Name: isolation of ca1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins
Uploaded: 2014-08-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins at JoVE.c

This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.

.1 הכנת אקוטית בהיפוקמפוס פרוסות ממוח חולדה למבוגרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי חולדות עם isoflurane. זהירות: בצע את ההליך באמצעות exicator סגור, לא לשאוף isoflurane. ודא כי בעל החיים הוא מורדמים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העכברוש, במה...

<ol>
	<li>Behnisch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translocation+of+Jacob+in+hippocampal+neurons+after+stimuli+inducing+long-term+potentiation+but+not+long-term+depression.">Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression.</a> PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).</li><li>Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+by+the+proteasome+is+required+for+synaptic+tagging+and+the+heterosynaptic+stabilization+of+hippocampal+late-phase+long-term+potentiation.">Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation.</a> Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).</li><li>Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+GABA(A)+inhibition+on+the+expression+of+long-term+potentiation+in+CA1+pyramidal+cells+are+dependent+on+tetanization+parameters.">Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters.</a> Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).</li><li>Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+transport+of+the+transcriptional+coactivator+CRTC1+from+synapse+to+nucleus.">Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus.</a> Cell. 150 (1), 207-221 (2012).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caldendrin-Jacob:+a+protein+liaison+that+couples+NMDA+receptor+signalling+to+the+nucleus.">Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus.</a> PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).</li><li>Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+synapse+to+nucleus+and+back+again--communication+over+distance+within+neurons.">From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).</li><li>Hardingham, G. E., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+versus+extrasynaptic+NMDA+receptor+signalling:+implications+for+neurodegenerative+disorders.">Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).</li><li>Ivanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+role+of+synaptic+and+extrasynaptic+NMDA+receptors+in+regulation+of+the+extracellular+signal-regulated+kinases+(ERK)+activity+in+cultured+rat+hippocampal+neurons.">Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons.</a> J. Physiol. 57, 789-798 (2006).</li><li>Jordan, B. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+protein+shuttling:+the+direct+route+in+synapse-to-nucleus+signaling.">Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling.</a> Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).</li><li>Karpova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+transducing+the+synaptic+or+extrasynaptic+origin+of+NMDA+receptor+signals+to+the+nucleus.">Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus.</a> Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).</li><li>Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+NR2A-+and+NR2B-containing+NMDA+receptors+in+Ras-ERK+signaling+and+AMPA+receptor+trafficking.">Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking.</a> Neuron. 46, 745-760 (2005).</li><li>Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importin-mediated+retrograde+transport+of+CREB2+from+distal+processes+to+the+nucleus+in+neurons.">Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).</li><li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+(P25-30)+rats.">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li><li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+activity-dependent+cyclic+AMP-responsive+element-binding+protein+phosphorylation+during+long-lasting+long-term+potentiation+in+area+CA1+of+mature+rat+hippocampal-organotypic+cultures.">Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures.</a> Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).</li><li>Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin-dependent+spatial+translocation+of+an+activated+MAP+kinase+in+injured+nerve.">Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve.</a> Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).</li><li>Xiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+mature+hippocampal+slices+in+vitro.">Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro.</a> J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).</li><li>Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern-dependent+role+of+NMDA+receptors+in+actin+potential+generation:+consequences+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation.">Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation.</a> J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).</li></ol>

השלבים המתוארים בפרוטוקול לעיל לספק הדרכה כיצד להכין חריף בהיפוקמפוס פרוס מחולדות צעירות או מבוגרים, לעורר והשיא LTP, במהירות לנתח אזור מגורה של הפרוסה, ולהכין חלק מועשר גרעיני ללימוד דינמיקת חלבון תלוי פעילות. גישה זו נובעת משילוב של מספר שיטות שונות המשמשות באופן ע?...

