Name: profiling of estrogen-regulated micrornas in breast cancer cells
Uploaded: 2014-02-21T14:30:00
Duration: 16 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells at JoVE.com

Мы благодарны доктору Xiaolian Гао, Университете Хьюстона, за консультирование микрочипов платформы LC наук микроРНК, доктора Карин Edvardsson, Каролинского института, Швеция, и д-р Eylem Aydogdu, Университете Хьюстона, для обмена своим опытом микроРНК . Исследования сообщили в настоящей публикации при поддержке Национального института рака из Национального института здоровья в рамках премии Количество R01CA172437. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здравоохранения. Эта работа также была поддержана грантами от Техаса Emerging Technology Fund, в рамках Соглашения не. 300-9-1958.

<ol>
	<li>Katchy, A., Edvardsson, K., Aydogdu, E., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol-activated+estrogen+receptor+alpha+does+not+regulate+mature+microRNAs+in+T47D+breast+cancer+cells.">Estradiol-activated estrogen receptor alpha does not regulate mature microRNAs in T47D breast cancer cells.</a> J. Steroid Biochem. Mol Biol. 128 (3-5), 145-153 (2012).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Wickramasinghe, N. S., Manavalan, T. T., Dougherty, S. M., Riggs, K. A., Li, Y., Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (8), 2584-2595 (2009).</li><li>Bhat-Nakshatri, P., Wang, G., Collins, N. R., Thomson, M. J., Geistlinger, T. R., Carroll, J. S., Brown, M., Hammond, S., Srour, E. F., Liu, Y., Nakshatri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol-regulated+microRNAs+control+estradiol+response+in+breast+cancer+cells.">Estradiol-regulated microRNAs control estradiol response in breast cancer cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), 4850-4861 (2009).</li><li>Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+and+estrogen+action.">miRNAs and estrogen action.</a> Trends Endocrinol. Metab. 23 (5), 223-233 (2012).</li><li>Gupta, A., Caffrey, E., Callagy, G., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oestrogen-dependent+regulation+of+miRNA+biogenesis:+many+ways+to+skin+the+cat.">Oestrogen-dependent regulation of miRNA biogenesis: many ways to skin the cat.</a> Biochem. Soc. Trans. 40 (4), 752-758 (2012).</li><li>Kao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+breast+cancer+cell+lines+defines+relevant+tumor+models+and+provides+a+resource+for+cancer+gene+discovery.">Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery.</a> PLoS One. 4 (7), e6146 (2009).</li><li>Lacroix, M., Leclercq, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+breast+cancer+cell+lines+as+models+for+breast+tumours:+an+update.">Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update.</a> Breast Cancer Res. Treat. 83 (3), 249-289 (2004).</li><li>Ross, D. T., Perou, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+gene+expression+signatures+from+breast+tumors+and+breast+tissue+derived+cell+lines.">A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines.</a> Dis. Markers. 17 (2), 99-109 (2001).</li><li>Neve, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+collection+of+breast+cancer+cell+lines+for+the+study+of+functionally+distinct+cancer+subtypes.">A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes.</a> Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+separating+signal+from+noise.">MicroRNA profiling: separating signal from noise.</a> Nat. Methods. 7 (9), 687-692 (2010).</li><li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+using+microParaflo+microfluidic+array+technology.">MicroRNA profiling using microParaflo microfluidic array technology.</a> Methods Mol. Biol. 822, 153-182 (2012).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, 140-144 (2006).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).</li><li>Ruedl, C., Cappelletti, V., Coradini, D., Granata, G., Di Fronzo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+culture+conditions+on+the+estrogenic+cell+growth+stimulation+of+human+breast+cancer+cells.">Influence of culture conditions on the estrogenic cell growth stimulation of human breast cancer cells.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37 (2), 195-200 (1990).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Mol. Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li><li>Williams, C., Edvardsson, K., Lewandowski, S. A., Strom, A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+study+of+the+repressive+effects+of+estrogen+receptor+beta+on+estrogen+receptor+alpha+signaling+in+breast+cancer+cells.">A genome-wide study of the repressive effects of estrogen receptor beta on estrogen receptor alpha signaling in breast cancer cells.</a> Oncogene. 27 (7), 1019-1032 (2008).</li><li>Yu, Y. T., Maroney, P. A., Darzynkiwicz, E., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U6+snRNA+function+in+nuclear+pre-mRNA+splicing:+a+phosphorothioate+interference+analysis+of+the+U6+phosphate+backbone.">U6 snRNA function in nuclear pre-mRNA splicing: a phosphorothioate interference analysis of the U6 phosphate backbone.</a> RNA. 1 (1), 46-54 (1995).</li><li>Wesierska-Gadek, J., Schreiner, T., Maurer, M., Waringer, A., Ranftler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+the+culture+medium+strongly+affects+the+susceptibility+of+human+MCF-7+cells+to+roscovitine.">Phenol red in the culture medium strongly affects the susceptibility of human MCF-7 cells to roscovitine.</a> Cell Mol. Biol. Lett. 12 (2), 280-293 (2007).</li><li>Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+activity+of+phenol+red.">Estrogenic activity of phenol red.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 57 (3), 169-178 (1988).</li><li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR,+how+to+use+it+and+what+is+available.">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50 (4), 244-249 (2010).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li><li>Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+to+monitor+the+expression+of+microRNA+precursors.">A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors.</a> Nucleic Acids Res. 32 (4), e43 (2004).</li><li>Setiawan, A. N., Lokman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+reference+gene+selection+programs+to+study+the+silvering+transformation+in+a+freshwater+eel+Anguilla+australis:+a+cautionary+tale.">The use of reference gene selection programs to study the silvering transformation in a freshwater eel Anguilla australis: a cautionary tale.</a> BMC Mol. Biol. 11, 75 (2010).</li><li>Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+analysis+of+real-time+PCR+data.">Statistical analysis of real-time PCR data.</a> BMC Bioinform. 7, 85 (2006).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Определение механизма гормональной регуляции микроРНК в клетках рака молочной железы может послужить платформой для понимания этой болезни и может обеспечить потенциальную обработку для рака молочной железы. Культивирование этих клеток, чтобы обеспечить оптимальные условия для действия гормонов является очень важным. Здесь это протокол, который гарантирует, что гормон интерес (эстроген) был исключен до лечения и что оптимальная доза Е2 был использован в течение соответствующего времени в процессе лечения было описано. Другие гормональные и роста эффекты факторов были сведены к минимуму путем постепенного снижения сывороточные уровни и с помощью DCC-FBS, который FBS, которые были лишены большей части своей гормона, цитокинов и факторов роста. Фенолового красного носители дополнительно используется, чтобы минимизировать другие негормональной эффектов, при условии, что фенол красный, как сообщается, имеют эстрогенной активностью и влиять на определенные функции в клеточных линиях 20,21. Время обработки клеток на гормон имеет большое значение. Для эстроген-связана регуляции генов, было ранее показали, что 24-hrexposure производить значительную реакцию прямых генов-мишеней в раковых клетках молочной железы 1,18. С микроРНК транскрибируются РНК-полимеразы II, как мРНК, можно предположить, что это подходящая точка времени, чтобы обнаружить прямое регулирование также микроРНК. Это еще предстоит определить, если и как эти микроРНК влияют на экспрессию этих известных целей ER в клетках рака молочной железы. микроРНК выражение профилирование может быть сложным из-за относительной небольшой размер микроРНК, на то, что последовательность зрелого микроРНК можно найти также в PRI-микроРНК и предварительной микроРНК, и из-за неоднородности в их содержании 22 ГК. Несколько методов профилирования и химические были использованы для преодоления этой трудности. Среди них различные подходы микрочипов и анализа КПЦР (рис. 2). Хотя микрочипов широко принята для всей генома анальныйлиз, она может обеспечить ложные негативы и существуют различия между доступных платформах, начиная от химии к технологии печати 23. Также процесс нормализации представляет собой проблему при анализе сравнительно мало генов микроРНК, которые учитываются в тысячах сравнению с десятками тысяч транскриптов мРНК. КПЦР, с другой стороны, является более чувствительным, а лучше меньше применяется, когда гены должны быть рассмотрены. Однако, когда выполняется в больших пластин 384-а, только с одним технической репликации за тарелку, несколько плиты должны быть проанализированы для каждого образца, что делает анализ дорогостоящим. Кроме того, в наших руках, многие больше ложных отрицательных результатов были получены с использованием анализа DLP-LDA сравнению с микрочипом. Учитывая, что последовательность зрелого микроРНК присутствует в PRI-микроРНК и последовательностей предварительно микроРНК, представляет интерес для различения этих транскриптов с использованием методов ПЦР 24. DLP зонды доступны также для предварительного микроРНК и зрecific праймеры также могут быть разработаны, чтобы исключить различные зрелые или предшественник варианты использования органического красителя технологии КПЦР. КПЦР является золотым стандартом для проверки дифференциального выражения от профилирования результаты. Эффективность кПЦР, однако, зависит от нескольких параметров, включая выделения РНК, целостности РНК (качество), синтеза кДНК, грунтовки дизайна, способа обнаружения (химия), и опорного гене данных нормализации 1,22,25. Опции для дизайна праймеров для анализа микроРНК очень ограничен, так как короткая длина последовательности микроРНК не дает места для большого альтернативной конструкции праймера, и только один праймер можно питал в этой короткой последовательности. Таким образом, потребность в альтернативных манипуляций, как показано на рисунке 2. Технические повторов важны для проверки надежности способа амплификации и используемого способа. Биологических повторяет требуются для представления общей биологической вариациейп, в том числе переменную ответ на лиганд лечение, и показать, что эффекты, наблюдаемые в клетке воспроизводимы. Основываясь на нашем опыте, изменения в микроРНК выражения между культурами клеток может произойти. Обычно эти различия меньше, чем в 1,3 раза, а средняя значений и соответствующих SD идентифицирует природных и техногенных изменений. Это изменение может быть результатом различных факторов, включая, плотности клеток и тем, что функции клетки может изменить от пассажа к пассажу. Для выявления статистически значимых выражений в результате лечения лиганда, широко распространенным значимость, когда значение р меньше 0,05. Здесь были использованы Т-тест студента на биологических и технических повторов с помощью двустороннее распределение и Двухвыборочная неравные параметры дисперсии. Другие параметры Т-тест существуют, и выбор зависит от экспериментальной установки 26. Подробный протокол в оценке гормональные правила зрелой микроРНКН.А. в раковых клетках молочной железы была оказана. Важные технологии и химии в профилирования и подтверждение этих микроРНК выражения были четко объяснены. Выбранная технология для изучения микроРНК в клетках рака молочной железы в конечном счете зависит от того, что именно находится в стадии расследования.

