Name: protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves
Uploaded: 2014-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves at JoVE.com

Vi vill tacka Jürgen Soll för bra diskussioner och Chris Carrie för kritisk läsning av manuskriptet. Projektet har finansierats av DFG och Fonds der chemischen Industrie (bidrag nummer SFB 1035, projekt A04 till SS och gör 187/22 till RS).

1. Transformation av BiFC Konstrukt i Agrobacteria <ol><li> Kloning av BiFC konstruktioner <ol><li> Amplifiera genen av intresse från en lämplig mall med användning av oligonukleotider som innehåller flankerande attB-ställen. Utför en PCR med hjälp av en korrekturläsning polymeras. Adapt längden av härdningssteget med konstruktions primerkombination och längden av förlängningssteg enligt den fragmentstorlek. Kontrollera den PCR-produkt genom agarosgelelektrofores och rena den genom att använda ett PCR Cl...

<ol>
	<li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).</li><li>Weinthal, D., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+in+plant+cells+by+bimolecular+fluorescence+complementation+assay.">Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay.</a> Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants.">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Lee, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+a+cDNA+library+for+protein-protein+interactions+directly+in+planta.">Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta.</a> Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).</li><li>McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ABCG+transporters,+which+are+required+for+export+of+diverse+cuticular+lipids,+dimerize+in+different+combinations.">Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations.</a> Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).</li><li>Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+studies+between+the+chloroplast+signal+recognition+particle+subunit+cpSRP43+and+the+full-length+translocase+Alb3+reveal+a+membrane-embedded+binding+region+in+Alb3+protein.">Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).</li><li>Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+GATEWAY+vectors+for+high+throughput+analyses+of+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).</li><li>Qbadou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+chaperone+Hsp90+delivers+precursor+proteins+to+the+chloroplast+import+receptor+Toc64.">The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64.</a> EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).</li><li>Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+is+a+chaperone+docking+protein+of+the+Sec+translocon+in+Arabidopsis.">AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis.</a> J. Cell Sci. , (2012).</li><li>Schweiger, R., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+as+part+of+the+Arabidopsis+Sec+post-translocon.">AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon.</a> Plant Signal Behav. 8, (2013).</li><li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants.">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51, 1126-1136 (2007).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li><li>Koop, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation.">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199, 193-201 (1996).</li></ol>

Vid planeringen av en BiFC experiment flera punkter bör beaktas. Även om ingen strukturell information om de proteiner av intresse krävs, har topologin att vara känd när man arbetar med membranöverbryggande proteiner. De fluorescerande proteinerna måste bo i samma subcellulära fack eller står inför samma sida av ett membran för att möjliggöra samverkan. Naturligtvis, när analysera proteiner som kräver en N-terminal målsökningssekvensen, endast en C-terminal tag kan övervägas. Eftersom det är möjligt...