Synaptic N-methyl-D-aspartate-קולטנים (NMDARs) לשחק תפקיד מכריע בפלסטיות הסינפטית והישרדות תא האיתות ואילו הפעלה של NMDARs extrasynaptic יכולים לגרום ניוון מוחיים ומוות של תאים. שינויים אלה תלויים בביטוי גנים תלויים / פעילות מוסדרת לפיקוח הדוק ולכן דורשים תקשורת מתמדת בין הסינפסות מופעלות או דנדריטים והגרעין 7. MAP קינאזות ERK1 / 2 הם effectors במורד הזרם של NMDARs הסינפטי איתות ומעורבות בביטוי גנים הנגרם על ידי NMDAR-הפעלה, ואילו איתות באמצעות NMDAR extrasynaptic יש השפעה מעכבת על ERK1 / 2 פעילות 8,11 לא או. ישנם מספר החלבונים שהוכחו הסעות בין דנדריטים דיסטלי והגרעין. רבים מחלבונים אלו מכילים אות לוקליזציה גרעינית ומועברים באופן פעיל לאורך microtubuli בdynein ואופן importin תלוי לגרעין 6,9. Interestingly, כמה מהשליחים אלה מעבר רק לגרעין בתגובה לגירויים הסינפטי ספציפיים. לדוגמא, תחבורה מדרדר של אלמנט המחזורי AMP תגובה מחייב חלבון 2 (CREB2) היא מושרה על ידי בע&quot;מ הכימי אך לא 12 LTP. גירוי הסינפטי NMDAR תלוי מקומי מניע coactivator מוסדר CREB תעתיק (CRTC1) לתוך הגרעין, תהליך טרנסלוקציה, העוסק בפלסטיות בהיפוקמפוס לטווח ארוך 4. זה היה הראה לאחרונה כי שליח החלבון יעקב translocates לגרעין אחרי שניהם, הפעלת NMDAR הסינפטי וextrasynaptic ומסדיר שעתוק הגנים תלויים CREB 5. המקור הסינפטי או extrasynaptic של האות מקודד בשינוי posttranslational של יעקב. פעילות הסינפטית גורמת ERK1 / 2 זירחון התלוי של יעקב בסרין מכריע בעמדה 180 (pJacobS 180) שבו הוא נחוץ לטרנסלוקציה לאחר הגרעין בתרבות בהיפוקמפוס העיקרית. יתר על כן, אניn נוירונים CA1 של pJacobS פרוסות בהיפוקמפוס חריפה 180 translocates לגרעין לאחר LTP טחונות שפר אך לא בע&quot;מ 1,10. pS180 יעקב מוביל לביטוי מוגבר של גנים הקשורים פלסטיות וביטוי גנים זה הזנות חזרה לתפקוד הסינפטי. בניגוד חד, יעקב שtranslocates לגרעין לאחר הפעלת NMDARs extrasynaptic לא phosphorylated בSer180 ועשויה להיות קשורה לחלבון מורכב שונה בגרעין גורמת ל&#39;CREB לכבות &quot;ונסיגה של קשרים סינפטיים 10. מחקרים שפורסמו ביותר על היבוא הגרעיני של שליח חלבון synapto-גרעיני נעשו בתרבויות עיקריות עצביות ניתק. לכן זה יהיה מעניין לראות אם ניתן לשחזר בממצאים כאלה מבחינה פיזיולוגית יותר רלוונטי תנאי שימוש בפרוסות בהיפוקמפוס בי קישוריות ותפקוד עצביים הם הרבה יותר טוב נשמר. כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם להערכת LTP-deתלוי טרנסלוקציה הגרעינית של שליחי חלבון על ידי immunoblotting. שיטה זו מתאימה גם לניתוח זירחון התלוי פעילות של חלבונים בשבריר גרעיני גולמי. באופן ספציפי, את הפרוטוקול הנוכחי כרוך הכנת פרוסות חריפות בהיפוקמפוס CA1, אינדוקציה, והקלטה של ​​LTP. בשלב הבא, אזור CA1 הוא גזור מיקרוסקופי כדי לבודד את האזור מגורה. שלבנו והותאמנו הפרוטוקול לבידוד גרעיני שסופק על ידי CellLytic גרעיני הפקת ערכה עם שינויים שהוכנסו על ידי זאו ועמיתים 17. הליך אופטימיזציה כולל תמוגה של אזורי CA1 גזורים במאגר hypotonic מאפשרת נפיחות תא ושחרור של גרעינים. תמוגה תא ומורפולוגיה גרעינים ניתן לקבוע על ידי בדיקה מיקרוסקופית. העשרה גרעינית מושגת על ידי צעד צנטריפוגה קצר. Immunoblotting ניתוח עם נוגדנים נגד NeuN וNSE2, סמנים ספציפיים של שברים גרעיניים או cytosolic, מצביע על כך שגישה זו יכולה לשמש כמהירהוהפרוטוקול לשחזור לבודד את השברים subcellular אלה וללמוד שינויי posttranslational מאוד יציבים כמו זרחון חלבון. בנוסף, בשיטה זו יש יתרון לדגימות רקמה קטנות הנובעות מאזורי CA1 גזורים של פרוסות בהיפוקמפוס וניתן להשתמש בו בשילוב לאימונוהיסטוכימיה של פרוסות בהיפוקמפוס.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CED 1401 AD/DA converter</td>
			<td>Cambridge Electronics Design, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Axon&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.iciba.com/data_acquisition_system">Axon Digidata acquisition system</a></td>
			<td>Axon&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software</td>
			<td>Axon&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2&#65292;Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-97 Standard microelectrode puller</td>
			<td>Sutter&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomicroscope</a></td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica S4E, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome</td>
			<td>Leica VT1000S, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolated pulse stimulator</td>
			<td>Model2100, A-M systmes, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE system</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>JULABO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field Microscope</td>
			<td>NIKON ECLIPSE TS100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, HERAEUS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, SM-5, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting chamber and electric power supplier</td>
			<td>Hoefer Scientific Instruments, San Francisco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>Julabo, F12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submerged type Recording Chamber</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-shape and submerged type incubator&#160;</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic culture dish&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.3957.1</td>
			<td>&#8805;99.5%, p.a.,ACS,ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.6781.1</td>
			<td>&#8805;99.5%, p.a.,ACS,ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td>pro analysi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;2H2O</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>5886.05</td>
			<td>pro analysi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946</td>
			<td>for Molecularbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>12034.025</td>
			<td>for Molecularbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;2H2O</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.06574.1000</td>
			<td>extra pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#183;H2O</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.6887.1</td>
			<td>for Molecularbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.9105.4</td>
			<td>PUFFERAN, &#8805;99.5%, p.a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.06329.1000</td>
			<td>pro analysi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Coctail</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphostop</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline</td>
			<td>Tocris bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Isofluran</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJac-s180</td>
			<td>Biogenes/ purified</td>
			<td></td>
			<td>rabbit (dil. 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>mouse (dil. 1:1,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSE</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>D20H2</td>
			<td>rabbit (dil. 1:1,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5441</td>
			<td>mouse (dil. 1:5,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG HRP Conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>goat anti - mouse (1:5,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG HRP Conjugated</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>goat anti - rabbit (1:5,000)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of ca1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins

ביטוי לומד פעילות חלבון תלוי, טרנסלוקציה subcellular, או זירחון הוא חיוני כדי להבין את המנגנונים תאיים הבסיסיים של פלסטיות הסינפטית. הגברה לטווח ארוך (LTP) ודיכאון לטווח ארוך (בע&quot;מ) מושרה בפרוסות בהיפוקמפוס חריפות מקובלים מאוד כמודלים תאיים של למידה וזיכרון. ישנם מספר רב של מחקרים המשתמשים בגישות הדמיה תא או אימונוהיסטוכימיה חיות לדמיין דינמיקת חלבון תלויה פעילות. עם זאת שיטות אלו מסתמכות על התאמתו של נוגדנים לimmunocytochemistry או ביטוי יתר של חלבונים מתויגים הקרינה בתאי עצב בודד. Immunoblotting של חלבונים הוא שיטה חלופית המספקת אישור עצמאי של הממצאים. הגורם המגביל הראשון בהכנה של שברים subcellular מפרוסות בהיפוקמפוס tetanized פרט הוא הכמות הנמוכה של חומר. שני, הליך הטיפול הוא קריטי משום שמניפולציות גם מאוד קצרות וקלות של ליטרiving פרוסות עלולה לגרום להפעלה של מפלי איתות מסוימים. כאן אנו מתארים את זרימת עבודה מותאמת על מנת להשיג כמות מספקת של שבריר מועשר הגרעיני של טוהר מספיק מאזור CA1 של פרוסות בהיפוקמפוס חריפות ממוח חולדה. כדוגמא מייצגת אנו מראים כי צורת ERK1 / 2 פוספורילציה של שליח חלבון synapto-גרעיני יעקב באופן פעיל translocates לגרעין על אינדוקציה של LTP וניתן לאתרם בשבריר מועשר גרעיני מתאי עצב CA1.

יש לנו הראינו בעבר כי שליח חלבון synapto-גרעיני יעקב מצטבר בגרעין בעקבות האינדוקציה של LTP אבל לא 1 בע&quot;מ. יתר על כן, טרנסלוקציה של יעקב לאחר גירוי הסינפטי דורשת הפעלה של MAPK ERK1 / 2 וזירחון של יעקב בSer180 (איור 1). פוספורילציה יעקב translocates לגרעין באופן importin תלוי ומ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins at JoVE.c

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לאינדוקציה של הגברה לטווח ארוך באזור CA1 של ההיפוקמפוס והבידוד הבא של שברים מועשרים גרעיניים מאזור tetanized של הפרוסה. גישה זו יכולה לשמש כדי לקבוע פעילות יבוא חלבון גרעיני תלוי בדגמים סלולריים של למידה וזיכרון.

בידוד של CA1 גרעיני שברים מועשרים מSlices בהיפוקמפוס לחקר פעילות תלויה גרעיני יבוא של חלבונים Messenger synapto-גרעיניים

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

הכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות חריפה העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים Synaptic במהלך ההזדקנות עמילואיד פתולוגיה

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

ממברנות המיטוכונדריה הקשורים ER (MAMs) וMicrodomains Glycosphingolipid המועשר (אובניים חן): בידוד ממוח עכבר

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

חקירה של Synaptic תיוג / לכידה וצלב-לכידה באמצעות חריפות בהיפוקמפוס פרוסות ממכרסמים

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

השרשה של הגששים סיליקון כרונית ורישום של תאים בהיפוקמפוס המקום מכשיר הליכון מועשר

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

שיטה משופרת עבור אוסף של נוזל של עכברים מורדם

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...