Name: adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications
Uploaded: 2014-02-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag från Ontario Institute of Cancer Research (# 08NOV230), Canada Foundation for Innovation (# 13199), prostatacancer Kanada, Janssen Oncology, London Regional Cancer Program, och givarstödet från John och Donna Bristol genom London Health Sciences Foundation (till ALA). LEL är uppburen av en Frederick Banting och Charles Best Kanada Graduate Scholarship Doctoral Award. ALA stöds av en CIHR New Investigator Award och en tidig forskare Award från Ontario ministeriet för forskning och innovation.

Alla studier på människa som beskrivs i detta manuskript utfördes under protokoll som godkänts av Western University s Human forskningsetik Board. Samtliga Djurstudier har utförts i enlighet med rekommendationerna från det kanadensiska rådet om Animal Care, enligt protokoll som godkänts av Western University Animal Användning utskottet. 1. Standard CTC Uppräkning från patientblodprover med CSS 1. Människoblod Provtagning och förberedelse för bearbetning ...

<ol>
	<li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> 63 (1), 11-30 (2013).</li><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li><li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metastatic+cascade.">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nat. Rev. Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).</li><li>Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells,+disease+progression,+and+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).</li><li>De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li><li>Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer.">Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.</a> Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).</li><li>Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+at+each+follow-up+time+point+during+therapy+of+metastatic+breast+cancer+patients+predict+progression-free+and+overall+survival.">Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival.</a> Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).</li><li>Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+versus+imaging--predicting+overall+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer.</a> Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).</li><li>Olmos, D., Arkenau, H. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cell+(CTC)+counts+as+intermediate+end+points+in+castration-resistant+prostate+cancer+(CRPC):+a+single-centre+experience.">Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience.</a> Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).</li><li>De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li><li>Allan, A. L., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+analysis:+technical+and+statistical+considerations+for+application+to+the+clinic.">Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic.</a> J. Oncol. 2010, 426218 (2010).</li><li>Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+cytometry+analysis+of+circulating+tumor+cells.">Image cytometry analysis of circulating tumor cells.</a> Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).</li><li>Lianidou, E. S., Markou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+in+breast+cancer:+detection+systems,+molecular+characterization,+and+future+challenges.">Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges.</a> Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).</li><li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells:+liquid+biopsy+of+cancer.">Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer.</a> Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).</li><li>Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+in+the+development+of+circulating+tumor+cell+technology+for+clinical+use.">Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use.</a> J. Transl. Med. 10, 138 (2012).</li><li>Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=User-defined+protein+marker+assay+development+for+characterization+of+circulating+tumor+cells+using+the+CellSearch+system.">User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system.</a> Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).</li><li>Fehm, T., M&#252;ller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+status+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+breast+cancer:+a+prospective,+multicenter+trial.">HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial.</a> Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).</li><li>Liu, Y., Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+in+HER2-positive+metastatic+breast+cancer+patients:+a+valuable+prognostic+and+predictive+biomarker.">Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker.</a> BMC Cancer. 13, 202 (2013).</li><li>Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chemotherapy+plus+a+monoclonal+antibody+against+HER2+for+metastatic+breast+cancer+that+overexpresses+HER2.">Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.</a> New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).</li><li>Marty, M., Cognetti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+phase+II+trial+of+the+efficacy+and+safety+of+trastuzumab+combined+with+docetaxel+in+patients+with+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-positive+metastatic+breast+cancer+administered+as+first-line+treatment:+the+M77001+study+group.">Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group.</a> J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).</li><li>Slamon, D., Eiermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+trastuzumab+in+HER2-positive+breast+cancer.">Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer.</a> New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).</li><li>Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+considerations+for+studying+cancer+metastasis+in+vivo.">Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo.</a> Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).</li><li>Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+tumor+cell+dissemination+patterns+in+preclinical+models+of+cancer+metastasis+using+flow+cytometry+and+laser+scanning+cytometry.">Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry.</a> Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).</li><li>Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+escape+from+EpCAM-based+detection+due+to+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition.</a> BMC Cancer. 12, 178 (2012).</li><li>Eliane, J. -. P., Repollet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+serial+changes+in+circulating+human+breast+cancer+cells+in+murine+xenograft+models.">Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models.</a> Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).</li><li>Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+yield+of+circulating+tumour+cells+facilitates+molecular+characterisation+and+recognition+of+discordant+HER2+amplification+in+breast.">Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast.</a> 102 (10), 1495-1502 (2010).</li><li>Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+circulating+tumor+cells+in+large+quantities+of+contaminating+leukocytes+by+a+multiplex+real-time+PCR.">Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR.</a> Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).</li><li>Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+circulating+tumor+cells+to+tumor+response,+progression-free+survival,+and+overall+survival+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer.">Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer.</a> J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).</li><li>Allard, W. J., Matera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).</li><li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139 (5), 871-890 (2009).</li><li>Yang, J., Weinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Epithelial-mesenchymal+transition:+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis.">A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).</li><li>Gradilone, A., Raimondi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+lacking+cytokeratin+in+breast+cancer:+the+importance+of+being+mesenchymal.">Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).</li><li>K&#246;nigsberg, R., Obermayr, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+EpCAM+positive+and+negative+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer+patients.">Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients.</a> Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).</li><li>Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+markers+in+primary+breast+cancer+patients+with+circulating+tumor+cells.">Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells.</a> Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).</li><li>Mego, M., Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-inducing+transcription+factors+in+primary+breast+cancer:+The+effect+of+neoadjuvant+therapy.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy.</a> Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).</li><li>Yu, M., Bardia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition.">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li><li>Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+patients+with+advanced+prostate+and+breast+cancer+display+both+epithelial+and+mesenchymal+markers.">Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers.</a> Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).</li></ol>