Эстроген является гормоном, который важно при разработке молочной железы. Эстроген также играет важную роль в разработке, обслуживании, риска и лечения рака молочной железы 1. Эстроген оказывает свою функцию путем связывания с ЧН, которые транскрипционные факторы и регулируют конкретные гены-мишени. Из двух вариантов рецептора, ERα имеет важное значение для эстроген-зависимой пролиферации клеток рака молочной железы. Большинство рака молочной железы являются ERα-положительных и зависит от эстрогена для роста. Это сделало сигнализации эстрогена и ERα цель для лечения в гормон-рецепторного положительный рак молочной железы. Понимание основной механизм ERα важно улучшить результаты лечения, преодолеть сопротивление к лечению, и понять, как развивается рак молочной железы. микроРНК играют важную роль в клеточных функций в связи с их большое влияние в регулировании посттранскрипционной генов. микроРНК являются 19-24 нуклеотидов короче говоря, одноцепочечной, Некодирующих РНК, которые сначала транскрибируются РНК-полимеразы II в первичных транскриптов микроРНК (PRI-микроРНК). Они обрабатываются в ядре по Drosha в короткие шпильки предшественников-микроРНК (предварительно микроРНК) и затем обрабатываются Dicer и сформировать отдельные пряди, чтобы сформировать зрелые микроРНК в цитоплазме. Одноцепочечной зрелые микроРНК передаются Argonaute белками с образованием RISC комплекс. Затем микроРНК может гибридизоваться с 3&#39;-нетранслируемой области (3&#39;-UTR) от мРНК-мишени, что приводит к пост-транскрипционной регуляции путем блокирования или перевод деградации мРНК-мишени 2. В связи с той важной роли, что и эстроген и микроРНК играют в опухолевой прогрессии, выявления микроРНК, связанных с нормальной или нарушенной сигнализации эстрогена важно в целях повышения наше понимание развития и улучшения лечения рака молочной железы. Хотя есть хорошее понимание того, как ERα регулирует белок-кодирующих генов, расширениеи подробная информация о некодирующих РНК правила еще предстоит тщательно расследованы. Первоначальные исследования, направленные на выяснение ERα регулирование микроРНК в рак молочной железы клеточных линий дали противоречивые результаты, даже когда тот же клеточная линия была проанализирована 3-6. Это может быть результатом различных методов лечения, биологические колебания, использования различных методов и на то, что небольшой размер микроРНК сделать их сложно анализировать. Здесь это протокол, который контролирует для вариаций и методов артефактов описывается. Чтобы определить, какие микроРНК регулируются эстрогена, профилирование четко определенной модели рака молочной железы из ERα деятельности является первым шагом. Несколько клеточные линии были получены от опухолей молочной железы человека ERα-положительных, которые зависят от эстрогена, аналогичной большинства клинических случаев рака молочной железы. Молекулярные свойства двух из этих клеточных линий, T47D и MCF7, в том числе экспрессии ERα и ее ниже по потоку цели,рецептор гормона прогестерона (PR), отсутствие экспрессии мембранного рецептора HER2, наряду с выражением эстроген-чувствительных и просвета-эпителиальных генов дифференцировки, сделать их пригодными в качестве моделей для просвета подтипа опухолей молочной железы 7-10. 17β-эстрадиол (Е2) является доминирующей формой эстрогена, а концентрации и временные точки для оптимального активации транскрипции из ERα были охарактеризованы в нескольких исследованиях. В этом протокол 10 нМ E2 лечения в течение 24 ч используется и T47D и MCF7 в качестве моделей для ERα деятельности в клетках рака молочной железы 1. Кроме того, зависимые от времени правила микроРНК может быть специально анализировали в интервале времени, например 1-72 часов. Во-вторых, анализ микроРНК имеет отдельные проблемы, отчасти из-за своих коротких размеров. микроРНК не очень хорошо сохраняются в общей подготовке РНК когда обычные гуанидиния thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol РНК осадков выполняются, или когда йAndard очищения столбцов используются. Особые меры предосторожности должны быть приняты для поддержания или обогатить для меньшего фракции РНК. При увеличении объема изопропанола, понижение температуры перед центрифугированием (-80 ° C) и опуская промывку в 70% этаноле, удерживающий микроРНК может быть повышена во время осаждения. Или, конкретные столбцы и буферы для высококачественной и надежной подготовке микроРНК-содержащих общей РНК могут быть использованы. Кроме того, для самого анализа, их короткие размеры создают проблемы. Для генома микроРНК скрининга, есть три общих микроРНК профилирования методов на выбор: микрочипы, КПЦР и следующего поколения секвенирования. Каждый метод может быть выполнена с использованием нескольких различных платформ, а также различные препараты образца требуется, каждый с различными рисков введения артефактов. В микроРНК микрочипов, слайд имеются пятна или синтезированы с тысячами олигонуклеотидов. Эти олигонуклеотиды использовали в качестве зондов, и каждый из зондас предназначен для гибридизации с определенной последовательности микроРНК. Подготовка образца для микрочипов, как в ходе данного исследования, в первую обогащает для микроРНК, а затем вводит Cy5 и Cy3 маркировку на микроРНК. Микрочипов дает возможность наблюдать относительные уровни экспрессии большого числа генов одновременно, быстро и подходит для скрининга большого количества образцов, но может только анализировать последовательности присутствует на микрочипе и например не обнаружить изменения в неизвестной или мутировал микроРНК. Микрочипов анализ проводили, как в данном протоколе также требует относительно больших количеств, около 5 мкг, из общей РНК в образце для анализа. Низкая плотность КПЦР микроРНК профилирования требуется меньше материала (700 нг / образец и повторить), и позволяет для обнаружения и количественного определения микроРНК. Уровни транскриптов может быть определен, а количество может быть абсолютным или количество относительное количество. Анализ КПЦР сначала требуется преобразование микроРНК в кДНК, здесь с помощью петельчатуюгрунт для каждого конкретного микроРНК, обеспечивающих анализ только зрелые микроРНК. Это создает более длинный шаблон, который может быть усилен с использованием конкретных микроРНК прямого праймера и универсальный обратного праймера, комплементарного последовательности петлей, и могут содержать включение двойной меченым зондом для специфичности. КПЦР могут быть использованы в формате низкой плотности, где сотни микроРНК могут быть обнаружены в параллель с использованием одного или нескольких пластин 384-луночный с отдельными пар праймеров в каждую лунку 11. Секвенирование следующего поколения, с другой стороны, это единственный из этих методов, что позволяет для открытия новых, мутированных или отредактированных микроРНК, поскольку все