Name: isolation of ca1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins
Uploaded: 2014-08-10T14:00:00
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This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.

1 Préparation de aiguë coupes d&#39;hippocampe de cerveau de rat adulte <ol><li> Anesthésier les rats avec de l&#39;isoflurane. ATTENTION: Effectuer la procédure en utilisant un dessiccateur fermé, ne pas inhaler isoflurane. Assurez-vous que l&#39;animal est complètement anesthésié. </li><li> Décapiter le rat, isoler rapidement le cerveau, et la plonger dans précarbonaté (95% O 2/5% de CO mélange gazeux 2) glacé la solution de Gey (composition en mM: 130 NaCl, 4,9 KCl, 1,5 CaCl ...

<ol>
	<li>Behnisch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translocation+of+Jacob+in+hippocampal+neurons+after+stimuli+inducing+long-term+potentiation+but+not+long-term+depression.">Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression.</a> PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).</li><li>Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+by+the+proteasome+is+required+for+synaptic+tagging+and+the+heterosynaptic+stabilization+of+hippocampal+late-phase+long-term+potentiation.">Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation.</a> Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).</li><li>Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+GABA(A)+inhibition+on+the+expression+of+long-term+potentiation+in+CA1+pyramidal+cells+are+dependent+on+tetanization+parameters.">Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters.</a> Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).</li><li>Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+transport+of+the+transcriptional+coactivator+CRTC1+from+synapse+to+nucleus.">Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus.</a> Cell. 150 (1), 207-221 (2012).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caldendrin-Jacob:+a+protein+liaison+that+couples+NMDA+receptor+signalling+to+the+nucleus.">Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus.</a> PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).</li><li>Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+synapse+to+nucleus+and+back+again--communication+over+distance+within+neurons.">From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).</li><li>Hardingham, G. E., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+versus+extrasynaptic+NMDA+receptor+signalling:+implications+for+neurodegenerative+disorders.">Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).</li><li>Ivanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+role+of+synaptic+and+extrasynaptic+NMDA+receptors+in+regulation+of+the+extracellular+signal-regulated+kinases+(ERK)+activity+in+cultured+rat+hippocampal+neurons.">Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons.</a> J. Physiol. 57, 789-798 (2006).</li><li>Jordan, B. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+protein+shuttling:+the+direct+route+in+synapse-to-nucleus+signaling.">Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling.</a> Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).</li><li>Karpova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+transducing+the+synaptic+or+extrasynaptic+origin+of+NMDA+receptor+signals+to+the+nucleus.">Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus.</a> Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).</li><li>Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+NR2A-+and+NR2B-containing+NMDA+receptors+in+Ras-ERK+signaling+and+AMPA+receptor+trafficking.">Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking.</a> Neuron. 46, 745-760 (2005).</li><li>Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importin-mediated+retrograde+transport+of+CREB2+from+distal+processes+to+the+nucleus+in+neurons.">Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).</li><li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+(P25-30)+rats.">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li><li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+activity-dependent+cyclic+AMP-responsive+element-binding+protein+phosphorylation+during+long-lasting+long-term+potentiation+in+area+CA1+of+mature+rat+hippocampal-organotypic+cultures.">Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures.</a> Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).</li><li>Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin-dependent+spatial+translocation+of+an+activated+MAP+kinase+in+injured+nerve.">Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve.</a> Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).</li><li>Xiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+mature+hippocampal+slices+in+vitro.">Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro.</a> J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).</li><li>Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern-dependent+role+of+NMDA+receptors+in+actin+potential+generation:+consequences+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation.">Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation.</a> J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).</li></ol>

Les étapes décrites dans le protocole ci-dessus fournissent des conseils comment préparer l&#39;hippocampe aiguë tranches de rats, jeunes ou adultes, induire et enregistrer LTP, disséquer rapidement zone stimulée de tranche, et préparer fraction enrichie nucléaire pour l&#39;étude de la dynamique des protéines dépendantes de l&#39;activité. Cette approche découle de la combinaison de plusieurs méthodes utilisées indépendamment l&#39;une de l&#39;autre. Nous avons optimisé un flux de travail et de fourni...