Att studera bildningen av proteinkomplex och deras lokalisering i växtceller in vivo är nödvändig för att undersöka cellulära nät, signal-och metaboliska processer. BiFC tillåter visualisering av protein-proteininteraktioner i sin naturliga miljö direkt i levande växtcell 1-5. I BiFC närmar komplementering av två icke-fluorescerande N-och C-terminala fragment av ett fluorescerande protein leder till en rekonstituerad fluorescerande protein. Fragment av många olika fluorescerande proteiner har använts för att detektera protein-interaktioner, t.ex. grönt fluorescerande protein (GFP) kromoforen som är kemiskt bildad av tre distinkta rester 6. Fluorescerande proteiner kan halveras inom en slinga eller SS-strängen för att resultera i de två icke-fluorescerande fragment, vilka kan vara kondenserade till båda proteinerna av intresse. Analysen kan användas för att upptäcka interaktioner i någon subcellulär fack fyrant på något aerobiskt växande organism eller celler som kan modifieras genetiskt för att uttrycka fusionsproteinerna. Om de två proteinerna komma i omedelbar närhet inom cellen, är fluorescens rekonstitueras och kan övervakas genom mikroskopi utan tillsats av exogena fluoroforer eller färgämnen 3. Tobak (Nicotiana benthamiana) har visat sig vara en lämplig modellorganism för att visualisera samspelet av växtproteiner, eftersom proteiner lätt kan uttryckas genom att använda Agrobacterium-medierad omvandling av tobaksbladen med de genererade konstruktioner. Agrobakterier använda en s.k. Ti-plasmid (tumörinducerande) som kodar för enzymer som förmedlar transduktion av den intressanta genen i växtceller. BiFC är väl tillämplig för lösligt såväl som för membranproteiner inom samtliga cellulära avdelningar och har framgångsrikt använts under de senaste åren för att identifiera interagerande proteiner in vivo såväl som för att analysera interaktionsställeninom proteinerna 7-9. Vid uttryck av de introducerade generna, kan interaktionen mellan de fluorescerande proteinerna visualiseras direkt i bladen, som är lämplig för större cellulära strukturer, såsom det endoplasmatiska retiklet (ER), plasmamembranet eller kloroplaster. Men för att övervaka lokalisering i mer förfinade strukturer, till exempel, kloroplasten höljet, är det lämpligt att visualisera fluorescensen i protoplaster isolerade från transformerade tobaksblad. En uppsättning BiFC vektorer innehållande antingen en C-terminal eller N-terminal fluorescerande tagg måste användas för BiFC tillvägagångssätt i växter 10. Den nedan beskrivna protokollet användes för att studera växelverkan mellan cytosoliskt värmechockprotein 90 (HSP90) med tetratricopeptide repeat (RTB) domän som innehåller dockning proteiner Toc64 och AtTPR7 bor i kloroplasten yttre kuvertet och det endoplasmatiska nätverket, respektive 11-13. För detta ändamål var HSP90 fuserad till CtPlint del av SCFP (SCFP C). Taggen var N-terminalt sammansmält med kaperon för att säkerställa tillgängligheten av den C-terminala MEEVD bindande motivet av HSP90 till klämtyp TPR domäner. Parallellt var den N-terminala delen av Venus (Venus N) sammansmält med de cytosoliska domänerna av TPR domän innehållande dockning proteiner Toc64 och AtTPR7, respektive. Som en negativ kontroll vi klonat den lösliga C-terminala delen av SCFP C enbart som bor i cytosolen och är därför en lämplig kontroll. De fluorescerande taggarna i de studerade proteinerna måste möta samma cellulära utrymmet för att tillåta närhet och därmed beredning av fluorescerande signal. För att bestämma lokaliseringen av den rekonstituerade fluorescerande signal ett markörprotein sammansmält med en annan fluorescens tagg kan samtransformeras för att demonstrera den subcellulära lokaliseringen av interaktionen. En ER markörprotein fuserat till mCherrry förvandlades samtidigt ifallet av ER belägen AtTPR7 14. Den autofluorescens av klorofyll gjorde som kloroplast markör vid Toc64. Genom att detta inte bara interaktionen av Toc64 och AtTPR7, respektive, med den cytosoliska HSP90 chaperone in vivo kan övervakas direkt i tobaksbladen, utan också av den subcellulära lokaliseringen av samverkan kan undersökas. BiFC är väl lämpad som ett komplement till andra metoder som studerar protein-proteininteraktioner. Jämfört med coimmunoprecipitation eller i rullgardins vitro experiment, till exempel, finns det inga specifika antikroppar måste finnas tillgängliga för proteinerna av intresse, och proteinerna måste inte uttryckas rekombinant in vitro, vilket kan vara en utmaning, särskilt för membranproteiner. Dessutom även transienta interaktioner kan övervakas med hjälp BiFC, eftersom proteinerna fångas genom interaktionen av de fuserade fluorescerande taggar 15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">3&#39;,5&#39;-Dimethoxy-4&#39;-hydroxyacetophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">D134406</td>
			<td style="width:195px;">Acetosyringone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Cellulase, Onozuka-R10</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">16419</td>
			<td>from Trichoderma viridae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Macerozyme R-10&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">28302</td>
			<td>from Rhizopus sp</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:293px;">GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11789-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11791-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:255px;">27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td style="width:147px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:255px;">740609-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-GWVYNE</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-VYNE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:293px;">pDEST-SCYCE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves

Många proteiner interagera transient med andra proteiner eller integreras i multiproteinkomplex för att utföra sin biologiska funktion. Bimolecular fluorescens komplementering (BiFC) är en in vivo-metod för att övervaka sådana interaktioner i växtceller. I den presenterade protokollet de undersökta kandidat proteiner smält till kompletterande halvor av fluorescerande proteiner och respektive konstruktioner introduceras i växtceller via Agrobacterium-medierad omvandling. Därefter är de proteiner som uttrycktes transient i tobaksblad och de återställda fluorescerande signalerna kan detekteras med ett konfokalt lasersvepmikroskop i intakta celler. Detta gör inte bara visualisering av interaktionen, utan även den subcellulära lokaliseringen av de protein-komplex kan bestämmas. För detta ändamål kan markörgener som innehåller en fluorescerande taggen samuttrycks tillsammans med BiFC konstruktioner sålunda visualisera cellulära strukturer såsom than endoplasmatiska retiklet, mitokondrier Golgi-apparaten eller plasmamembranet. Den fluorescerande signal kan övervakas, antingen direkt i epidermala bladceller eller i enkelprotoplaster, vilka lätt kan isoleras från de transformerade tobaksblad. BiFC är idealisk för att studera protein-proteininteraktioner i deras naturliga miljö i den levande cellen. Dock måste det anses att uttrycket måste drivas av starka promotorer och att interaktionspartners modifieras på grund av fusion av de relativt stora fluorescens-taggar, som kan påverka interaktionen mekanismen. Icke desto mindre är BiFC ett utmärkt komplement till andra vanligen tillämpade metoder undersöker protein-proteininteraktioner, såsom coimmunoprecipitation, in vitro-pull-down assays eller jäst-två-hybrid-experiment.

I detta exempel använde vi BiFC metod för att följa interaktionen av den cytosoliska molekylär chaperon HSP90 med membrandockningsproteiner AtTPR7 och Toc64. AtTPR7 är en del av Sec translocon och interagerar med cytosoliska chaperoner, som eventuellt levererar sekretoriska preproteins för posttranslationell translokation till ER-membranet. Likaså Toc64 på kloroplasten ytterkuvertet agerar i post-translationell import genom att ta emot HSP90 tillhörande kloroplast preproteins. Båda proteiner innefattar ett cyt...

Watch this Scientific Journal Video about Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves at JoVE.com

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Bildning av protein-komplex in vivo kan visualiseras genom bimolekylära fluorescens komplementering. Interaktionspartner är fuserade till komplementära delar av fluorescerande taggar och uttrycktes transient i tobaksblad, vilket resulterar i en rekonstituerad fluorescerande signal vid närhet av de två proteinerna.

Protein-protein interaktioner visualiseras genom Bimolecular Fluorescens Komplettering i tobaksprotoplaster och Löv

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescens Aktiverade cellsortering för växt Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescens komplement (BiFC) analys av protein-protein interaktion i lök celler med Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In vivo Detektion av protein-protein interaktioner på mikro-mönstrade ytor

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell elektrosvetsade visualiseras med fluorescensmikroskopi

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein interaktioner In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Bimolecular Fluorescens komplement

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

Detektion av protein interaktioner i Plant använder gateway Kompatibel komplettering Bimolecular Fluorescence (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Flödescytometrianalyser av Bimolecular Fluorescens Komplettering: En hög genomströmning kvantitativ metod för att studera protein-protein interaktion

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Undersökning av protein-proteininteraktioner i levande celler med hjälp Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genomvid Protein-proteininteraktion Screening av Protein-fragment kompletteringsanalys (PCA) i levande celler

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...