РНК в образце можно секвенировать 11. Этот метод, однако, требует нескольких шагов, помогут малые РНК и производят небольшую библиотеку РНК с помощью нескольких шагов компоновщика лигирования и операции очистки с последующими усовершенствованных рисков модуляции их относительные уровни экспрессии между образцами. Он также требует значительных bioinformatiCS анализ. Учитывая различные методы для микроРНК профилирования, наиболее подходящий метод зависит от приложений. Microarrays являются наиболее подходящими, когда материал является относительно изобилии, и интерес, чтобы определить дифференциальное выражение уже известных микроРНК. Низкая плотность КПЦР массивы являются наиболее подходящими, когда ограниченное количество образца доступен и высокая чувствительность с низким выразил микроРНК требуется. Секвенирование является наиболее подходящим, когда анализ неизвестных микроРНК, мутировавших или различных изоформ в микроРНК требуется. При изучении регулируемых эстрогенами микроРНК при раке молочной железы, два модели клетки линии используются, T47D и MCF7, где большое количество РНК легко доступны. Каждая ячейка линия была проанализирована в культурах реплицированными клеток с использованием различных отрывков, каждый в технических повторах лечения. Это позволяет для надежной обнаружения воспроизводимо, ERα регулируемых микроРНК. Относительные уровни экспрессии микроРНК были сравнены с использованием как микроРНК микрочипов иДвойные меченых зондов - массивы низкой плотности (DLP-LDA) и подтверждено результаты с определенной количественной ПЦР с использованием как органического красителя и DLP химии. правила микроРНК были затем дополнительно проанализированы в временных рядов, чтобы определить их точное регулирование с течением времени, что может помочь дифференцировать случайные или циркадные вариации от эстроген-индуцированной правил, и указать первичные эффекты от вторичных эффектов. Bioinformatical сравнения с хроматин-связывания исследований ERα может способствовать помощь в дифференциации первичной против вторичных эффектов. Анализ привело к надежной оценки правил микроРНК, где он может быть установлено, что после 24 часов лечения E2 белок-кодирующих транскриптов легко регулируется, но зрелые микроРНК не были затронуты 1. Тем не менее, не исключено, что микроРНК регулируются на более поздних временных точках, как показано в порядке временной последовательности анализа выбранных микроРНК 1. Детали должны быть дополнительно изучены и протокол, представленные здесь обеспечивает Robusт способ изучения гормональной регуляции зрелых микроРНК в линиях клеток рака молочной железы.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1277">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">DMEM</td>
			<td style="width:364px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:399px;">11885092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phenol red-free DMEM&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11054020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrapure Water</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Specific equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DCC-FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6765-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS tablet</td>
			<td>Medicago, Accurate chemicals</td>
			<td>Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">17&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2758</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ICI 182,780&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4409</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-600ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T47D or MCF7 cells lines</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flask&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>BD353136 (vented cap)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serological pipet</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>53300. For 5mL (53300-421)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting chamber</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm plates&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>25382-166</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596026</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber cell scraper&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>82050-470</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase-Free DNase I&#160; kit (DNA degradation)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free water (Nuclease-free water)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>SH30538.02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 1000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ND-1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent RNA 6000 Nano Assay kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1512</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938C and for software (G2946)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">All primers (except TaqMan primers)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Specific per order for each gene/miRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18080085</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroAmp Fast 96-Well reaction plate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4346906</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Optical Adhesive Covers</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4311971</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4385612</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7500 Fast Real-Time PCR System and software</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4351106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;Paraflo Microfluidic Biochip Technology&#160;</td>
			<td>LCSciences</td>
			<td>MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4400928</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneAmp PCR System 9700 thermocycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4310899</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4324018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4329001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS and RQ manager softwares</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4444202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MIRC-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X DPL (TaqMan) RT primers</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Specific for each miRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20X DPL (TaqMan) real-time assay primer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Specific for each miRNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling of estrogen-regulated micrornas in breast cancer cells

