Name: profiling of estrogen-regulated micrornas in breast cancer cells
Uploaded: 2014-02-21T14:30:00
Duration: 16 min 24 s
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Nous sommes reconnaissants au Dr Xiaolian Gao, de l&#39;Université de Houston, de fournir des conseils à la plate-forme de puces à ADN LC Sciences miARN, le Dr Karin Edvardsson, Institut Karolinska, en Suède, et le Dr Eylem Aydogdu, Université de Houston, pour partager leur expertise miARN . Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par le National Cancer Institute des National Institutes of Health en vertu Prix Nombre R01CA172437. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health. Ce travail a également été soutenu par des subventions du Texas Emerging Technology Fund, sous accord pas. 300-9-1958.

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Déterminer le mécanisme de la régulation hormonale de miARN dans les cellules de cancer du sein peut fournir une plate-forme pour la compréhension de cette maladie et peut fournir un traitement potentiel pour le cancer du sein. Culture de ces cellules pour fournir la condition optimale pour l&#39;action de l&#39;hormone est très important. Ici, un protocole qui permet de s&#39;assurer que l&#39;hormone d&#39;intérêt (œstrogène) a été exclue avant le traitement et que la dose optimale de l&#39;E2 a été utilisé pour un moment approprié au cours du traitement a été décrite. D&#39;autres effets hormonaux et des facteurs de croissance ont été maintenus à un minimum en diminuant progressivement les niveaux de sérum et en utilisant DCC-FBS, ce qui est FBS qui ont été dépouillé de la plupart de ses hormones, cytokines et facteurs de croissance. Phénol support exempt de rouge a été en outre utilisé pour minimiser d&#39;autres effets non hormonaux, étant donné que le rouge de phénol a été rapporté pour avoir une activité oestrogénique et affecter certaines fonctions dans des lignées cellulaires 20,21. Le temps d&#39;exposition des cellules à l&#39;hormone est d&#39;une grande importance. Pour la régulation de l&#39;oestrogène associé à des gènes, il a été précédemment montré que 24 hrexposure produire une réponse significative de gènes cibles directs dans des cellules de cancer du sein 1,18. Depuis miARN sont transcrits par l&#39;ARN polymérase II, comme ARNm, il est concevable que c&#39;est un point de temps convenable pour détecter la réglementation directe également des miARN. Il est encore à déterminer si et comment ces miRNAs affectent l&#39;expression de ces cibles connues ER dans les cellules cancéreuses du sein. miRNA profilage de l&#39;expression peut être difficile en raison de la taille relativement petite de la miRNA, le fait que la séquence miRNA mature peut être trouvé aussi dans le pri-miARN et la pré-miARN, et en raison de l&#39;hétérogénéité de leur teneur en GC 22. Plusieurs techniques de profilage et de compositions chimiques ont été utilisées pour remédier à cette difficulté. Parmi ceux-ci sont des approches différentes de puces à ADN et l&#39;analyse qPCR (Figure 2). Bien microréseau est largement accepté pour anal du génome entierlyse, il peut fournir des faux négatifs et il existe des différences entre les plates-formes disponibles, allant de la chimie de la technologie d&#39;impression 23. De plus, le processus de normalisation constitue un défi lors de l&#39;analyse relativement peu de gènes de miARN, qui sont comptés en milliers par rapport aux dizaines de milliers de transcrits d&#39;ARNm. qPCR, d&#39;autre part, est plus sensible, et est mieux appliqué lorsque moins de gènes doivent être considérés. Cependant, lorsqu&#39;elle est effectuée dans de grandes plaques de 384 puits, avec seulement une technique répliquée par plaque, plusieurs plaques doivent être analysés pour chaque échantillon, ce qui rend l&#39;analyse coûteux. Aussi, dans nos mains, de nombreux résultats plus faux négatifs ont été obtenus en utilisant l&#39;analyse DLP-LDA par rapport à la puce. Étant donné que la séquence de miARN mature est présente dans le pri-miARN et les séquences de pré-miARN, il est intéressant de faire la différence entre ces transcrits à l&#39;aide de techniques de PCR 24. sondes de DLP sont également disponibles pour pré-miARN, et spamorces ecific peuvent également être conçus pour exclure différente mature ou précurseur variantes utilisant cyanine technologie qPCR. qPCR est une norme d&#39;or pour la validation de l&#39;expression différentielle de résultats du profilage. L&#39;efficacité de la PCR quantitative, cependant, dépend de plusieurs paramètres, y compris l&#39;extraction de l&#39;ARN, de l&#39;intégrité de l&#39;ARN (de la qualité), la synthèse d&#39;ADNc, la conception d&#39;amorce, le procédé de détection (de la chimie), et le gène de référence pour la normalisation des