Trots utvecklingen av många nya CTC teknik sedan införandet av CSS i 2004, är denna teknik fortfarande den enda kliniskt godkänd teknik på marknaden idag, och därför anses den nuvarande standarden för CTC upptäckt och kvantifiering. Detta manuskript har visat att även om CSS har rigorösa kvalitetskontroll kan det vara föremål för tolkning partiskhet och att CTC identifikation i patientprover är mycket annorlunda från identifiering i spetsade prover. Sex kategorier av allmänt avvikande poster identifiera...

År 2013 beräknas det att 580.350 personer kommer att dö i cancer och att 1.660.290 nya fall av denna sjukdom kommer att diagnostiseras i USA ensamt 1. De flesta av dessa dödsfall inträffar efter utveckling av metastatisk sjukdom 2. Den nuvarande bristen på effektiva behandlingar vid behandling av metastaser och en begränsad förståelse för metastaserande kaskad gör detta skede av sjukdomen mycket dödlig. Förekomsten av cirkulerande tumörceller (CTCs) i blodomloppet har visat sig korrelera med metastaserad sjukdom 3. Dessa celler är extremt sällsynta och deras upptäckt är ett tecken på total överlevnad vid metastaserande bröstcancer 4, prostata 5, och kolorektal 6 cancer. Hos dessa patienter, ≥ 5 (bröst och prostata) eller ≥ 3 (kolorektal) CTCs i 7,5 ml blod är förekomsten av tecken på sämre prognos jämfört med patienter med färre eller inga detekterbara CTCs i same blodvolym. Dessutom har förändringen av CTC antal under eller efter terapeutisk behandling visat sig vara användbar som en prediktor för behandlingssvar, ofta tidigare än för närvarande utnyttjas tekniker 7-10. Det har uppskattats att det i metastaser cancerpatienter, CTCs inträffar med en frekvens på ca 1 CTC per 10 5 -10 7 mononukleära blodceller och hos patienter med lokaliserad sjukdom, kan denna frekvens vara ännu lägre (~ 1 i 10 8). Den sällsynta karaktären av dessa celler kan göra det svårt att exakt och pålitligt upptäcka och analysera CTCs 11. Flera metoder (omdömet tidigare 12-14) har använts för att berika och upptäcka dessa celler genom att utnyttja egenskaper som skiljer dem från omgivande blodkomponenter. I allmänhet är CTC uppräkning en process i två delar som kräver både en anrikningssteg och ett detekteringssteg. Traditionellt anrikningssteg är beroende av skillnader i fystiska egenskaper CTCs (cellstorlek, densitet, deformerbarhet) eller på proteinmarkör expression (dvs. epitelial celladhesionsmolekyl [EpCAM], cytokeratin [CK]). Efter anrikning kan CTC detektering utföras på ett antal olika sätt, är den vanligaste av dessa är nukleinsyra-baserade analyser och / eller cytometrisk tillvägagångssätt. Var och en av dessa strategier är unika, med olika fördelar och nackdelar, men de alla saknar standardisering, en nödvändighet för inträde i klinisk miljö. Den Cellsearch systemet (CSS) har därför utvecklats för att ge en standardiserad metod för detektion och räkning av sällsynta CTCs i blod med hjälp av fluorescensmikroskopi och antikroppsbaserade metoder 4-6. Denna plattform är för närvarande anses vara den högsta standarden inom CTC uppräkning och är den enda teknik som godkänts av US Food and Drug Administration (FDA) för användning i kliniken 15. CSS är en tvåkomponents plattform consisting, (1) den CellTracks autoprep.-systemet (nedan kallad framställning instrument), som automatiserar framställning av humana blodprov, och (2) den CellTracks Analyzer II (i det följande kallad analys instrument), som läser av dessa prov efter beredning. För att skilja CTCs förorenar leukocyter beredningen Instrumentet är en antikroppsmedierad, ferrofluid baserad magnetisk separation strategi och differentialfluorescensfärgning. Initialt märker systemet CTCs använda anti-EpCAM antikroppar konjugerade till järn nanopartiklar. Provet inkuberas sedan i ett magnetfält, och alla omärkta celler aspireras. Valda tumörcellerna återsuspenderas och inkuberas i en differential fluorescens fläck, som består av fluorescensmärkta antikroppar och en nukleär färgning reagens. Slutligen provet överfördes till en magnetisk patron, som kallas en MagNest (hädanefter kallad den magnetiska anordningen) och scanned använder analysinstrumentet. Analysinstrumentet används för att skanna framställda proverna med användning av olika fluorescensfilter, vart och ett optimerat för att den lämpliga fluorescerande partikel, med användning av ett 10X objektiv. CTCs identifieras som celler som är bundna av anti-EpCAM, anti-pan-CK-fykoerytrin (PE) (CK8, 18, och 19), och den nukleära fläck 4 &#39;,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Omvänt är kontaminerande leukocyter identifierade som celler som är bundna av anti-CD45-allofykocyanin (APC) och DAPI. Efter skanning, är datordefinierade potentiella tumörceller presenteras för användaren. Från dessa bilder, måste användaren använda kvalitativ analys med hjälp av de definierade parametrar och differentialfärgning som diskuterats ovan för att bestämma vilka händelser är CTCs. Förutom att ge en standardiserad metod för CTC räkning, gör CSS för molekylär karakterisering av CTCs baserad på proteinmarkörer av intresse. Detta förhör cen utförs vid encelliga nivå, med användning av en fluorescein-isotiocyanat (FITC) i fluorescenskanal krävs inte för CTC identifiering 16. Även denna plattform ger kapaciteten för molekylär karakterisering, den detaljerade processen för protokollutveckling och optimering är inte väldefinierad. Tre kommersiellt tillgängliga markörer har utvecklats av tillverkaren för användning med CSS, inklusive epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR), human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2 (HER2) och insulin-liknande tillväxtfaktor 1-receptor (IGF-1R). HER2-analys i kombination med CSS, har utnyttjats av flera grupper för att belysa potentialen för CTC karakterisering att informera kliniskt beslutsfattande och att eventuellt ändra befintliga behandlingsriktlinjer. Exempelvis Fehm et al. 17 visade att ungefär en tredjedel av bröstcancerpatienter med HER2-primära tumörer hade HER2 + CTCs. Dessutom Liu et al.18 rapporterade nyligen att upp till 50% av patienter med HER + metastaserad bröstcancer inte hade HER2 + CTCs. Herceptin, en HER2-receptorn störande monoklonal antikropp visat att kraftigt gynna patienter vars tumörer uttrycker tillräckliga nivåer av HER2, är en vanligen använd behandling för patienter med HER2 + primära tumörer 19-21. Dessa studier tyder på att Herceptin