Name: protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves
Uploaded: 2014-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Jürgen Soll for nyttige diskusjoner og Chris Carrie for kritisk lesing av manuskriptet. Dette prosjektet ble finansiert av DFG og Fonds der chemischen Industrie (tilskudd tall SFB 1035, prosjekt A04 til SS og Do 187/22 til RS).

En. Transformasjon av BiFC Konstruerer i Agrobacteria <ol><li> Kloning av BiFC konstruerer <ol><li> Forsterke genet av interesse fra en passende mal bruker oligonukleotider som inneholder flankerer attB-sider. Utfør en PCR ved hjelp av en korrekturlesing polymerase. Tilpass lengden av glødetrinn til det utformet primer kombinasjon og lengden av forlengelsen trinn i henhold til fragment størrelse. Kontroller PCR produktet ved agarosegelelektroforese og rense den ved hjelp av en PCR Clean-up Kit. </li><li> Utfør BP ...

<ol>
	<li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).</li><li>Weinthal, D., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+in+plant+cells+by+bimolecular+fluorescence+complementation+assay.">Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay.</a> Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants.">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Lee, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+a+cDNA+library+for+protein-protein+interactions+directly+in+planta.">Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta.</a> Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).</li><li>McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ABCG+transporters,+which+are+required+for+export+of+diverse+cuticular+lipids,+dimerize+in+different+combinations.">Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations.</a> Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).</li><li>Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+studies+between+the+chloroplast+signal+recognition+particle+subunit+cpSRP43+and+the+full-length+translocase+Alb3+reveal+a+membrane-embedded+binding+region+in+Alb3+protein.">Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).</li><li>Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+GATEWAY+vectors+for+high+throughput+analyses+of+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).</li><li>Qbadou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+chaperone+Hsp90+delivers+precursor+proteins+to+the+chloroplast+import+receptor+Toc64.">The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64.</a> EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).</li><li>Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+is+a+chaperone+docking+protein+of+the+Sec+translocon+in+Arabidopsis.">AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis.</a> J. Cell Sci. , (2012).</li><li>Schweiger, R., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+as+part+of+the+Arabidopsis+Sec+post-translocon.">AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon.</a> Plant Signal Behav. 8, (2013).</li><li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants.">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51, 1126-1136 (2007).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li><li>Koop, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation.">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199, 193-201 (1996).</li></ol>

Ved planlegging av en BiFC eksperiment flere punkter bør vurderes. Selv om ingen strukturell informasjon om de proteiner av interesse er nødvendig, har topologien til å være kjent når man arbeider med membran som strekker seg over proteiner. De fluorescerende proteiner har til å ligge i samme subcellulære rom eller vender den samme side av en membran for å tillate interaksjon. Naturligvis, ved analyse av proteiner som krever en N-terminal sekvensstyringen, bare en C-terminal-koden kan bli vurdert. Siden det er m...