données 1,22,25. Les options pour la conception d&#39;amorce pour l&#39;analyse des miARN est très limitée, car la courte durée de la séquence miRNA ne donne pas de place pour beaucoup la conception d&#39;amorce de remplacement, et seulement une amorce peuvent être hébergeaient dans cette courte séquence. Par conséquent, la nécessité de manipulations de substitution comme illustré sur la figure 2. Réplicats techniques sont importantes pour valider la robustesse de la méthode d&#39;amplification et le procédé mis en oeuvre. Répétitions biologiques sont nécessaires pour une représentation de la variatio biologique généralen, y compris la réponse variable à ligand traitement, et de montrer que les effets constatés dans une cellule sont reproductibles. Basé sur notre expérience, les variations dans l&#39;expression des miRNA entre les cultures cellulaires peuvent se produire. Habituellement, ces différences sont moins de 1,3 fois, et la moyenne des valeurs et SD correspondant identifie la variation naturelle et technologique. Cette variation peut résulter de divers facteurs, notamment, la densité cellulaire et le fait que les fonctions cellulaires peuvent changer de passage de passage. Pour identifier statistiquement significatives expressions résultant du traitement de ligand, une signification largement admise est lorsque la valeur de p inférieure à 0,05. Ici, le test t de l&#39;élève sur les répétitions biologiques et techniques à l&#39;aide de la distribution bilatérale et deux échantillons paramètres de variance inégales ont été utilisés. D&#39;autres paramètres du test t existent, et le choix dépend de la configuration expérimentale 26. Un protocole détaillé dans l&#39;évaluation des régulations hormonales de maturité miRNA dans des cellules de cancer du sein a été fournie. Technologies importantes et de la chimie dans le profilage et la validation de ces miARN expressions ont été clairement expliqué. La technologie choisie pour les études de miARN dans les cellules de cancer du sein dépend finalement de ce qui est exactement à l&#39;étude.

L&#39;œstrogène est une hormone qui est important lors du développement de la glande mammaire. L&#39;œstrogène joue également un rôle important dans le développement, la maintenance, le risque et le traitement du cancer du sein 1. L&#39;œstrogène exerce sa fonction en se liant à des RE, qui sont des facteurs de transcription et réguler les gènes cibles spécifiques. Sur les deux variantes du récepteur, ERa est essentiel pour l&#39;oestrogène-dépendante la prolifération des cellules du cancer du sein. La plupart des cancers du sein sont ERa-positif et dépend de l&#39;oestrogène pour la croissance. Cela a rendu la signalisation des oestrogènes et ERa une cible pour le traitement de l&#39;hormone-récepteur de cancer du sein positif. Comprendre le mécanisme sous-jacent de ERa est important d&#39;améliorer les résultats du traitement, vaincre la résistance au traitement, et de comprendre comment le cancer du sein se développe. miARN jouent un rôle essentiel dans les fonctions cellulaires en raison de leur impact majeur dans la régulation génique post-transcriptionnelle. miARN sont 19-24 nucléotides courte, simple brin, Non codantes des ARN qui sont d&#39;abord transcrits par l&#39;ARN polymérase II dans les transcriptions primaires miARN (pri-miARN). Elles sont traitées dans le noyau par Drosha en précurseurs-miARN courts en épingle à cheveux (pré-miARN) et ensuite traitées par Dicer et séparés en simples brins pour former miARN matures dans le cytoplasme. Les miARN matures simple brin sont transférés à des protéines Argonaute pour former un complexe RISC. Ensuite, les miARN peuvent s&#39;hybrider aux régions 3 &#39;non traduites (3&#39; UTR) d&#39;un ARNm cible, conduisant à la régulation post-transcriptionnelle par blocage de la traduction ou dégrader les ARNm cible 2. En raison du rôle important que jouent les œstrogènes et miARN dans la progression tumorale, l&#39;identification des miARN associés à la signalisation des oestrogènes normale ou perturbée est important afin d&#39;améliorer notre compréhension du développement et de l&#39;amélioration du traitement du cancer du sein. Bien qu&#39;il y ait une bonne compréhension de la façon dont ERa régule les gènes codant pour des protéines, l&#39;extensionet les détails de la réglementation non codantes de l&#39;ARN reste à une enquête approfondie. Les premières études visant à élucider la réglementation ERa de miARN dans les lignes cancers du sein de cellules ont donné des résultats contradictoires, même lorsque la même lignée cellulaire a été analysé 3-6. Cela peut être le résultat de traitements différents, les variations biologiques, l&#39;utilisation de différentes techniques, et le fait que la petite taille du miARN rendre difficile à