Name: a mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies
Uploaded: 2014-03-12T19:00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies at JoVE.c

Los autores desean que agradecerte Kim Yates, Eileen Franklin y Rebecca Tjepkema (Servicios de Cuidado Animal y Veterinaria, Universidad de Ottawa) para obtener ayuda con cirugías de animales. Lee Hwa-Tai es apoyado por un Fonds de recherche santé Quebec Fellowship. Esta labor fue apoyada por subvenciones de funcionamiento de la Innovación subvención del Instituto de Investigación de la Sociedad Canadiense del Cáncer, Ontario Ministerio Premio de Investigación y Desarrollo Temprano de Investigador, y la Fundación Canadiense para la Innovación - Beca de Oportunidad de Líder a Rebecca Auer.

1. El mantenimiento de 4T1 células tumorales in vitro <ol><li> Cultura sin modificar células tumorales 4T1 en DMEM completo (DMEM, 10% de FBS, 1x penicilina / estreptomicina) en placas de 10 cm de cultivo de tejidos. Incubar en 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultivo de tejidos. </li><li> Culturas Dividir 2-3 veces / semana. Para mantener las células óptimas de viabilidad no deben superar el 80% de confluencia. No utilizar las células para el establecimiento in vivo de tumores primarios si las culturas se han cultivado in vitro durante&gt; 1 mes, ya que esto disminuye la malignidad y el potencial metastásico de las células con pases antes. </li></ol> 2. Cosechando 4T1 células tumorales para inyección <ol><li> Aspirar el medio de cultivo de la placa de cultivo de tejidos usando una pipeta Pasteur. </li><li> Añadir 10 ml de PBS 1x estéril que contiene 2 ml de EDTA. Deje que la solución de PBS incubar la placa a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultivo de tejidos para 5-7 min. </li><li> Solución de PBS Cosecha de la placa, rinsing la placa de 2 a 3 veces con la solución, la transferencia a 15 ml tubo cónico. </li><li> Centrifugar las células durante 5 min a 500 xg, a 4 ° C, en una centrífuga de sobremesa. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en DMEM libre de suero. </li><li> Determinar la concentración de células utilizando un contador de células. </li><li> Diluir las células con medio libre de suero a 1x10 6 células/500 l (1x10 5 células/50 l (para células de inyección y colocar en hielo. </li></ol> 3. La inyección de ratones con células tumorales 4T1 Todos los estudios realizados en animales se encontraban en conformidad con las directrices institucionales a los Servicios Veterinarios de la Universidad de Ottawa recomendaciones de Cuidado Animal para todos los animales que recibieron inyecciones ortotópico o implantes tumorales. <ol><li> Tratar a los ratones por vía subcutánea con buprenorfina (0,05 mg / kg) 1 hora antes de la cirugía para el tratamiento del dolor. </li><li> Inducir y mantener ratón bajo anestesia con 2,5% de isoflurano durante la duración de la inyecciónción. Apriete la almohadilla plantar del ratón para detectar respuesta refleja. Si no se detecta ninguno, se alcanzan los niveles de anestesia eficaces. Lubricante ocular estéril se aplica a continuación, para prevenir el secado de la córnea. </li><li> Cargar un 30 G ½ en jeringa &quot;Ultra-fino&quot; precisamente con 50 l de células en suspensión. Asegúrese de que todas las burbujas de aire se retiran de la columna de la jeringa tocando el lado de la jeringa para desplazar las burbujas de aire. </li><li> Coloque el ratón (con anestesia) ventral hacia arriba. </li><li> Limpie el sitio de inyección con un algodón con alcohol e introducir la aguja en posición horizontal y directamente en la almohadilla de grasa mamaria cuarto, lentamente dispensar el volumen de la jeringa. </li><li> Use un hisopo de algodón para limpiar cualquier posible fuga. </li><li> Permitir que los ratones se recuperen de la anestesia. </li><li> Mantener buprenorfina (0,05 mg / kg) para el tratamiento del dolor se administra sc cada 8 horas durante 2 días. </li></ol> 4. La administración perioperatoria de Tratamiento en 4T1 Tumor Teniendo BALB / c ratones <ol><li> A 13 días de inyección de células post-tumor, medir el tumor primario utilizando un calibrador externo. Medir el diámetro mayor longitudinal (longitud) y el mayor diámetro transversal (anchura) con la pinza. La fórmula elipsoidal modificado