kan vara sub-utnyttjas optimalt och att CTC karakterisering kan hjälpa till att förutsäga behandlingssvar. I slutändan kan CTC karakterisering har potential att förbättra personlig vård. CTC forskning är unikt genom att det i stort sett utnyttjat en säng-till-bänk strategi. Denna metod, till skillnad från bänk till sängen forskning, som ofta kan ta år att påverka patientvården, har gjort CTCs snabbt inträde i klinisk miljö. Men läkarna är tveksamma till att använda resultaten från CTC-analys i patientbehandling beslutsfattning på grund av en brist på förståelse för den underliggande biologin. Därför lämpliga prekliniska musmodeller av metastaser och kompletterande CTC analystekniker måste utnyttjas för att undersöka dessa utestående frågor. Generellt finns det två typer av prekliniska modeller som används för att studera metastaser kaskad, (1) spontan metastaser modeller, som möjliggör studier av alla steg i metastaserande kaskad, och (2) experimentella metastaser modeller, som endast tillåter studiet av senare steg i metastaserande process, såsom extravasation och sekundära tumörbildning 22. Spontan metastas modeller, involverar tumörcellinjektioner i lämpliga orthotopic platser (t.ex. insprutning av prostatacancerceller i prostatakörteln för studien av prostatacancer). Cellerna ges sedan tid att bilda primära tumörer och spontant metastasera till sekundära platser såsom ben, lungor och lymfkörtlar. IDäremot experimentella metastaser modeller innebär direkt injektion av tumörceller i blodet (t.ex. via svansvenen eller intrakardiell injektion till målceller till specifika platser) och därmed hoppa över de inledande stegen i intravasation och spridning till sekundära organ 22. Hittills majoriteten av CTC-analys i in vivo modellsystem har utförts med hjälp av antingen cytometry-baserade 23 eller anpassade CTC tekniker mänskliga baserade (t.ex. AdnaTest) 24. Även användbar, ingen av dessa tekniker återspeglar adekvat CTC uppräkning med hjälp av guldmyntfoten CSS. Baserat på den kliniska godkännande, standardiserad karaktär, och utbredd användning av CSS, skulle utvecklingen av en CTC fånga och upptäcka teknik för in vivo-modeller som använder provberedning motsvarande, bearbetning, och kriterier för identifiering vara fördelaktigt eftersom resultaten skulle vara jämförbara med dem erhölls från patientprover. Men på grund av den volym requirements av preparatets instrument är det inte möjligt att behandla små volymer av blod med hjälp av denna automatiserad plattform. . Dessutom har tidigare arbetet med Eliane et al 25 visade att kontaminering av prover med musen epitelceller (som också uppfyller standarden CTC definition [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) kan leda till felaktig klassificering av mus skivepitelcancer epitelceller som CTCs. För att hantera dessa frågor en anpassad teknik som möjliggör utnyttjandet av CSS CTC kitreagenser i kombination med en manuell isoleringsförfarande utvecklades. Tillsättning av en FITC-märkt human leukocyt antigen (HLA) antikroppen till analysen möjliggör humana tumörceller som skall särskiljas från mus skvamösa epitelceller. Detta manuskript beskriver standard kommersiellt utvecklats och optimerats CSS protokoll för bearbetning av patientens blodprov och vanliga fallgropar som kan uppstå, inklusive discrepant ex som kan leda till CTC klassificeringsfel fel. Dessutom är anpassning av CSS-analysen för att undersöka användardefinierade proteinegenskaper fångade CTCs och jämförbar anpassade CSS-teknik som gör det möjligt för anrikning och detektion av CTCs från små volymer av blod i prekliniska djurmodeller för metastaser beskrivs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-FITC</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-PE</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human HLA-AlexaFluor488</td>
			<td style="width:175px;">BioLegend</td>
			<td style="width:161px;">311415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-mouse CD45-APC</td>
			<td style="width:175px;">eBioscience</td>
			<td style="width:161px;">17-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Bond Primary Antibody Diluent</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:161px;">AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:267px;">CellSave Preservative Tubes</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">952820 (20 pack)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 79100005 (100 pack)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900018RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900017RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Instrument Buffer</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7901003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Streck Cell Preservative (aka CytoChex)</td>
			<td style="width:175px;">Streck</td>
			<td>213350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">10 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1000&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1000&#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">12 x 75mm flow tubes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">200&#181;l gel loading tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">200&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">22 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">5 3/4&#34; disposible pasteur pipet</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">5 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Automated pipettor</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Capillary Blood Collection Tube (EDTA)</td>
			<td style="width:175px;">BD Microtainer</td>
			<td style="width:161px;">365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch Analyzer II</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9555</td>
			<td rowspan="2" style="width:188px;">Includes magnests and verification cartirdges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CellSearch AutoPrep System</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9541</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MagCellect Magnet&#160;</td>
			<td style="width:175px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:161px;">MAG997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Small Latex Bulb</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Vortex</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications

Huvuddelen av cancerrelaterade dödsfall inträffar efter utveckling av metastatisk sjukdom. Denna mycket dödlig sjukdom steg är förknippat med förekomsten av cirkulerande tumörceller (CTCs). Dessa sällsynta celler har visat sig vara av klinisk signifikans i metastaserande bröst-, prostata-och kolorektal cancer. Den nuvarande guldmyntfot i klinisk CTC detektering och räkning är FDA-godkänt Cellsearch systemet (CSS). Detta manuskript beskriver standardprotokoll som används av denna plattform samt ytterligare två anpassade protokoll som beskriver den detaljerade processen för användardefinierad markör optimering för proteinkarakterisering av patient CTCs och ett jämförbart protokoll för CTC fånga i mycket låga volymer av blod, med vanliga CSS-reagens, för att studera in vivo prekliniska musmodeller av metastaser. Dessutom kan skillnader i CTC kvalitet mellan frisk givare blod spetsades med celler från vävnadskultur kontra patientblod samples är markerade. Slutligen, finns flera allmänt avvikande poster som kan leda till CTC klassificeringsfel fel beskrivs. Sammantaget kommer dessa protokoll utgör en användbar resurs för användare av denna plattform är intresserade av preklinisk och klinisk forskning avseende metastaser och CTCs.