Studerer dannelsen av protein komplekser og deres lokalisering i planteceller in vivo er viktig å undersøke mobilnettverk, signal og metabolske prosesser. BiFC tillater visualisering av protein-protein interaksjoner i sitt naturlige miljø direkte i levende plantecelle 1-5. I BiFC nærmer komplementering av to nonfluorescent N-og C-terminale fragmenter av et fluorescerende protein fører til et rekonstituert fluorescerende protein. Fragmenter av mange forskjellige fluorescerende proteiner har blitt brukt for å påvise protein interaksjoner, for eksempel grønt fluorescerende protein (GFP) chromophore som er kjemisk dannet av tre forskjellige rester 6. Fluorescent proteiner kan halveres i en løkke eller ß-tråd for å føre de to nonfluorescent fragmenter som kan bli sammensmeltet til både proteiner av interesse. Målingen kan brukes til å detektere vekselvirkninger i en hvilken som helst subcellulære kupént i en hvilken som helst aerobt voksende organismer eller celler som kan bli genetisk modifisert for å uttrykke fusjonsproteiner. Hvis de to proteinene kommer til tett nærhet i cellen, blir fluorescens rekonstituert og kan overvåkes ved mikroskopi uten tilsetning av eksogene fluoroforer eller fargestoffer 3. Tobakk (Nicotiana benthamiana) har vist seg å være en praktisk modellorganisme for å visualisere samspillet mellom planteproteiner, siden proteiner kan lett komme til uttrykk ved å utnytte agrobacterium-mediert transformasjon av tobakk blader med de genererte konstruksjoner. Agrobacteria bruke en såkalt Ti-plasmid (tumorinduserende) som koder for enzymer som medierer den transduksjon av genet av interesse inn i planteceller. BiFC er anvendelig også for løselige så vel som for membranproteiner i alle cellene og har vært brukt med hell i de siste årene for å identifisere samspill proteiner in vivo, så vel som for å analysere interaksjon stederinnenfor proteiner 7-9. Ved ekspresjon av de innførte genene, kan vekselvirkningen mellom de fluorescerende proteiner visualiseres direkte i blader, som er egnet for større cellulære strukturer, slik som det endoplasmatiske retikulum (ER), plasma membran eller kloroplaster. Imidlertid, for å overvåke lokaliseringen i mer raffinerte strukturer, f.eks kloroplast konvolutt, er det tilrådelig å visualisere fluorescens i protoplaster isolert fra transformerte tobakksblader. Et sett med BiFC vektorer inneholdende enten en C-terminal eller en N-terminal fluorescerende merke må brukes for BiFC tilnærming i planter 10. Den heretter beskrevet protokollen ble brukt til å studere samspillet av cytosoliske heat shock protein 90 (HSP90) med tetratricopeptide gjenta (TPR) domene som inneholder docking proteiner Toc64 og AtTPR7 bosatt i kloroplast ytre konvolutt og det endoplasmatiske retikulum, henholdsvis 11-13. For dette formål ble HSP90 smeltet til Cterminal del av SCFP (SCFP C). Brikken var N-terminalt smeltet til anstand for å sikre tilgjengelighet for den C-terminale MEEVD bindende motivet av HSP90 å klemme-type TPR domener. Parallelt med dette ble den N-terminale del av Venus (Venus N) sammensmeltet til de cytosoliske domener av TPR domene som inneholder docking proteiner Toc64 og AtTPR7, respektivt. Som en negativ kontroll vi klonet det oppløselige C-terminale del av SCFP C utelukkende som ligger i cytosol og er derfor en passende kontroll. Fluorescerende tags av de studerte proteinene har for å møte de samme cellulære rommet for å tillate nærhet og dermed tilberedning av fluorescerende signal. For å bestemme lokaliseringen av den rekonstituerte fluorescerende signal på en markør protein kondensert til en annen fluorescerende tag kan kotransformert å demonstrere den subcellulære lokalisering av interaksjonen. En ER markør protein smeltet til mCherrry ble forvandlet samtidig iVed akuttmottaket ligger AtTPR7 14. Den autofluorescence av klorofyll fungert som kloroplast markør i tilfelle Toc64. Ved dette ikke bare den in vivo interaksjon av Toc64 og AtTPR7, henholdsvis med den cytosoliske HSP90 anstand kan overvåkes direkte i tobakksblader, men også den subcellulære lokalisering av interaksjonen kan undersøkes. BiFC er godt egnet som en komplementær tilnærming til andre metoder som studerer protein-protein interaksjoner. Sammenlignet med coimmunoprecipitation eller in vitro-pull-down eksperimenter, for eksempel, ingen spesifikke antistoffer må være tilgjengelig for proteinene av interesse, og proteiner behøver ikke å være rekombinant uttrykt in vitro, noe som kan være vanskelig, særlig for membranproteiner. Videre også forbigående interaksjoner kan overvåkes ved hjelp BiFC, siden proteiner er fanget av et samspill av de smeltet fluorescerende tagger 15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">3&#39;,5&#39;-Dimethoxy-4&#39;-hydroxyacetophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">D134406</td>
			<td style="width:195px;">Acetosyringone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Cellulase, Onozuka-R10</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">16419</td>
			<td>from Trichoderma viridae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Macerozyme R-10&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">28302</td>
			<td>from Rhizopus sp</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:293px;">GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11789-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11791-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:255px;">27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td style="width:147px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:255px;">740609-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-GWVYNE</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-VYNE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:293px;">pDEST-SCYCE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves

Mange proteiner samhandle forbigående med andre proteiner, eller er integrert i multiproteinkomplekser å utføre sin biologiske funksjon. Bimolecular fluorescens komplementering (BiFC) er en in vivo metode for å overvåke slike interaksjoner i planteceller. I den fremlagte protokoll de undersøkte kandidat proteiner er fusjonert til komplementære halvdeler av fluorescerende proteiner og de respektive konstruksjoner innføres i planteceller via Agrobacterium-formidlet transformasjon. Deretter blir proteinene forbigående uttrykt i tobakksblader, og de gjenopprettede fluorescerende signaler kan detekteres med en konfokal laser scanning mikroskop i intakte celler. Dette tillater ikke bare visualisering av interaksjonen seg selv, men også den subcellulære lokalisering av proteinkomplekser kan bestemmes. For dette formål kan markørgener inneholdende et fluoriserende kode kan coexpressed sammen med BiFC konstruksjoner, og dermed å visualisere cellulære strukturer som for eksempel tHan endoplasmatiske retikulum, mitokondrier, Golgi-apparatet eller plasmamembranen. Det fluorescerende signalet kan overvåkes enten direkte i epidermale celler blad eller i enkle protoplaster, som lett kan isoleres fra de transformerte tobakksblader. BiFC er ideell for å studere protein-protein interaksjoner i sine naturlige omgivelser i den levende celle. Imidlertid må det tas i betraktning at uttrykket må være drevet av sterke promotorer, og at interaksjonspartnere er modifisert på grunn av sammensmelting av de forholdsvis store fluorescens-koder, noe som kan forstyrre interaksjonen mekanisme. Likevel er BiFC en utmerket komplementær tilnærming til andre vanlig anvendte metoder undersøker protein-protein interaksjoner, for eksempel coimmunoprecipitation, in vitro pull-down analyser eller gjær-to-hybrid eksperimenter.

I dette eksemplet har vi brukt BiFC metode for å overvåke samspillet av cytosoliske molekylære anstand HSP90 med membran docking proteiner AtTPR7 og Toc64. AtTPR7 er en del av Sec translocon og samhandler med cytosoliske anstand, som muligens leverer sekretoriske preproteiner for post-translasjonell translokasjon til ER membranen. Likeledes, Toc64 på kloroplast ytre konvolutt opptrer i post-translasjonell import ved å motta HSP90 forbundet chloroplast preproteiner. Begge proteiner omfatte en cytosoliske eksponert T...

Watch this Scientific Journal Video about Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves at JoVE.com

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Dannelse av protein komplekser in vivo kan visualiseres ved bimolecular fluorescens complementation. Interaksjonspartnere er smeltet sammen til komplementære deler av fluoriserende koder og forbigående uttrykt i tobakksblader, som resulterer i et rekonstituert fluorescerende signal på tett nærhet av de to proteiner.

Protein-protein interaksjoner visualisert ved bimolekylær fluorescens complementation i Tobakk Protoplaster og blader

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Flowcytometrisk analyse av bimolecular Fluorescens complementation: En høy gjennomstrømning Kvantitativ metode for å studere protein-protein interaksjon

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Gransker Protein-protein interaksjoner i levende celler ved hjelp Bioluminesens Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaksjon Screening av Protein-fragment Komplemente analyse (PCA) i levende celler

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...