se utiliza para calcular el volumen del tumor (volumen del tumor = 1/2 (longitud de un ancho 2) </li><li> A 13 días de inyección de células post-tumor, el tumor primario debe medir aproximadamente 1 cm 3. Cuando se alcanza esta medida del tumor, la preparación de reactivos terapia perioperatoria. </li><li> Virus oncolíticos es una terapéutica innovadora que se puede administrar en el período perioperatorio. Preparar virus oncolítico (1x10 9 PFU / 1 ml) en 1x PBS y lugar estéril en hielo antes de la inyección. </li><li> Ratón Secure y lugaren lo detiene por inyección en la vena de la cola intravenosa. </li><li> Calentar suavemente la cola del ratón en el agua caliente del grifo para visualizar las venas caudales laterales. </li><li> Cargar un 27 G ½ en &quot;Jeringa Insulina&quot; precisamente con 100 l de terapia virus oncolítico. Asegúrese de que todas las burbujas de aire se eliminan de la columna de la jeringa. </li><li> Inyectar el ratón con 1x10 8 ufp/100 l / ratón a una de las venas de la cola laterales. Si la aguja está correctamente insertado en una vena lateral, hay resistencia se debe sentir al pisar la jeringa. </li></ol> 5. La resección completa del tumor primario y la abdominal izquierdo Nefrectomía <ol><li> A los 14 días de inyección de células post-tumor, iniciar la atención perioperatoria rutina después de la Universidad de Ottawa y Cuidado de Animales Servicio Veterinario protocolos aprobados. Tratar a los ratones por vía subcutánea con buprenorfina (0,05 mg / kg) 1 hora antes de la cirugía para el tratamiento del dolor. Inducir y mantener la anestesia con 2,5% de isoflurano durante la cirugía. Under condiciones y el uso de instrumentos quirúrgicos estériles esterilizada, sitio quirúrgico se afeita y se ha borrado. Animales se administran líquidos por vía subcutánea y lubricante ocular antes de la cirugía. </li><li> Haga una pequeña incisión (1-2 cm de longitud) para eliminar suavemente y completamente la 4T1 tumor primario de la almohadilla de grasa mamaria. </li><li> Cierre la incisión con grapas 2-3 de 9 mm. </li><li> Exponer el abdomen por el corte a través de la piel y la capa subcutánea en la línea media ventral del ratón. </li><li> Hacer una incisión en la línea alba (3-4 cm) para acceder peritoneo del ratón. </li><li> Exponer el lado interior izquierdo del abdomen al mover los excrementos de superposición con el lado. Asegúrese de que los intestinos se mantienen húmedos con una solución salina estéril gasa embebida. </li><li> Con un par de pinzas quirúrgicas romo, sujete el riñón izquierdo con suavidad. </li><li> El uso de un revestido sutura de seda trenzada 3-0 cera atado en un lazo, ligar el hilio del riñón izquierdo y asegure con 3 nudos quirúrgicos. Retire el riñón izquierdo con quirúrgicatijeras de cal. </li><li> Inspeccione el lazo de sutura cuidadosamente para asegurar que se consigue una hemostasia adecuada. </li><li> Cierre la capa subcutánea con un lazo de sutura continua utilizando 5-0 trenzada absorbible capa de la piel, a continuación, utilizando grapas grapas 9 mm. Los pasos 5.2 a 5.10 deberán exigir 10 min / animal. </li><li> Mantener buprenorfina (0,05 mg / kg) para el tratamiento del dolor se administra sc cada 8 horas durante 2 días. </li></ol> 6. Ratones eutanasia y procesamiento y cuantificación de pulmón Tumor carga <ol><li> A los 28 días post 4T1 inyección del tumor, la eutanasia a los ratones de acuerdo al Cuidado Animal y Servicios Veterinarios de protocolo de la Universidad de Ottawa. </li><li> Rocíe de ratón con etanol al 70%. </li><li> Hacer incisión inicial con tijeras justo debajo de la caja torácica. </li><li> Exponga el tórax, cortando a través de la piel y la capa subcutánea en la línea media ventral de la cavidad torácica del ratón. </li><li> Hacer incisiones laterales a través de la piel y el tejido de cada lado hasta la neck del ratón. </li><li> Diseccionar los pulmones agarrando suavemente el pulmón, mientras que cortando el tejido conectivo de distancia por encima y por debajo de los pulmones. </li><li> Remoje extrae pulmones en PBS frío para eliminar restos de sangre, y echarlo en el 10% formalina tamponada. </li><li> Fotografiar cada pulmón para la evaluación de las metástasis tumorales. Pesar pulmones para la cuantificación de la carga tumoral. </li></ol>