Standard CTC Enumeration Assay Känsligheten och specificiteten hos CSS är väl dokumenterade i litteraturen. Men för att validera motsvarande CTC återhämtning, spetsade (1.000 LNCaP mänskliga prostatacancerceller) och ospetsade humana blodprover från friska frivilliga givare behandlades på CSS med hjälp av standard CSSCTC protokollet. Som väntat ospetsade prover var fria från CTCs, 0,00 ± 0,00%, och CTC återhämtning visade sig vara 86,9 ± 4,71% för spetsade prover (Figur...

Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications at JoVE.com

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Cirkulerande tumörceller (CTCs) är prognostiska i flera metastaserande cancer. Detta manuskript beskriver guldmyntfoten Cellsearch systemet (CSS) CTC uppräkning plattform och höjdpunkter gemensamma klassificeringsfel fel. Dessutom är två anpassade protokoll beskrivs för användardefinierad markör karakterisering av CTCs och CTC uppräkning i prekliniska musmodeller av metastaser med hjälp av denna teknik.

Anpassning av halvautomatiserad cirkulerande tumör Cell (CTC) Analyser för klinisk och preklinisk forskning Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Generering av alginatmikrosfärer för biomedicinska tillämpningar

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Behandling av primär hjärntumör Mjukpapper för analyser stamceller och Flow Sortering

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture och isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Förmodade Cancer stamceller från melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MRI för Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Gene Transfer Teknik och<em&gt; In vitro</em&gt; cellbaserade analyser för studier av benförlust i belastningsskador

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolering, Frysförvaring och kultur för mänskliga amnion epitelceller för kliniska tillämpningar

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Ex vivo Behandling svar av primära tumörer och / eller associerade Metastaser för preklinisk och klinisk utveckling av Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolering och förökning av cirkulerande tumörceller från en mus Cancer

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Generation av prostatacancer Patient Härstammar xenograft-modeller från cirkulerande tumörceller

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Perkutan kontrast ekokardiografi-guidad Intramyocardial injektion och Cell leverans i en stor preklinisk modell

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...