analyser. Ici, un protocole qui contrôle les variations et les artefacts méthode est décrite. Pour identifier les miARN sont régies par les œstrogènes, le profilage d&#39;un modèle de cancer du sein bien défini de l&#39;activité ERa est une première étape. Plusieurs lignées cellulaires ont été générées à partir de tumeurs de cancer du sein humain ERa-positives, qui sont dépendants de l&#39;œstrogène similaire à la majorité des cancers du sein cliniques. Les propriétés moléculaires des deux de ces lignées cellulaires, T47D et MCF7, y compris l&#39;expression de ERa et sa cible en aval,le récepteur d&#39;hormone de progestérone (PR), un manque d&#39;expression de récepteur membranaire HER2, en même temps que l&#39;expression de gènes de différenciation oestrogène-sensibles et luminales-épithéliale, les rendent appropriés en tant que modèles pour le sous-type luminal des tumeurs du sein 7-10. 17β-estradiol (E2) est la forme dominante de l&#39;oestrogène, et les concentrations et les points de temps pour l&#39;activation de la transcription optimale de ERa ont été caractérisées dans plusieurs études. Dans ce protocole, 10 nM traitement E2 pendant 24 heures est utilisé et T47D et MCF7 comme modèles pour l&#39;activité ERa dans les cellules de cancer du sein 1. En outre, les règlements de miRNA dépendant du temps peuvent être analysés en particulier dans un intervalle de temps, par exemple de 1-72 h. Deuxièmement, l&#39;analyse des miRNA a des défis distincts, en partie en raison de leurs tailles courtes. miARN ne sont pas bien conservés dans la préparation de l&#39;ARN total lorsque réguliers guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol précipitations d&#39;ARN sont effectuées, ou lorsque rpurifications de colonne Andard sont utilisés. Précautions particulières doivent être prises pour maintenir ou enrichir pour la plus petite fraction d&#39;ARN. En augmentant le volume d&#39;isopropanol, l&#39;abaissement de la température avant la centrifugation (80 ° C), et en omettant le lavage à l&#39;éthanol à 70%, la rétention des miARN peut être accrue au cours de la précipitation. Ou, colonnes et des tampons spécifiques pour une préparation de haute qualité et robuste de l&#39;ARN total contenant miARN peuvent être utilisés. Aussi pour l&#39;analyse elle-même, leurs tailles courtes créent des défis. Pour le dépistage du miRNA génome, il ya trois miARN communes profilage techniques au choix: microarrays, qPCR, et le séquençage de prochaine génération. Chaque technique peut être réalisée en utilisant de multiples plates-formes différentes, et les différentes préparations d&#39;échantillons sont requis, chacun avec des risques d&#39;introduction d&#39;artefacts. En miRNA microréseau, une diapositive est repéré ou synthétisé avec des milliers d&#39;oligonucléotides. Ces oligonucléotides sont utilisés en tant que sondes, et chacune de la sondes est conçu pour s&#39;hybrider à une séquence de miARN particulier. La préparation des échantillons pour les microarrays, telle que pratiquée dans cette étude, enrichit d&#39;abord pour miARN puis introduit Cy5 et Cy3 étiquetage sur les miARN. Biopuces donne l&#39;occasion d&#39;observer les niveaux d&#39;expression relatifs d&#39;un grand nombre de gènes simultanément, c&#39;est rapide et appropriée pour le dépistage d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons, mais ne peut analyser les séquences présentes sur la puce et par exemple ne pas détecter les changements dans inconnu ou muté miARN. analyse de puces à ADN telle que pratiquée dans ce protocole exige également des quantités relativement importantes, environ 5 ug, de l&#39;ARN total par échantillon pour analyse. De basse densité qPCR miRNA profilage nécessite moins de matière (700 ng / échantillon et reproduire), et permet la détection et la quantification de miARN. niveaux de transcription peuvent être déterminées, et la quantité peut être une valeur absolue ou une quantité relative. analyse qPCR nécessite d&#39;abord la conversion des miRNA en ADNc, ici en utilisant une boucleamorce pour chaque miARN spécifiques assurant l&#39;analyse de seulement mûrir miARN. Cela génère un modèle plus qui peuvent être amplifiée en utilisant une amorce sens spécifique de miARN et une amorce universelle inverse complémentaire de la séquence en boucle, et peut abriter l&#39;insertion d&#39;une sonde à double spécificité pour étiqueté. qPCR peut être utilisée dans un format à faible densité où des centaines de miARN peuvent être détectées en parallèle en utilisant une ou plusieurs plaques de 384 puits avec différentes paires d&#39;amorces dans chaque puits 11. Séquençage de nouvelle génération, d&#39;autre part, est la seule de ces techniques qui permettent à la découverte de nouvelles, miARN mutées ou modifiées, comme tous les ARN dans un échantillon