<ol>
	<li>Tai, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+postoperative+metastatic+disease+by+inhibiting+surgery-induced+dysfunction+in+natural+killer+cells.">Preventing postoperative metastatic disease by inhibiting surgery-induced dysfunction in natural killer cells.</a> Cancer Res. 73, 97-107 (2013).</li><li>Seth, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+Stress+Promotes+the+Development+of+Cancer+Metastases+by+a+Coagulation-Dependent+Mechanism+Involving+Natural+Killer+Cells+in+a+Murine+Model.">Surgical Stress Promotes the Development of Cancer Metastases by a Coagulation-Dependent Mechanism Involving Natural Killer Cells in a Murine Model.</a> Ann. Surg. , (2012).</li><li>Shakhar, G., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+prophylactic+measures+against+postoperative+immunosuppression:+could+they+reduce+recurrence+rates+in+oncological+patients.">Potential prophylactic measures against postoperative immunosuppression: could they reduce recurrence rates in oncological patients.</a> Ann. Surg. Oncol. 10, 972-992 (2003).</li><li>Shiromizu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+laparotomy+and+laparoscopy+on+the+establishment+of+lung+metastasis+in+a+murine+model.">Effect of laparotomy and laparoscopy on the establishment of lung metastasis in a murine model.</a> Surgery. 128, 799-805 (2000).</li><li>Tsuchiya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+surgical+stress+promotes+tumor+metastasis.">Increased surgical stress promotes tumor metastasis.</a> Surgery. 133, 547-555 (2003).</li><li>Lanier, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cell+recognition.">NK cell recognition.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 225-274 (2005).</li><li>Espi, A., Arenas, J., Garcia-Granero, E., Marti, E., Lledo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+curative+surgery+on+natural+killer+cell+activity+in+colorectal+cancer.">Relationship of curative surgery on natural killer cell activity in colorectal cancer.</a> Dis. Colon Rectum. 39, 429-434 (1996).</li><li>Pollock, R. E., Lotzova, E., Stanford, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+surgical+stress+impairment+of+human+perioperative+natural+killer+cell+cytotoxicity.">Mechanism of surgical stress impairment of human perioperative natural killer cell cytotoxicity.</a> Arch. Surg. 126, 338-342 (1991).</li><li>Pollock, R. E., Lotzova, E., Stanford, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+stress+impairs+natural+killer+cell+programming+of+tumor+for+lysis+in+patients+with+sarcomas+and+other+solid+tumors.">Surgical stress impairs natural killer cell programming of tumor for lysis in patients with sarcomas and other solid tumors.</a> Cancer. 70, 2192-2202 (1992).</li><li>Ben-Eliyahu, S., Page, G. G., Yirmiya, R., Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+stress+and+surgical+interventions+promote+tumor+development+by+suppressing+natural+killer+cell+activity.">Evidence that stress and surgical interventions promote tumor development by suppressing natural killer cell activity.</a> Int. J. Cancer. 80, 880-888 (1999).</li><li>Page, G. G., Blakely, W. P., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+postoperative+pain+is+a+mediator+of+the+tumor-promoting+effects+of+surgery+in+rats.">Evidence that postoperative pain is a mediator of the tumor-promoting effects of surgery in rats.</a> Pain. 90, 191-199 (2001).</li><li>Glasner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+survival+rates+in+two+models+of+spontaneous+postoperative+metastasis+in+mice+by+combined+administration+of+a+beta-adrenergic+antagonist+and+a+cyclooxygenase-2+inhibitor.">Improving survival rates in two models of spontaneous postoperative metastasis in mice by combined administration of a beta-adrenergic antagonist and a cyclooxygenase-2 inhibitor.</a> J. Immunol. 184, 2449-2457 (2010).</li><li>Benish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+use+of+beta-blockers+and+COX-2+inhibitors+may+improve+immune+competence+and+reduce+the+risk+of+tumor+metastasis.">Perioperative use of beta-blockers and COX-2 inhibitors may improve immune competence and reduce the risk of tumor metastasis.</a> Ann. Surg. Oncol. 15, 2042-2052 (2008).</li><li>Goldfarb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+postoperative+immune+status+and+resistance+to+cancer+metastasis:+a+combined+perioperative+approach+of+immunostimulation+and+prevention+of+excessive+surgical+stress+responses.">Improving postoperative immune status and resistance to cancer metastasis: a combined perioperative approach of immunostimulation and prevention of excessive surgical stress responses.</a> Ann. Surg. 253, 798-810 (2011).</li><li>Tartter, P. I., Steinberg, B., Barron, D. M., Martinelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prognostic+significance+of+natural+killer+cytotoxicity+in+patients+with+colorectal+cancer.">The prognostic significance of natural killer cytotoxicity in patients with colorectal cancer.</a> Arch. Surg. 122, 1264-1268 (1987).</li><li>Fujisawa, T., Yamaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+tumor+killing+activity+as+a+prognostic+factor+in+primary+resected+nonsmall+cell+carcinoma+of+the+lung.">Autologous tumor killing activity as a prognostic factor in primary resected nonsmall cell carcinoma of the lung.</a> Cancer. 79, 474-481 (1997).</li><li>Guillot, B., Bessis, D., Dereure, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucocutaneous+side+effects+of+antineoplastic+chemotherapy.">Mucocutaneous side effects of antineoplastic chemotherapy.</a> Expert Opin. Drug Saf. 3, 579-587 (2004).</li><li>Deehan, D. J., Heys, S. D., Ashby, J., Eremin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-2+(IL-2)+augments+host+cellular+immune+reactivity+in+the+perioperative+period+in+patients+with+malignant+disease.">Interleukin-2 (IL-2) augments host cellular immune reactivity in the perioperative period in patients with malignant disease.</a> Eur. J. Surg. Oncol. 21, 16-22 (1995).</li><li>Houvenaeghel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+feasibility+of+perioperative+treatment+with+interferon-alpha+2a+in+advanced+cancers.">Tolerance and feasibility of perioperative treatment with interferon-alpha 2a in advanced cancers.</a> Int. Surg. 82, 165-169 (1997).</li><li>Klatte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+immunomodulation+with+interleukin-2+in+patients+with+renal+cell+carcinoma:+results+of+a+controlled+phase+II+trial.">Perioperative immunomodulation with interleukin-2 in patients with renal cell carcinoma: results of a controlled phase II trial.</a> Br. J. Cancer. 95, 1167-1173 (2006).</li><li>Oosterling, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+IFN-alpha+to+avoid+surgically+induced+immune+suppression+in+colorectal+cancer+patients.">Perioperative IFN-alpha to avoid surgically induced immune suppression in colorectal cancer patients.</a> Histol. Histopathol. 21, 753-760 (2006).</li><li>Tai, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+influenza+vaccination+reduces+post-operative+metastatic+disease+by+reversing+surgery-induced+dysfunction+in+natural+killer+cells.">Perioperative influenza vaccination reduces post-operative metastatic disease by reversing surgery-induced dysfunction in natural killer cells.</a> Clin Cancer Res. , (2013).</li></ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