Эстроген играет жизненно важную роль в развитие молочных желез железы и прогрессирования рака молочной железы. Это посредником свою функцию путем связывания и активации рецепторов эстрогена (ERS), ERα и ER-. ERα часто активируется в рака молочной железы и приводит пролиферацию клеток рака молочной железы. ЭКР функционировать как факторы транскрипции и регулируют экспрессию генов. В то время как регулирование ERα в белок-кодирующих генов хорошо известна, ее регулирование некодирующих микроРНК (микроРНК) меньше изучены. микроРНК играют важную роль в пост-транскрипционной регуляции генов, подавляя их перевод или ухудшения качества их мРНК. микроРНК может функционировать в качестве онкогенов или опухолевых супрессоров и также подтверждаете биомаркеров. Среди микроРНК анализов имеющихся, микрочипов и количественный реальном времени полимеразной цепной реакции (КПЦР) широко используется для обнаружения и количественного определения уровней микроРНК. Для идентификации микроРНК регулируются сигнализации эстрогена в рака молочной железы, тыс.EIR выражение в ERα-позитивных клеток рака молочной железы линий сравнивали до и после эстроген-активация с использованием как μParaflo-микрофлюидных микрочипов и Dual меченых зондов-низкой плотности массивы. Результаты были проверены с использованием конкретных КПЦР анализов, применения как органического красителя в основе и Dual меченых зондов на основе химии. Кроме того, временной точке анализа была использована для выявления положения с течением времени. Преимущества анализа подхода микроРНК, используемые в этом исследовании является то, что она позволяет быстрый скрининг правил зрелые микроРНК в многочисленных образцов, даже при ограниченных количествах образцов. Макет, в том числе конкретных условий для культивирования клеток и лечения эстроген, биологических и технических повторах, и крупномасштабного скрининга с последующим углубленные подтверждения с использованием отдельных методов, обеспечивает надежное обнаружение правил микроРНК, и устраняет ложные срабатывания и другие артефакты. Правда, мутировавший или неизвестных микроРНК или правилам, на первичном и предшественника транскриптов Левел, не будут обнаружены. Метод, представленный здесь представляет собой тщательное расследование эстроген-опосредованной регуляции микроРНК.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells at JoVE.com