peuvent être séquencés 11. Cette technique, cependant, nécessite de multiples étapes pour enrichir petits ARN et de produire une petite bibliothèque d&#39;ARN en utilisant plusieurs étapes de ligature des lieurs et des purifications ultérieures avec risques accrus de moduler les niveaux d&#39;expression relatifs entre les échantillons. Elle exige également bioinformati importantsanalyse cs. Compte tenu des diverses techniques de profilage miRNA, la technique la plus appropriée dépend des applications. Les puces à ADN sont les plus appropriés lorsque le matériel est relativement abondante et l&#39;intérêt est de définir l&#39;expression différentielle des miARN déjà connus. Faible densité des réseaux qPCR sont les plus appropriés quand une quantité limitée de l&#39;échantillon est disponible et une sensibilité élevée de miARN peu exprimé est nécessaire. Le séquençage est le mieux adapté pour l&#39;analyse des miARN inconnus, des mutants ou des différentes isoformes d&#39;une miARN est nécessaire. Dans l&#39;étude de miARN régulés par les œstrogènes dans le cancer du sein, deux modèles de lignées cellulaires sont utilisés, T47D et MCF7, où de grandes quantités d&#39;ARN sont facilement disponibles. Chaque lignée cellulaire a été analysée dans des cultures de cellules répliquées à l&#39;aide de différents passages, chacun dans réplicats techniques de traitement. Cela permet la détection robuste de manière reproductible, miARN ERa réglementés. Les niveaux relatifs d&#39;expression des miRNA ont été comparées en utilisant deux miARN microarray etSondes double labellisés - tableaux de faible densité (DLP-LDA) et validé les résultats de qPCR spécifique utilisant à la fois cyanine et de la chimie de DLP. règlements de miARN ont ensuite été analysées plus loin dans les séries chronologiques de définir leur régulation exacte dans le temps, ce qui peut aider à différencier des variations aléatoires ou circadiens de la réglementation induite par les oestrogènes, et indiquer des effets primaires de effets secondaires. Comparaisons bioinformatiques des études de la chromatine liaison de ERa peuvent favoriser l&#39;aide à la différenciation de l&#39;enseignement primaire par rapport à des effets secondaires. L&#39;analyse a donné lieu à une évaluation fiable de la réglementation miARN où il a pu être établi que, après traitement de l&#39;E2 24 h transcriptions codant pour des protéines ont été facilement réglementés mais miARN matures n&#39;ont pas été affectées 1. Cependant, il est possible que les miARN sont réglementés au plus tard points dans le temps, comme le montre l&#39;analyse des séries chronologiques des miARN sélectionnés 1. Les détails doivent encore être explorées et le protocole présenté ici fournit une robust moyen d&#39;étudier la régulation hormonale des miARN matures dans des lignées cellulaires de cancer du sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1277">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">DMEM</td>
			<td style="width:364px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:399px;">11885092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phenol red-free DMEM&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11054020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrapure Water</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Specific equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DCC-FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6765-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS tablet</td>
			<td>Medicago, Accurate chemicals</td>
			<td>Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">17&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2758</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ICI 182,780&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4409</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-600ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T47D or MCF7 cells lines</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flask&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>BD353136 (vented cap)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serological pipet</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>53300. For 5mL (53300-421)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting chamber</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm plates&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>25382-166</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596026</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber cell scraper&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>82050-470</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase-Free DNase I&#160; kit (DNA degradation)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free water (Nuclease-free