all...

I 2013 er det anslått at 580 350 personer vil dø av kreft og at 1.660.290 nye tilfeller av denne sykdommen vil bli diagnostisert i USA alene en. De fleste av disse dødsfallene skjer i etterkant av utviklingen av metastatisk sykdom to. Dagens mangel på effektive behandlingsformer i behandling av metastaser og en begrenset forståelse av metastatisk kaskade gjør dette stadiet av sykdommen svært dødelig. Tilstedeværelsen av sirkulerende tumorceller (CTCS) i blodet har blitt vist å korrelere med metastatisk sykdom 3.. Disse cellene er ekstremt sjeldne og deres oppdagelse er et tegn på total overlevelse i metastatisk brystkreft 4, prostata 5, og tykktarms 6 kreft. Hos disse pasientene ≥ 5 (bryst og prostata) eller ≥ 3 (kolorektal) CTCs i 7,5 ml blod er tilstedeværelsen av et tegn på dårligere prognose i forhold til pasienter med færre eller ingen påvisbare CTCs i same blodvolum. I tillegg, er endringen i CTC antall under eller etter terapeutisk intervensjon blitt vist å være nyttig som en prediktor for behandling respons, ofte raskere enn for tiden utnyttes teknikker 7-10. Det har blitt anslått at i metastatiske kreftpasienter, CTCs inntreffer med en frekvens på omtrent 1 CTC per 10 5 -10 7 blod mononukleære celler og hos pasienter med lokalisert sykdom, kan denne frekvensen bli enda lavere (~ 1 i 10 8). Den sjeldne natur av disse celler kan gjøre det vanskelig å nøyaktig og pålitelig detektere og analysere CTCs 11.. Flere metoder (gjennomgått tidligere 12-14) er blitt anvendt for å berike og detektere disse cellene ved å utnytte egenskaper som skiller dem fra omkring blodkomponenter. Generelt er CTC oppregning en prosess i to deler som krever både en berikelse trinn, og en deteksjonstrinn. Tradisjonelt berikelse trinn avhengige forskjeller i PhysiCal egenskaper CTCs (celle størrelse, tetthet, formbarhet) eller på protein markør uttrykk (dvs. epithelial celleadhesjonsmolekylet [EpCAM], cytokeratin [CK]). Etter anrikning kan CTC deteksjon utføres på en rekke forskjellige måter, den mest vanlige av disse er nukleinsyre-baserte analyser og / eller cytometriske metoder. Hver av disse strategiene er unike, har klare fordeler og ulemper, men de alle mangler standardisering, en nødvendighet for inngangen til klinisk setting. Den CellSearch system (CSS) ble derfor utviklet for å gi en standardisert metode for påvisning og telling av sjeldne CTCs i menneskelig blod ved hjelp av fluorescens mikroskopi og antistoffbaserte teknikker 4-6. Denne plattformen er for tiden regnet som gullstandarden i CTC oppregning og er den eneste teknikken godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for bruk i klinikken 15. CSS er en to-komponent plattform consisting, (1) den CellTracks AutoPrep system (heretter referert til som preparat instrument), som automatiserer fremstilling av humane blodprøver, og (2) den CellTracks Analyzer II (heretter referert til som analyseapparatet), som skanner disse prøver følgende forberedelser. For å skille CTCs forurenser leukocytter utarbeidelse instrument sysselsetter et antistoff mediert, ferrofluid basert magnetisk separasjon tilnærming og differensial fluorescensbeising. I utgangspunktet etiketter systemet CTCs bruker anti-EpCAM antistoffer konjugert til jern nanopartikler. Prøven blir deretter inkubert i et magnetisk felt, og alle umerkede celler blir aspirert. Valgte tumorceller blir resuspendert og inkubert i en differensial fluorescens beis, som består av fluorescensmerket-merkede antistoffer og en nukleær farging reagens. Til slutt blir prøven overført til en magnetisk patron, kalt en MagNest (heretter referert til som den magnetiske enhet), og scanned ved hjelp av analyseinstrumentet. Analysen instrument blir brukt til å skanne preparerte prøver ved bruk av forskjellige fluorescens-filtre, hvert er optimalisert til passende fluorescerende partikler, ved hjelp av et 10X objektiv. CTCs er identifisert som celler som er bundet av anti-EpCAM, anti-pan-CK-fysoerytrin (PE) (CK8, 18, og 19), og den kjernefysiske beis 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Omvendt er forurensende leukocytter identifisert som celler som er bundet ved anti-CD45-allophycocyanin (APC) og DAPI. Etter skanning, er datadefinerte potensielle kreftceller presenteres for brukeren. Fra disse bildene, må brukeren benytte kvalitativ analyse ved hjelp av de definerte parametere og differensialfarging diskutert ovenfor for å bestemme hvilke hendelser er CTCs. I tillegg til å gi en standardisert metode for CTC oppregning, gjør at CSS for molekylær karakterisering av CTCs basert på protein markører av interesse. Dette avhør cen bli utført på enkeltcelle-nivå, ved hjelp av et fluorescein isothiocyanat (FITC) fluorescens-kanalen ikke er nødvendig for identifikasjon CTC 16.. Selv om denne plattformen gir kapasitet for molekylær karakterisering, den detaljerte prosessen med protokoll utvikling og optimalisering er ikke godt definert. Tre kommersielt tilgjengelige markører er blitt utviklet av fabrikanten for anvendelse med CSS, inkludert epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR), human epidermal vekstfaktor-reseptor-2 (HER2) og insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF-1R). HER2 analyse, i kombinasjon med CSS, har blitt benyttet av flere grupper for å illustrere potensialet for CTC karakterisering å informere kliniske beslutninger og å potensielt endre eksisterende retningslinjer for behandling. For eksempel, Fehm et al. 17 viste at om lag en tredel av brystkreftpasienter med HER2-primære svulster hadde HER2 + CTCs. I tillegg, Liu et al.18 nylig rapportert at opptil 50% av pasienter med henne + metastatisk brystkreft ikke har HER2 + CTCs. Herceptin, en HER2 reseptor forstyrrer monoklonalt antistoff viste til stor nytte pasienter med tumorer uttrykke tilstrekkelig nivå av HER2, er en ofte benyttet behandling for pasienter med HER2 + primære svulster 19-21. Men disse studiene tyder på at Herceptin kan være sub-optimalt utnyttet og at CTC karakterisering kan hjelpe til å forutsi behandlingsrespons. I siste instans kan CTC karakterisering har potensial til å forbedre personlig omsorg. CTC forskning er unik i at det har i stor grad benyttet