La resección quirúrgica es el pilar de la terapia para los pacientes con tumores malignos sólidos localizados. Incluso con la resección completa, muchos pacientes desarrollan una recurrencia metastásica y en última instancia, mueren de su enfermedad. El postoperatorio inmediato proporciona un ambiente ideal para la formación de las metástasis del cáncer, modulada, en gran parte, por postoperatoria supresión de las células NK. A pesar de esto, sigue siendo una ventana terapéutica que es ignorado en gran medida. Actualmente no hay terapias contra el cáncer perioperatorias habituales para prevenir la metástasis postoperatorias. El reto actual es el de identificar terapias seguras y prometedoras que activan las células NK en el período perioperatorio evitando así la creación de micrometástasis. Estas terapias deben ser rigurosamente caracterizadas por la seguridad y la eficacia en modelos animales preclínicos y luego traducidos en ensayos clínicos cuidadosamente diseñados. La relación primarianale de desarrollar un modelo de tumor de ratón de estrés quirúrgico es explorar mecanismos de supresión inmune y la diseminación metastásica después de la cirugía y para evaluar inmunoterapias innovadoras con potencial para su uso futuro en pacientes con cáncer sometidos a cirugía para extirpar el tumor primario. Para lograr este objetivo, se ha desarrollado un modelo de carcinoma mamario murino 4T1 junto con el estrés quirúrgico. Mientras que la línea celular 4T1 es un murino &quot;carcinoma de mama&quot;, la razón de utilizar esta línea celular es la reproducibilidad de las metástasis espontáneas que nos permite evaluar los efectos del estrés quirúrgico en un modelo de cáncer realista. En este contexto, el origen real de la malignidad es menos importante que el potencial y la biología del tumor metastásico. El segundo componente crucial de nuestro modelo es el desarrollo de un procedimiento quirúrgico animal para parecerse mucho a la cirugía del cáncer humano. En este modelo el estrés quirúrgico animal, la principal 4T1 tumor de mama se extirpa después de que alcance 1 cm 3. Porquecirugías para el cáncer en pacientes humanos implican la supresión inmune significativa, una nefrectomía-abdomen abierto en los grupos de tratamiento de &quot;estrés quirúrgico&quot; se lleva a cabo de forma adicional. Como se compara con la resección del tumor más convencional en los seres humanos, la naturaleza invasiva de una nefrectomía izquierda completa es muy comparable a numerosos tipos de tratamientos quirúrgicos para tumores malignos sólidos, incluyendo la cirugía para el cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, de pulmón y de esófago cáncer. Además, podríamos argumentar que los profundos cambios fisiológicos que se producen durante el período perioperatorio, debido a laparotomía + nefrectomía, reproduce adecuadamente los cambios fisiológicos que se producen abrumadoras después de una cirugía invasiva para la mayoría de los tumores sólidos. Para el control de factores perioperatorios que podrían conducir a un estrés excesivo quirúrgica y la mortalidad, la duración de la anestesia y la cirugía y mantener la temperatura del cuerpo durante la cirugía se define con precisión. Todos estos parámetros son ejecutadas precisamente unad definida en el protocolo de la cirugía para reflejar la atención perioperatoria en los pacientes de cáncer humano. El momento de los tratamientos perioperatorias es un componente crítico adicional para el modelo de rescate perioperatorio. Ratones portadores de tumores 4T1 han sido tratados previamente con 3 regímenes de vacuna contra la influenza: neoadyuvante (dado 5 días antes de la cirugía), perioperatorio (administrado el mismo día de la cirugía) y perioperatoria + multidosis (dada en el día de la cirugía, seguidos de 2 dosis adicionales administran 5 días de diferencia). Sorprendentemente, los 3 modos de tratamiento vacuna redujo significativamente las metástasis pulmonares 22. Sin embargo, la vacuna contra la gripe administrada perioperatorio como una dosis única metástasis reducidas con mayor eficacia. Colectivamente, estos experimentos ponen de manifiesto la importancia del período perioperatorio inmediato como una ventana terapéutica estrecha para intervenir en el proceso metastásico. Uso perioperatorio de inmunoterapias innovadoras como oncolyvirus tic y vacunas exclusivamente se ha limitado a nuestro grupo de investigación. Hemos demostrado por primera vez que la administración perioperatoria de virus novela ORF oncolítico y vaccinia puede revertir la supresión de células NK después de la cirugía en modelos animales 1. Más importante aún, este rescate de la función inmune se correlaciona con una reducción en la formación postoperatoria de metástasis. En estudios en humanos, los pacientes de cirugía de cáncer postoperatorias habían reducido citotoxicidad de células NK y perioperatorio OV aumenta notablemente la actividad de las células NK en pacientes con cáncer 1. El uso de vacunas profilácticas disponibles comercialmente, hemos demostrado que la administración de la vacuna de la gripe perioperatoria redujo significativamente las metástasis tumorales y la mejora de la citotoxicidad de células NK en modelos de tumores preclínicos. En estudios en humanos, vacuna contra la influenza mejora de forma significativa la actividad de células NK en donantes humanos sanos y pacientes de cirugía de cáncer 22. Se utilizan muchos métodos para reducir la cancrecurrencia er, incluyendo la quimioterapia y la radiación, pero estas terapias se administran generalmente semanas o meses antes (neoadyuvante) o después (adyuvante) de la cirugía. La investigación en este campo demuestra que el postoperatorio inmediato es esencial para determinar las tasas de recurrencia tumoral a largo plazo. Por lo tanto, las intervenciones clínicas en forma de inmunoterapia durante este período crítico puede tener importantes beneficios a largo plazo. Nuestros estudios utilizando un modelo de ratón de la metástasis pulmonar espontánea y el estrés quirúrgico proporcionan una oportunidad única para explorar nuevos tratamientos y determinar su potencial para prevenir la inmunosupresión perioperatoria en los pacientes sometidos a cirugía de cáncer y por lo tanto también a reducir las tasas de recurrencia del cáncer.