water)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>SH30538.02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 1000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ND-1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent RNA 6000 Nano Assay kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1512</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938C and for software (G2946)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">All primers (except TaqMan primers)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Specific per order for each gene/miRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18080085</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroAmp Fast 96-Well reaction plate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4346906</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Optical Adhesive Covers</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4311971</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4385612</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7500 Fast Real-Time PCR System and software</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4351106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;Paraflo Microfluidic Biochip Technology&#160;</td>
			<td>LCSciences</td>
			<td>MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4400928</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneAmp PCR System 9700 thermocycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4310899</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4324018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4329001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS and RQ manager softwares</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4444202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MIRC-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X DPL (TaqMan) RT primers</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Specific for each miRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20X DPL (TaqMan) real-time assay primer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Specific for each miRNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling of estrogen-regulated micrornas in breast cancer cells

L&#39;œstrogène joue un rôle vital dans le développement de la glande mammaire et la progression du cancer du sein. Il assure la médiation de la fonction de liaison à et activation des récepteurs des oestrogènes (RE), ERa et ERß,. ERa est souvent régulé à la hausse dans le cancer du sein et entraîne la prolifération de cellules cancéreuses du sein. Les salles d&#39;urgence fonctionnent comme des facteurs de transcription et réguler l&#39;expression des gènes. Considérant que le règlement de ERa de gènes codant pour des protéines est bien établi, la réglementation des non codantes microRNA (miRNA) est moins exploré. miARN jouent un rôle majeur dans la régulation post-transcriptionnelle de gènes, en inhibant leur traduction ou leur dégradation de l&#39;ARNm. miARN peuvent fonctionner comme des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeur et sont également biomarqueurs prometteurs. Parmi les essais de miRNA disponibles, puces à ADN et en temps réel la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) ont été largement utilisés pour détecter et quantifier les niveaux de miARN. Pour identifier les miARN réglementés par la signalisation des oestrogènes dans le cancer du sein, eeir expression dans des lignées cellulaires de cancer du sein ERa-positives ont été comparés avant et après activation à l&#39;aide des œstrogènes à la fois les microarrays μParaflo-microfluidiques et des sondes marquées double-matrices de faible densité. Les résultats ont été validés à l&#39;aide des analyses qPCR spécifiques, en appliquant à la fois cyanine à base de colorants et double étiqueté chimie à base de sondes. En outre, une analyse temps-points a été utilisée pour identifier des règlements au fil du temps. Avantages de l&#39;approche d&#39;analyse des miRNA utilisée dans cette étude est qu&#39;elle permet un dépistage rapide de la réglementation maturité miRNA dans de nombreux échantillons, même avec des quantités d&#39;échantillons limités. La mise en page, y compris les conditions spécifiques pour la culture cellulaire et le traitement d&#39;oestrogène, répétitions biologiques et techniques, et un dépistage à grande échelle suivie confirmations en profondeur en utilisant des techniques distinctes, assure une détection robuste de réglementation miARN, et élimine les faux positifs et d&#39;autres artefacts. Cependant, miARN mutés ou inconnus, ou des règlements à la leve de transcription primaire et précurseurl, ne sera pas détecté. La méthode présentée ici représente une enquête approfondie de la réglementation des miRNA oestrogène médiation.