Synaptic N-méthyl-D-aspartate-récepteurs (récepteurs NMDA) jouent un rôle crucial dans la plasticité synaptique et la survie des cellules de signalisation alors que l&#39;activation des récepteurs NMDA extrasynaptiques peut déclencher la neurodégénérescence et la mort cellulaire. Ces variations dépendent de l&#39;expression des gènes dépendant / d&#39;activité régulée étroitement contrôlé et donc nécessitent une communication constante entre les synapses ou dendrites activées et le noyau 7. Le MAP kinases ERK1 / 2 sont des effecteurs en aval de récepteurs NMDA synaptiques de signalisation et sont impliqués dans l&#39;expression des gènes NMDAR-activation induite, alors que la signalisation via NMDAR extrasynaptique n&#39;a aucun effet ou un effet inhibiteur sur ERK1 / 2 activités 8,11. Il existe un certain nombre de protéines qui ont été montrés pour faire la navette entre les dendrites distales et le noyau. Beaucoup de ces protéines contiennent un signal de localisation nucléaire et sont activement transportés le long de microtubules dans un dynéine et de manière dépendante importin au noyau 6,9. Interestingly, certains seulement de ces messagers transit vers le noyau en réponse à des stimuli spécifiques synaptiques. Par exemple, le transport rétrograde de cyclique élément de réponse AMP protéine de liaison à 2 (CREB2) est induite par LTD chimique mais non LTP 12. Localisée stimulation synaptique NMDAR dépendant entraîne co-activateur transcriptionnel CREB réglementés (CRTC1) dans le noyau, un processus de translocation, qui est impliquée dans la plasticité de l&#39;hippocampe à long terme 4. Il a été récemment montré que le messager de la protéine Jacob translocation vers le noyau après l&#39;autre, l&#39;activation des récepteurs NMDA synaptiques et extrasynaptique et régule CREB gène transcription dépendante 5. L&#39;origine synaptique ou extrasynaptique du signal est encodé dans une modification post-traductionnelle de Jacob. Activité synaptique induit ERK1 / 2 dépend de la phosphorylation de Jacob à une serine en position 180 cruciale (pJacobS 180) qui est une condition nécessaire pour la translocation vers le noyau ultérieur en culture primaire d&#39;hippocampe. De plus, in neurones CA1 de 180 translocation de tranches d&#39;hippocampe aigus vers le noyau après Schaffer garantie LTP mais pas LTD 1,10. PS180 Jacob conduit à une augmentation de l&#39;expression des gènes de plasticité liée et cette expression de gène réinjecte de la fonction synaptique. À l&#39;opposé, Jacob translocation vers le noyau après NMDARs extrasynaptiques activation n&#39;est pas phosphorylée au niveau de Ser180 et peut être associé à différentes complexe protéique dans le noyau provoquant &#39;CREB arrêt&#39; et une rétraction des contacts synaptiques 10. La plupart des études publiées sur l&#39;importation nucléaire de la protéine messager synapto-nucléaire ont été réalisées dans des cultures primaires de neurones dissociés. Par conséquent, il serait intéressant de voir si ces résultats peuvent être reproduits dans physiologiquement plus pertinent conditions en utilisant des coupes d&#39;hippocampe où la connectivité et la fonction neuronale sont beaucoup mieux conservées. Nous présentons ici un protocole optimisé pour évaluer LTP-dependants translocation nucléaire de messagers de protéines par immuno. Ce procédé convient également pour l&#39;analyse de l&#39;activité de phosphorylation dépendant de protéines dans une fraction nucléaire brut. Plus précisément, le protocole actuel consiste à préparer des aigus tranches CA1 de l&#39;hippocampe, de l&#39;induction, et l&#39;enregistrement de la LTP. Ensuite, région CA1 est disséqué au microscope à isoler la région stimulée. Nous avons combiné et modifié le protocole pour l&#39;isolement nucléaire fourni par CellLytic nucléaire Extraction Kit avec modifications introduites par Zhao et ses collègues 17. La procédure optimisée comprend la lyse des régions CA1 disséqués dans un tampon hypotonique permettant gonflement des cellules et la libération des noyaux. La lyse des cellules et la morphologie des noyaux peuvent être déterminés par l&#39;examen microscopique. Enrichissement nucléaire est réalisé par une étape de centrifugation de courte. Analyse immunoblot avec des anticorps contre NeuN et NSE2, les marqueurs spécifiques de fractions cytosoliques ou nucléaires, indique que cette approche peut être utilisée comme un jeûneet le protocole reproductible d&#39;isoler ces fractions subcellulaires et d&#39;étudier modifications post-traductionnelles très labiles comme la phosphorylation des protéines. En outre, ce procédé est avantageux pour de petits échantillons de tissus provenant des régions CA1 de tranches d&#39;hippocampe disséqué et peut être utilisé en combinaison pour l&#39;immunohistochimie de coupes d&#39;hippocampe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CED 1401 AD/DA converter</td>
			<td>Cambridge Electronics Design, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Axon&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.iciba.com/data_acquisition_system">Axon Digidata acquisition system</a></td>
			<td>Axon&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software</td>
			<td>Axon&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2&#65292;Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-97 Standard microelectrode puller</td>
			<td>Sutter&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomicroscope</a></td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica S4E, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome</td>
			<td>Leica VT1000S, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolated pulse stimulator</td>
			<td>Model2100, A-M systmes, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE system</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>JULABO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field Microscope</td>
			<td>NIKON ECLIPSE TS100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, HERAEUS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, SM-5, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting chamber and electric power supplier</td>
			<td>Hoefer Scientific Instruments, San Francisco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>Julabo, F12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submerged type Recording Chamber</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-shape and submerged type incubator&#160;</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic culture dish&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.3957.1</td>
			<td>&#8805;99.5%, p.a.,ACS,ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.6781.1</td>
			<td>&#8805;99.5%, p.a.,ACS,ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td>pro analysi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;2H2O</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>5886.05</td>
			<td>pro analysi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946</td>
			<td>for Molecularbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>12034.025</td>
			<td>for Molecularbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;2H2O</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.06574.1000</td>
			<td>extra pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#183;H2O</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.6887.1</td>
			<td>for Molecularbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.9105.4</td>
			<td>PUFFERAN, &#8805;99.5%, p.a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.06329.1000</td>
			<td>pro analysi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Coctail</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphostop</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline</td>
			<td>Tocris bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Isofluran</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJac-s180</td>
			<td>Biogenes/ purified</td>
			<td></td>
			<td>rabbit (dil. 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>mouse (dil. 1:1,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSE</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>D20H2</td>
			<td>rabbit (dil. 1:1,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5441</td>
			<td>mouse (dil. 1:5,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG HRP Conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>goat anti - mouse (1:5,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG HRP Conjugated</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>goat anti - rabbit (1:5,000)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of ca1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins

Étude de l&#39;expression de l&#39;activité de la protéine dépendante, translocation subcellulaire, ou la phosphorylation est essentiel de comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents de la plasticité synaptique. Potentialisation à long terme (LTP) et la dépression à long terme (LTD) induite dans des coupes d&#39;hippocampe aigus sont largement acceptés comme modèles cellulaires de l&#39;apprentissage et de la mémoire. Il existe de nombreuses études qui utilisent l&#39;imagerie cellulaire ou immunohistochimie approches vivantes de visualiser la dynamique des protéines dépendantes de l&#39;activité. Cependant, ces méthodes reposent sur la pertinence d&#39;anticorps pour immunocytochimie ou surexpression de protéines par fluorescence marqués dans les neurones simples. Immunoblotting des protéines est une méthode alternative fournissant une confirmation indépendante des résultats. Le premier facteur limitant dans la préparation de fractions subcellulaires de tranches d&#39;hippocampe tétanisés individuelles est la faible quantité de matière. D&#39;autre part, la procédure de traitement est cruciale, car même les manipulations très courtes et mineures de la vie des tranches peut induire l&#39;activation de certaines cascades de signalisation. Nous décrivons ici un flux de travail optimisé afin d&#39;obtenir une quantité suffisante de la fraction nucléaire enrichi d&#39;une pureté suffisante de la région CA1 de l&#39;hippocampe aiguës tranches de cerveau de rat. A titre d&#39;exemple représentatif, nous montrons que la ERK1 / 2 sous forme phosphorylée de la protéine messager de synapto-Jacob translocation nucléaire activement au noyau lors de l&#39;induction de la LTP et peut être détectée dans une fraction enrichie nucléaire de neurones CA1.

Nous avons précédemment montré que la protéine messager de synapto-Jacob nucléaire s&#39;accumule dans le noyau suivant l&#39;induction de la LTP mais pas une LTD. De plus, la translocation de Jacob après stimulation synaptique nécessite l&#39;activation de MAPK ERK1 / 2 et la phosphorylation de Ser180 à Jacob (figure 1). Phosphorylée Jacob translocation vers le noyau d&#39;une manière importin-dépendante et la forme phosphorylée peut être conservé pendant de longues périodes d...

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Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Nous fournissons un protocole détaillé pour l&#39;induction de la potentialisation à long terme dans la région CA1 de l&#39;hippocampe et l&#39;isolement subséquent de fractions enrichies à partir de la zone nucléaire tétanisée de la tranche. Cette approche peut être utilisée pour déterminer l&#39;activité dépend énormément des importations de protéines nucléaires dans des modèles cellulaires de l&#39;apprentissage et de la mémoire.

Isolement de CA1 nucléaires enrichies fractions de coupes d&#39;hippocampe pour étudier l&#39;activité dépendante nucléaire importation de Synapto nucléaires protéines Messenger

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Préparation des coupes d&#39;hippocampe aiguë chez des rats et des souris transgéniques pour l&#39;étude des altérations synaptiques au cours du vieillissement et de l&#39;amylose pathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Recherche

Neurosciences

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Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

L&#39;isolement et la culture de neurones de l&#39;hippocampe de souris pendant la grossesse

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Immunohistochimie et d&#39;étiquetage multiple avec des anticorps de l&#39;espèce hôte mêmes pour l&#39;étude des adultes hippocampe neurogenèse

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Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Évaluation de la densité de la Synapse dans des tranches de cerveau de rongeurs hippocampe

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Implantation des sondes de silicium chronique et enregistrement des cellules hippocampiques Place dans un appareil de tapis roulant enrichi

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Une méthode améliorée pour la collecte du liquide céphalo-rachidien de souris anesthésiés

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...