La cirugía es un componente crítico en el tratamiento del cáncer curativo de los tumores sólidos, pero a pesar de la resección completa, muchos pacientes desarrollan una recurrencia metastásica y en última instancia, morir de su enfermedad. Cada vez más, el período postoperatorio, como resultado de la respuesta de estrés fisiológica a la cirugía, incluyendo la coagulación de la sangre, la liberación de factores de crecimiento, y la supresión inmune, se reconoce como tiempo crítico para el desarrollo de metástasis. Nuestra 1,2 grupo y otros 3-5 han demostrado que el período postoperatorio inmediato es un tiempo particularmente susceptibles para la formación de metástasis. Uno de los principales mecanismos responsables de los efectos prometastatic de la cirugía es la disfunción postoperatoria de células asesinas naturales (NK) 1-3. Las células NK son linfocitos citotóxicos del sistema inmune innato implicado en el control del crecimiento tumoral y metástasis 6. Disfunción de las células NK después de la cirugía se ha documentado in tanto pacientes humanos 1,7-9 y modelos animales 1,10,11. La supresión de células NK postoperatoria se correlaciona con un aumento de las metástasis en modelos animales de metástasis espontáneas e implantados 1,11-14, mientras que en los estudios en humanos, la baja actividad NK durante el período perioperatorio se asocia con una mayor tasa de recurrencia del cáncer y la mortalidad 15,16. A pesar de esto, no existen actualmente terapias contra el cáncer que tratan específicamente los cambios que se producen prometastatic inmediatamente después de la cirugía del cáncer. El período perioperatorio representa una ventana terapéutica de la oportunidad en la que intervenga en el proceso metastásico. Mientras que las terapias tradicionales contra el cáncer, como la quimioterapia citotóxica, se consideran demasiado tóxico para ser administrado a pacientes que se recuperan de una cirugía mayor 17, las terapias inmunes son candidatos ideales para la administración perioperatoria. Uso perioperatorio de ³ recombinante de IL-2 e IFN-I se han explorado in primera fase de ensayos clínicos que demuestran su potencial para prevenir el postoperatorio la supresión de las células NK y mejorar la supervivencia libre de progresión 18-21. Desafortunadamente, el desarrollo se ha visto obstaculizado por la tolerabilidad de esta terapia de citoquinas no específica combinada con cirugía mayor 17. Los virus son también activadores no específicos potentes de las células NK. Nuestra investigación ha demostrado previamente que la administración preoperatoria de reproducción de los virus, como la novela contra el cáncer Los virus oncolíticos (OV), y no se dividen las vacunas virales, como la vacuna contra la influenza, puede inhibir la inducida por la cirugía disfunción de las células NK y atenuar la enfermedad metastásica 1,22. El modelo quirúrgica descrita en este trabajo ha facilitado la comprensión de los mecanismos implicados en la propagación y el crecimiento de las células tumorales después de la cirugía y permitido explorar nuevas terapias que se pueden administrar en el período perioperatorio. Para lograr este objetivo, un animalmodelo de estrés quirúrgico y taco metástasis espontánea desarrollado. El modelo hace uso de los tumores de carcinoma de mama de ratón (BALB / c - 4T1) que son capaces de metástasis espontáneamente a partir de la glándula mamaria primaria a múltiples sitios distantes, en particular los pulmones. En el día 0, las células de cáncer de mama se implantan en la alfombrilla del ratón grasa del pecho. En el día 14 después de la implantación del tumor, una resección completa del tumor primario de mama se lleva a cabo en todos los animales. Un subconjunto de animales recibe el estrés quirúrgico adicional en la forma de una nefrectomía abdominal. En el día 28, los nódulos tumorales de pulmón en subrayaron quirúrgicamente y no hay control de los ratones de la cirugía en comparación son aislados y cuantificados. En este modelo animal de cáncer y la cirugía, se están estudiando los efectos de la cirugía de las metástasis del cáncer y de la eficacia de la administración perioperatoria de inmunoterapias innovadoras, incluyendo la reproducción y nonreplicating inmune-estimulantes basados ​​viralmente se prueban por primera vez.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:111px;">Corning Cell-Gro</td>
			<td style="width:153px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:111px;">HyClone</td>
			<td style="width:153px;">SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1X sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:111px;">Corning cell gro</td>
			<td style="width:153px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:111px;">Chiron, Guelph</td>
			<td style="width:153px;">RXN309968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:111px;">Baxter Corp</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1/2 ultra-fine syringe</td>
			<td style="width:111px;">Terumo</td>
			<td>30 Gauge, SS05M3009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">9mm staples</td>
			<td style="width:111px;">Braintree</td>
			<td style="width:153px;">ACS BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 braided absorbable suture</td>
			<td style="width:111px;">Covidien</td>
			<td style="width:153px;">UL-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3-0 wax braided silk suture</td>
			<td style="width:111px;">Covidien</td>
			<td style="width:153px;">S-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formalin</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td style="width:153px;">SF100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4T1 tumor cells</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:153px;">CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BALB/c</td>
			<td style="width:111px;">Charles Rivers Labs</td>
			<td style="width:153px;">Strain Code:028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies

La resección quirúrgica es un tratamiento esencial para la mayoría de los pacientes de cáncer, pero la cirugía induce la disfunción en el sistema inmune y esto se ha relacionado con el desarrollo de la enfermedad metastásica en modelos animales y en pacientes con cáncer. Trabajo preclínico de nuestro grupo y otros han demostrado una supresión profunda de la función inmune innata, específicamente las células NK en el período postoperatorio y esto juega un papel importante en el mayor desarrollo de las metástasis después de la cirugía. Relativamente pocos estudios en animales y ensayos clínicos han centrado en la caracterización y revertir los efectos perjudiciales de la cirugía del cáncer. El uso de un modelo animal rigurosa de los tumores de metástasis espontánea y estrés quirúrgico, se demostró la mejora de la cirugía del cáncer en el desarrollo de metástasis pulmonares. En este modelo, las células de cáncer de mama 4T1 se implantan en la almohadilla de grasa mamaria de ratón. En el día de la implantación del tumor 14 post, una resección completa del tumor primario de mama es Performed en todos los animales. Un subconjunto de animales recibe el estrés quirúrgico adicional en la forma de una nefrectomía abdominal. En el día 28, los nódulos tumorales de pulmón se cuantifican. Cuando la inmunoterapia se administra inmediatamente antes de la operación, se detectó una activación profunda de las células inmunes que impidió el desarrollo de las metástasis después de la cirugía. Mientras que el modelo de la cirugía del tumor de mama 4T1 permite la simulación de los efectos del estrés quirúrgico abdominal en las metástasis tumorales, su aplicabilidad a otros tipos de tumores tiene que ser probado. El reto actual es identificar inmunoterapias seguras y prometedoras en modelos preclínicos de ratón y de traducirlas en terapias perioperatorias viables que debe darse a los pacientes de cirugía de cáncer para prevenir la recurrencia de la enfermedad metastásica.