en sengekanten-til-bord tilnærming. Denne metoden, i motsetning til stasjonære maskiner til sengen forskning, noe som ofte kan ta år å påvirke pasientbehandlingen, har tillatt CTCs rask inntreden i klinisk setting. Men leger er nølende til å bruke resultater fra CTC analyse i pasientbehandling beslutningsing på grunn av en manglende forståelse av deres underliggende biologi. Derfor egnede prekliniske musemodeller av metastasering og utfyllende CTC analyseteknikker må utnyttes for å undersøke disse utestående spørsmålene. Generelt er det to typer av prekliniske modeller som brukes for å studere metastatisk kaskade, (1) spontan metastase modeller, som gir mulighet for studiet av alle trinnene i den metastatisk kaskade, og (2) eksperimentelle metastase modeller, som kun tillater studiet av de senere trinn i prosessen slik som metastatisk ekstravasasjon og sekundær tumordannelse 22.. Spontane metastase modeller, involvere tumorcelle injeksjoner i egnede ortotopiske steder (f.eks injeksjon av prostata kreft celler i prostatakjertelen for studiet av prostatakreft). Celler blir deretter gitt tid til å danne primære tumorer og spontant metastasere til sekundære steder som ben, lunge, og lymfeknuter. Ikontrast, eksperimentelle metastase modeller bære direkte injeksjon av kreftceller i blodet (f.eks via halen blodåre eller intrakardiell injeksjon for å målrette celler til bestemte steder), og dermed hoppe over de første trinnene av intravasation og formidling til sekundære organer 22. Så langt de fleste av CTC analyse i in vivo modellsystemer har blitt utført ved hjelp av enten cytometry-baserte 23 eller tilpasset menneskebasert CTC teknikker (f.eks AdnaTest) 24. Selv nyttig, ingen av disse teknikkene tilstrekkelig reflektere CTC oppregning hjelp gullstandarden CSS. Basert på klinisk godkjenning, standardisert natur, og utbredt bruk av CSS, vil utviklingen av en CTC-fangst og påvisning teknikk for in vivo modellering som benytter tilsvarende prøveopparbeidelse, prosessering, og identifikasjonskriterier være en fordel som resultatene ville være sammenlignbare med de hentet fra pasientprøver. Imidlertid, på grunn av volumet requirements i preparatet instrumentet er det ikke mulig å bearbeide små mengder blod ved hjelp av denne automatiske plattformen. . I tillegg har tidligere arbeidet ved Eliane et al 25 viste at forurensning av prøver med musen epitelceller (som også oppfyller standarden CTC definisjon [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) kan føre til feilklassifisering av mus squamous epitelceller som CTCs. For å løse disse problemene en tilpasset teknikk som gjør at utnyttelse av CSS CTC kitreagenser kombinert med en manuell isolasjon prosedyren ble utviklet. Tilsetningen av et FITC-merket humant leukocyttantigen (HLA) antistoff til analysen tillater humane tumorceller som skal skilles fra mus squamous epitelceller. Dette manuskriptet beskriver standard, kommersielt utviklet og optimalisert CSS protokoll for behandling av pasientblodprøver og vanlige fallgruvene som kan oppstå, inkludert discrepant elementer som kan føre til CTC feilklassifisering feil. I tillegg blir tilpasning av CSS analyse for å undersøke brukerdefinerte protein karakteristikker av fangede CTCs og en tilsvar innrettet CSS teknikk som gjør det mulig for anriking og påvisning av CTCs fra små volumer av blod i prekliniske musemodeller av metastasering beskrevet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-FITC</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-PE</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human HLA-AlexaFluor488</td>
			<td style="width:175px;">BioLegend</td>
			<td style="width:161px;">311415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-mouse CD45-APC</td>
			<td style="width:175px;">eBioscience</td>
			<td style="width:161px;">17-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Bond Primary Antibody Diluent</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:161px;">AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:267px;">CellSave Preservative Tubes</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">952820 (20 pack)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 79100005 (100 pack)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900018RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900017RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Instrument Buffer</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7901003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Streck Cell Preservative (aka CytoChex)</td>
			<td style="width:175px;">Streck</td>
			<td>213350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">10 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1000&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1000&#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">12 x 75mm flow tubes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">200&#181;l gel loading tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">200&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">22 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">5 3/4&#34; disposible pasteur pipet</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">5 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Automated pipettor</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Capillary Blood Collection Tube (EDTA)</td>
			<td style="width:175px;">BD Microtainer</td>
			<td style="width:161px;">365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch Analyzer II</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9555</td>
			<td rowspan="2" style="width:188px;">Includes magnests and verification cartirdges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CellSearch AutoPrep System</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9541</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MagCellect Magnet&#160;</td>
			<td style="width:175px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:161px;">MAG997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Small Latex Bulb</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Vortex</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications

Flertallet av kreftrelaterte dødsfall forekommer i etterkant av utviklingen av metastatisk sykdom. Denne svært dødelig sykdom trinn er forbundet med nærværet av sirkulerende tumorceller (CTCS). Disse sjeldne celler har vist seg å være av klinisk betydning i metastatisk brystkreft, prostatakreft og kolorektal kreft. Dagens gullstandard i klinisk CTC deteksjon og telling er FDA-ryddet CellSearch system (CSS). Dette manuskriptet skisserer standard protokoll benyttes av denne plattformen, samt to ekstra tilpasset protokoller som beskriver den detaljerte prosessen med brukerdefinert markør optimalisering for protein karakterisering av pasient CTCs og en tilsvarende protokoll for CTC-fangst på svært lave volumer av blod, ved hjelp av standard CSS reagenser, for å studere i vivo prekliniske musemodeller av metastasering. I tillegg forskjeller i CTC kvalitet mellom frisk donor blod tilsatt celler fra vev kultur versus pasient blod SAMPles er uthevet. Til slutt, er flere vanlige avvik elementer som kan føre til CTC feilklassifisering feil skissert. Til sammen vil disse protokollene gi en nyttig ressurs for brukere av denne plattformen interessert i preklinisk og klinisk forskning knyttet til metastasering og CTCs.

Standard CTC Enumeration analysen Sensitiviteten og spesifisiteten av CSS er godt dokumentert i litteraturen. Men for å validere tilsvar CTC utvinning, piggete (1000 LNCAP menneskelig prostata kreft celler) og unspiked humane blodprøver fra friske frivillige givere ble behandlet på CSS ved hjelp av standard CSSCTC protokollen. Som forventet, unspiked prøvene var fri for CTCs, 0,00 ± 0,00%, og CTC utvinning ble vist å være 86,9 ± 4,71% for piggete prøver (Figur 1a). CSS...

Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications at JoVE.com

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Sirkulerende tumorceller (CTCs) er prognostisk i flere metastatisk kreft. Dette manuskriptet beskriver gullstandarden CellSearch system (CSS) CTC opplisting plattform og høydepunkter vanlige feilklassifisering feil. I tillegg er to tilpasset protokoller beskrevet for brukerdefinert markør karakterisering av CTCs og CTC oppregning i prekliniske musemodeller av metastasering ved hjelp av denne teknologien.

Tilpasning av semiautomated Sirkulasjons Tumor Cell (CTC) Analyser for klinisk og preklinisk forskning Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Generering av Alginat Mikrokuler for biomedisinske applikasjoner

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Behandling av primær hjernesvulst Tissue for Stem Cell Assays og Flow Sortere

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Pasient avledet celle Kultur og Isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Antatte kreft stamceller fra melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MR for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Gene Transfer Teknikk og<em&gt; In vitro</em&gt; Cell Based Analyser for studier av bentap i Muskel-og skjelettplager

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolasjon, Kryopreservering og kultur menneskerettighets amnion Epitelceller for kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Ex Vivo Treatment Response av primære svulster og / eller Associated metastaser for preklinisk og klinisk utvikling av legemiddel

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolasjon og forplantning av sirkulerende tumorceller fra en mus Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Generering av Prostate Cancer Patient Avledet xenotransplantat Modeller fra Sirkulasjonstumorceller

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

PCI kontrast Echocardiography-guidede Intramyocardial injeksjon og celle levering i en stor prekliniske modell

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...