Une vue d&#39;ensemble de cette approche est présentée dans la figure 1 et une comparaison entre les différents exemples de préparations et de modifications d&#39;acides nucléiques nécessaires pour chaque technique est visualisé sur la figure 2. La condition et l&#39;environnement des cellules avant traitement avec une hormone est important pour déterminer les effets réels de l&#39;hormone 16. Certains milieu et sérum contiennent des facteurs de croissance qui peuvent affecter les résultats, de sorte que les cellules sont privées de sérum afin de s&#39;assurer que tous les effets hormonaux ont été réduits à un minimum. Par conséquent, lorsque le traitement avec E2, il ya plus de certitude que les effets observés sont E2-associés. Un facteur important est la confluence des cellules, ce qui influe sur le contact et des comportements tels que la signalisation cellule-cellule et cellule-prolifération cellulaire. Les cellules ont été autorisées à être confluentes à 80% (Figure 3A) et bien fixés pour permettre la croissance et d&#39;éviter une perte de cellules pendant le lavage et le support subséquent change. Les conditions pendant l&#39;extraction et le stockage de l&#39;ARN sont importantes pour la qualité de l&#39;ARN et l&#39;analyse ultérieure. Il est également connu que le nombre de cellules, la méthode d&#39;extraction, et la teneur en GC de l&#39;miARN peuvent affecter le rendement et la qualité des deux ARNm et 17 miARN. Ainsi, il est nécessaire de procéder à l&#39;extraction de l&#39;ARN dans des conditions RNase-libres et de vérifier la qualité de l&#39;ARN avant de procéder à des expériences. Après extraction, la quantification de l&#39;ARN donne des informations sur la concentration de l&#39;ARN total (contenant à la fois des ARNm et miARN), qui permet l&#39;observation de rendement. Il fournit également une représentation graphique des résultats comme on le voit sur ​​la figure 3B, ce qui permet l&#39;observation de la pureté de l&#39;échantillon (généralement indiquée par une crête, panneau supérieur). Mauvais rendement de l&#39;ARN produirait pas d&#39;absorption spécifique à 260 nm (figure 3B, panneau inférieur). Pour déterminer si l&#39;ARN est de haute qualité, de l&#39;ARNintégrité a été mesurée. Un certain nombre d&#39;intégrité de l&#39;ARN (RIN) comprise entre 9-10 en sorte que l&#39;ARN n&#39;est pas dégradé et est d&#39;une qualité optimale. En outre, la représentation graphique de l&#39;ARN doit être observée, et l&#39;ARNr 28S et 18S devrait avoir des pics comme le montre la figure 4 (panneau du milieu). La comparaison avec l&#39;échelle (figure 4, panneau supérieur) identifie la taille des pics. Un ARN dégradé aurait pics moins claires et une quantité relative réduite de la 18S et 28S ARNr (figure 4, panneau inférieur). La fraction de petits ARN peut en outre être assurée à l&#39;aide du petit ARN Kit Agilent. Il est recommandé de valider la réponse de l&#39;oestrogène après traitement, dans les conditions expérimentales spécifiées, avant de procéder au dépistage des miARN. Une PCR quantitative peut être effectuée sur un gène cible ER connu tel que pS2 ou SPINK4 18, utilisant une matrice d&#39;ADNc. De tels gènes sont régulés à la hausse à l&#39;intérieur généralement de 1 à 24 h après traitement E2. Une fois que la qualité de l&#39;ARN et de la réponse aux oestrogènesa été évalué, autre expérience peut être réalisée. Microréseau est encore une technique largement utilisée pour le dépistage à grande échelle pour l&#39;expression des miARN dans les cellules. Par exemple, une fois que la puce à ADN miRNA utilisé contenait 894 miARN matures et 50 contrôles des sondes uniques dans une quadruplés. Les hybridations ont été effectuées en double avec colorant procédure d&#39;échange. Les résultats de puces à ADN miRNA sont habituellement représentés graphiquement par des cartes de chaleur. Figure 5A montre une carte de la chaleur, ce qui représente des données d&#39;une comparaison des biopuces miARN entre le véhicule et les échantillons traités E2. Le rouge indique que le miARN est régulée positivement dans l&#39;échantillon E2-traitée (expression élevée), tandis que le vert indique une régulation négative de la miRNA (Expression faible). La sélection miRNA dépend généralement de leur importance dans l&#39;expression, et généralement d&#39;une valeur de p inférieure à 0,05 est considérée comme significative. Les miARN qui sont indiqués pour être exprimé de manière différentielle devraient être encore validés wvec qPCR, pour les distinguer des faux positifs. Le tableau