Un modelo reproducible ratón de estrés quirúrgico que resulta en la dramática mejora de las metástasis pulmonares se ha desarrollado. En el día 28 después de la inoculación tumoral 4T1 (y 14 días después de la resección del tumor + / - nefrectomía abdominal), se recogieron los pulmones y se visualizan para las metástasis. Cirugía aumenta claramente la cantidad de metástasis pulmonares en comparación con los ratones no tratados como se demuestra por las fotografías de pulmón (Figura 1A), enumeración de nódulos pulmonares (Figura 1B) y el peso de pulmón (Figura 1C). La administración preoperatoria de replicar el virus oncolítico y la vacuna antigripal inactivada rescata significativamente los efectos prometastatic de la cirugía del cáncer (Figuras 1A-C). Para determinar si las células NK juegan un papel mediador en la prevención de metástasis después de la vacuna de tratamiento, las células NK se agotaron farmacológicamente utilizando anti-asialo-GM-1 en el modelo de metástasis tumoral. En la ausencia de NKcélulas, se observó una abrogación del efecto terapéutico de inmunoterapias perioperatorios (Figuras 2A y 2B). Estos datos sugieren que la eliminación de metástasis tumorales en nuestro modelo de estrés quirúrgico está mediada principalmente a través de la activación de virus y la vacuna contra la gripe oncolítico de las células NK y la posterior lisis tumoral mediada por NK. Para caracterizar mejor la función de las células NK después de la administración perioperatoria de virus oncolítico y la vacuna contra la influenza, se evaluó ex vivo la muerte de células NK. Brevemente, se agruparon y ordenados DX5 + células NK se aislaron a partir de esplenocitos de subrayado quirúrgicamente y los ratones de control. Se co-cultivaron durante 4 horas con cromo marcado YAC-1 células diana, a diferentes relaciones de efector a diana, seguido por la medición de liberación de cromo sobrenadante con un contador gamma. Un defecto importante de la cirugía inducida en la citotoxicidad de células NK junto con una recuperación significativa de NK muerte después de la administración perioperatoria de virus oncolítico y influenza vacuna en comparación con la cirugía sola se observó (Figuras 2C y 2D). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que la supresión de células NK perioperatorio puede ser tratado con éxito y enfermedad metastásica reduce con nuevas terapias inmunoestimulantes. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51253/51253fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51253/51253fig1.jpg" /> Figura 1. Vacuna del virus de la gripe y Novel anti-cáncer oncolítico como terapia contra perioperatoria mejora inducida por la cirugía de las metástasis pulmonares. Evaluación de 4T1 metástasis de tumor de pulmón en el día 28 de los grupos de tratamiento se indica por (A) fotografías de los pulmones representativas, (B) de enumeración de tumor de pulmón nódulos y (C) pesos de los pulmones. Los datos son representativos de 3 experimentos similares con n = 5-10/group (*, p = 0,01; **, p &lt;0,0001;<html> ns, no significativo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51253/51253fig2.jpg" /> Figura 2. Estrés quirúrgico aumenta las metástasis tumorales pulmonares al dañar las células NK. (A, B) Cuantificación de las metástasis tumorales de pulmón en subrayó quirúrgicamente los ratones tratados con terapia nueva perioperatorio. (C, D) La capacidad de las células NK DX5 + purificados a partir de quirúrgicamente estresado y controles no tratados para matar las células tumorales. Los datos se muestran como la media por ciento (+ / - SD) de liberación de cromo de tres pozos para el correo indicado: T ratios. Los datos son representativos de 3 experimentos similares en los que n = 4-5/group (*, p = 0,01; **, p &lt;0,005; NS, no significativo)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies at JoVE.c