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Молекулярная сигналов через эстрогена и микроРНК являются критическими в развитии рака молочной железы и роста. Эстроген активирует рецепторы эстрогена, которые транскрипционные факторы. Многие транскрипционные факторы могут регулировать экспрессию микроРНК, и эстроген-регулируется микроРНК можно профилировать с использованием различных методов масштабные.

Профилирование Эстроген-регулируемых микроРНК в клетках рака молочной железы

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Мульти-модальных изображений ангиогенеза в обнаженной модели крысы из груди метастазы рака костей с помощью магнитного резонанса, компьютерной томографии Объемные и ультразвуковые

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Жить изображений на наркотики Ответы на микроокружение опухоли в мышиных моделях рака молочной железы

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Время изображений в заданный промежуток первичной предраковых эпителиальные клетки молочной железы, полученных из генно-инженерных мышей модели рака молочной железы

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Трехмерные культуры: инструмента для изучения Normal Acinar Архитектура против злокачественной трансформации клеток молочной железы

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

Количественное определение клеток рака молочной железы инвазивности Использование трехмерной (3D) модель

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Молекулярная профилирования из инвазивным опухоли микроокружения в 3-мерной модели клеток колоректального рака и<em&gt; Экс естественных</em&gt; Фибробласты

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Ортотопическая инъекции клеток рака молочной железы в молочной жировой ткани мышей для изучения роста опухоли.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

<em&gt; Экс естественных</em&gt; Модель для изучения действия гормонов в груди человека

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

В Vivo и экс Vivo подходы к изучению рака яичников метастатического колонизации Млечного Местная структур в брюшной жировой

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Использование мягких агар колонии Формирование анализе для идентификации ингибиторов туморогенности в клетках рака молочной железы

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...