DLP-LDA, d&#39;autre part, utilise une méthode basée sur la PCR quantitative pour le dépistage de miARN réglementés dans un format de 384 puits. Habituellement deux plaques à 384 puits (cartes) sont fournis, piscines A et B. Groupe A contient généralement mieux caractérisé et plus fortement exprimés miARN de la piscine B. Le niveau relatif de chaque miARN sont déterminés par qPCR, où un miRNA est analysé par bien (figure 5B). Une valeur Ct élevé indique moindre expression de miARN. Tout comme la puce miARN, les résultats obtenus à partir de la DLP-LDA doivent encore être validé pour assurer l&#39;exactitude. Validations peuvent être effectuées en utilisant qPCR. Ici, deux méthodes de détection qPCR sont données pour éviter biais de la méthode et à permettre de confirmation approfondie et de l&#39;enquête de la réglementation miARN. La chimie de détection à base de colorant Cyanine fonctionne différente de DLP que le profilage DLP-LDA est basé sur, et est adapté pour confirmerfins ation. Il peut être moins précis car il détecte tout l&#39;ADN double brin amplifié, mais l&#39;homogénéité de l&#39;échantillon peut être évaluée en effectuant une analyse de courbe de fusion. Figure 6A (panneau de gauche) montre l&#39;analyse de courbe de fusion d&#39;un miRNA, et un pic uniforme clairement défini peut être vu. Des pics multiples seraient observés si l&#39;amorce est montants non spécifiques ou significatifs de l&#39;amorce-dimère est formé (figure 6A, panneau de droite). Dosages DLP miARN, d&#39;autre part, est plus précis que seule l&#39;amplification de la cible de miARN est détectée. graphes d&#39;amplification de chacune des cibles de miARN peuvent être observées, comme le montre la figure 6B. La possibilité de contrôler l&#39;apparition de multiples produits d&#39;amplification en utilisant l&#39;analyse de la courbe de fusion est, cependant, pas disponible avec cette chimie et colorant cyanine qPCR est moins coûteux. colorant cyanine et DLP qPCR essais peuvent parfois généré des résultats légèrement différents. Pour les deux essais de qPCR, par rapport à un réfégène de rence est nécessaire pour déterminer l&#39;expression relative de gènes entre deux échantillons. Le gène de référence, également dénommé gène de ménage, devrait être un gène dont l&#39;expression n&#39;est pas modifié et qui est exprimée à des niveaux similaires à celles du gène d&#39;intérêt. Un exemple d&#39;un gène de référence appropriée dans ces lignées cellulaires de cancer du sein est ARHGDIA, une dissociation Rho GDP-inhibiteur qui fonctionne réactions des protéines Rho d&#39;échange GDP / GTP. Comme observé sur la figure 6C (en haut), le niveau d&#39;ARNm de ARHGDIA n&#39;est pas modifiée entre le véhicule et les échantillons de ligands traités. Le 18S peut également être utilisé, mais son expression élevée nécessite une dilution de 1:500 séparée de l&#39;ADNc stock et qu&#39;il est donc moins approprié. Pour l&#39;analyse des miRNA, il ya encore un débat sur un gène de référence bien définis. Jusqu&#39;à présent, le U6 snRNA est un gène de référence qui est largement acceptée pour l&#39;analyse des miRNA. U6 snRNA est le ~ 110 nucléotides de long, non codantes petit ARN nucléaire qui fonctionne dans le nucléaire spl pré-ARNmgivrage 19. Comme observé sur la figure 6C (en bas), les niveaux d&#39;expression de U6 sont sur ​​la même dans tous les échantillons présentés, permettant ainsi des calculs des niveaux variables de miARN. Une représentation graphique d&#39;un résultat miRNA qPCR pour une comparaison entre le véhicule et les cellules E2-traités qui ont été normalisée à l&#39;U6 de référence peut être observé sur la figure 6D. Ceci illustre un miRNA qui ont été détecté comme non réglementés après le traitement 24 heures de E2, mais qui recèle ER sites de chromatine liaison à proximité de son emplacement génomique, et l&#39;analyse des séries chronologiques identifié réglementation importante 72 heures après le traitement. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1.jpg" /> Figure 1. Un aperçu de l&#39;approche utilisée pour la détection de la régulation hormonale de miARN dans les cellules cancéreuses du sein. </strong&gt; processus commence avec la culture et le traitement cellulaire, suivie à grande échelle miRNA profilage pour identifier les miARN éventuellement exprimés de manière différentielle, et se termine par des validations qRT-PCR des résultats de tableau. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2.jpg" /> Figure 2. La comparaison des diverses préparations de l&#39;échantillon et les manipulations d&#39;acide nucléique pour chaque technique de détection de miARN. (A) microréseau miARN en utilisant la méthode de la technologie μParaflo comprend enrichissement, le poly-A de queue et l&#39;étiquetage de ligature (B). Technologie DLP préparation de l&#39;échantillon et de la méthode de détection comprend une synthèse de l&#39;ADNc amorce en boucle qui s&#39;étend après l&#39;étape de dénaturation et fournit un fragment plus long portant l&#39; préparation de l&#39;échantillon amorce inverse et la séquence de la sonde. (C) la technologie de teinture de cyanineet la méthode de détection comprend poly A-tailing, et la synthèse de l&#39;ADNc avec des amorces oligo-dT, y compris une séquence universelle 5. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3.jpg" /> Figure 3. La culture cellulaire et l&#39;extraction d&#39;ARN. (A) Les cellules cultivées pour illustrer 80% de confluence nécessaire avant le traitement avec le ligand. (B) Représentation graphique de la concentration en ARN et la pureté après extraction. Chaque pic représente un échantillon et un processus d&#39;extraction réussie donne ARN pur (en haut). Un ARN mal extrait ne montre aucun pic d&#39;absorption nette à 260 nm (panneau du bas). <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4.jpg" /> Figure 4. &amp; #160; ARN contrôle de la qualité des résultats de l&#39;analyse de l&#39;intégrité de l&#39;ARN montrant représentation graphique de l&#39;échelle (en haut), un ARN de bonne qualité (au milieu) et un échantillon d&#39;ARN dégradé (en bas).. <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5.jpg" /> Figure 5. Une illustration des résultats de profilage miARN. (A) Une représentation de la carte de chaleur des résultats de puces miRNA pour miARN exprimés de manière différentielle. miR-A, B, C sont régulés à la hausse dans le traitement d&#39;échantillons E2 comme indiqué en rouge, tandis que miR-D, E, F, G sont régulés à la baisse dans l&#39;échantillon E2 traité comme indiqué dans le vert. (B) graphes d&#39;amplification pour chaque miRNA des résultats DLP-LDA. miRNA détectés sont amplifiés comme indiqué par augmentation de la valeur Rn. <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6.jpg&quot; /&gt; Figure 6. analyse qPCR de la réglementation miARN. (A) de l&#39;analyse de fusion-courbe pour un miRNA analysé en utilisant la détection de colorant de cyanine, montrant l&#39;homogénéité de tous les échantillons testés (à gauche) et l&#39;amplification de fragments multiples (à droite). (B) parcelles d&#39;amplification pour chaque échantillon pour un miARN. Il peut s&#39;agir de cyanine ou DLP de méthodes de détection. (C) la représentation graphique à barres de gènes de référence appropriés pour l&#39;ARNm analyse ARHGDIA (en haut) et pour miRNA analyse snRNA U6 (en bas), ne montrant aucune expression différentielle importante entre les échantillons. (D) résultats miRNA qPCR pour illustrer la comparaison des niveaux relatifs d&#39;expression de miR-135a sur un parcours de temps. Figure 6D est tiré à part de Katchy et al. 1 avec la permission d&#39;Elsevier. Les valeurs sont généralement la moyenne des exper séparéeriences (doublons biologiques) ± SD. Test t de Student est utilisé pour démontrer la signification: * p &lt;0,05.

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Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Moléculaire de signalisation par des œstrogènes et les microARN sont essentiels dans le développement du cancer du sein et de la croissance. L&#39;œstrogène active les récepteurs d&#39;oestrogène, qui sont des facteurs de transcription. De nombreux facteurs de transcription peuvent réguler l&#39;expression de microARN, et microARN régulés par les œstrogènes peuvent être profilée en utilisant différentes techniques de grande envergure.

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It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Profil moléculaire du microenvironnement de la tumeur invasive dans un modèle 3-dimensionnelle des cellules du cancer colorectal et<em&gt; Ex vivo</em&gt; fibroblastes

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

Dans vivo et ex vivo approches pour étudier Cancer de l&#39;ovaire métastatique colonisation de Lactée spot Structures en péritonéale adipeux

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

L&#39;utilisation de l&#39;essai de formation souple Agar colonie à identifier des inhibiteurs de Tumorigénicité dans les cellules cancéreuses du sein

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...