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Un modelo de tumor de ratón de estrés quirúrgico se utiliza para explorar la forma en la inmunosupresión postoperatoria promueve la enfermedad metastásica y para evaluar las terapias perioperatorias inmunoestimulantes.

Un modelo de tumor de Estrés quirúrgico para explorar los mecanismos de inmunosupresión postoperatoria y Evaluar Novel perioperatorias Inmunoterapias Ratón

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Método para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer utilizando explantes tumorales de las piezas quirúrgicas


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Investigación

Medicina

Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

Arresto normotérmica cardiaca y reanimación cardiopulmonar: un modelo de ratón de la lesión por isquemia-reperfusión

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused ...

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease

Desarrollo de una manera unilateral-lesionado 6-OHDA modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

El uso de modelos animales de sepsis para evaluar nuevas terapias a base de plantas

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Un nuevo enfoque quirúrgico para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en un modelo de ratón fetal

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

Una novela de alta resolución<em&gt; En vivo</em&gt; Técnica de escaneo para el Estudio de la respuesta dinámica de estructuras intracraneales al crecimiento del tumor y Terapéutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Inicio de la metástasis de carcinoma de mama mediante la Focalización del epitelio ductal con adenovirus Cre: Un modelo de ratón transgénico de Novela del Cáncer de Mama

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

A Novel Murine Model of Arteriovenous Fistula Failure: The Surgical Procedure in Detail

Un Modelo Murino novela de fístula arteriovenosa Fallo: El procedimiento quirúrgico en Detalle

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Usando In Vitro células vivas imágenes para explorar quimioterápicos entregado por nanopartículas basadas en lípidos

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...