Name: a method to make a craniotomy on the ventral skull of neonate rodents
Uploaded: 2014-05-22T14:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud G12-RR003060 fra NIH / NCRR / RCMI indrømme SC1HD068129 fra Eunice Shriver National Institute of Child Health &amp; Human Development, National Science Foundation cbet 0.754.158 og PSC-CUNY 62.337-00 40 fra City University of New York.

Følgende protokol følger retningslinjerne dyrepleje fastlagt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på City College i New York. 1.. Animal Intubation (10-20 min) <ol><li> Før operation, forberede pattedyr Ringer-opløsning. Saml kirurgiske redskaber, varmepude, og små dyr ventilator på bænken (Figur 2). <ol><li> Til måling af blod-hjerne-barriere-permeabilitet laver 10 ml 1% bovint serumalbumin (BSA) opløsning Ringer og opløses TRITC-dextran-155 kD ved 8 mg / ml i 1% BSA-opløsning, filtreres opløsning med 25 mm sprøjtefilter (0,2 um porestørrelse) og opbevar det i en folieklap sprøjte i mørke. </li></ol></li><li> Bedøver dyret ved hjælp af isofluran. Brug 5,0% til induktion og 1,5-3,0% for vedligeholdelse. Alternativt kan en blanding af ketamin (41,7 mg / kg) og xylazin (2,5 mg / kg) kan anvendes. Dybde af anæstesi kan kontrolleres ved tå knivspids refleks aføvre og nedre ekstremiteter. <ol><li> Efterfølgende doser af ketamin (41,7 mg / kg legemsvægt) og xylazin (2,3 mg / kg legemsvægt) skal administreres i intervaller af ⅓ af den maksimale dosis for at undgå overdosering. Anvendelse af en gnaver ventilator anbefales at modvirke xylazin-induceret respirationsdepression. </li></ol></li><li> Placer bedøvede pup liggende på rygsiden og sikre dets hoved med Plastskålen anvendt til at levere bedøvelsesmiddel (figur 3a). <ol><li> Fastgør dyret med tape på Forlemmerne og hale (figur 3a). </li><li> Et alternativ til at fastgøre pup hoved er at bruge et hoved plade fastgjort til en metalstang. Bemærk: Sørg for varmepuden er sat til 37 ° C for at undgå hypotermi (figur 3a). </li></ol></li><li> Saks (figur 2b) for at gøre en langsgående og fire laterale indsnit på huden overliggende halsen (Figur 3b). Ved hjælp af stump teknik, dissekere huden og læg den til side med pincet (figur 2c og 3c). <ol><li> Hold huden ned med tape. Stabiliser hovedet i en vandret stilling (fig. 3c). </li></ol></li><li> Brug foråret saks (Figur 2D) og stump teknik, push kirtler og fedt lag bort for at blotlægge trachea (figur 3c). Identificer placeringen af ​​halspulsårer. <ol><li> Hold halspulsårer væk fra luftrøret. Bemærk: punktere halspulsåren kan resultere i massive blodtab og død hvalp. </li></ol></li><li> Brug foråret saks (Figur 2d) dissekere de langsgående muskler dækker luftrøret. Skær de langsgående muskler placeret under luftrøret (figur 3d). Bemærk: De luftrør ringene skal være klart synlig (figur 3e). <ol><li> Brugpincet (fig. 2c), binde to stykker sutur rundt om trachea. Et stykke af sutur vil sikre udluftningsrøret og det andet gevind vil blive brugt til at lukke luftrøret rostralt udluftningsrøret indsætningspunktet (figur 4a). Bemærk: Fugt eksponeret væv regelmæssigt med Ringer-opløsning for at undgå dehydrering. </li></ol></li><li> Brug af foråret saks (figur 2d) at foretage et snit på en af tracheale ringe er placeret mellem de to tråde er anbragt i trin 1.6.1 (figur 4c). Bemærk: Sørg for, at ingen væske ind i åbne luftrøret. Væske i luftrøret vil forårsage kvælning. </li><li> Sæt intubationsrøret (figur 4b) i luftrøret og spænd den nederste tråd for at sikre det. Brug pincet (Figur 2c), stramme overtråden for at lukke luftrøret posterior til indsætningspunktet i intubationsrøret. <ol><li> Tighten og trim enderne af to tråde (4d-f). Bemærk: Vapor inde i intubationsrøret er et godt tegn på luftmængdestyring. </li></ol></li><li> Straks skifte isofluran forsyningen til ventilatoren. Juster slagvolumen og luftskiftet i henhold til vægten af ​​dyret. <ol><li> Forsegle udsatte omgivende væv med elastomer (figur 5a). Hold overfladen fugtes og rene. </li></ol></li></ol> 2.. Luftrøret og Muscle Fjernelse at eksponere Cranium (5-10 min) <ol><li> Brug foråret saks (figur 2d) til at skære luftrøret støder op til udluftningsrøret. Udføre to snit langs musklen væg mundhulen at afsløre den kaudale ende af ganen (figur 5b). Bemærk: Hvis det er nødvendigt, skal du bruge en cauterizer at stoppe blødningen. Ukontrolleret blødning vil forårsage død af dyret. </li><li> Rengørområde med rigelige mængder af Ringer-opløsning (figur 5c). Identificer gabet mellem den sidste ryghvirvler og dybest nakkebenet (figur 5d). Bemærk: Kløften mellem knoglerne er et nyttigt kranium milepæl at lokalisere hjernestamme strukturer. Den ringere oliven er placeret under dette hul. Den auditive overlegne olivary kompleks ligger under basi-occipital knogle i rostral retning fra dette hul (se figur 1). </li><li> Rengør området med pincet (figur 2C) og foråret saks (Figur 2d). Må ikke punkteres blodkar. Bemærk: Hvis det er nødvendigt, ætse at stoppe blødningen. <ol><li> Efter det eksponerede område er fri for fedt-og muskelvæv, bør den plads, der adskiller dybest nakkebenet og den sidste ryghvirvel være synlig (figur 5d). </li></ol></li></ol> 3.. Kraniotomi (15-30 min) <ol><li> Brug en mikroborehuller eller en ultrasonic sæbe. Find den mediale væg bulla. <ol><li> Tynd kraniet ved at gøre et omvendt U form, indtil de underliggende arterier er synlige (fig. 5e). Bemærk: Den basilararterien (bas) kører på toppen af hjernestammen midterlinjen. Den forreste ringere cerebellare arterie (AICA) filialer bilateralt og kan bruges pålideligt som en milepæl, da det har en konstant position i forskellige dyr. </li><li> Når kraniet fortyndes forsigtigt bryde det ved hjælp af en dissekere mejsel (Figur 2e). Fjern knoglen stykke med pincet (figur 2c). Alternativt, løft og bryde kraniet ved en bøjet nål. Bemærk: Gentag denne procedure, indtil den størrelse og form af kraniotomi er passende for den planlagte eksperiment. De bas og AICA skal være synlig gennem dura membran (fig. 5f). </li></ol></li><li> Rengør området flere gange med frisk Ringer løsning. Brug absorberende pads tørre overfladen af ​​dura membran. <ol><li> Brug om nødvendigt en sutur nål til at fjerne dura membran uden at flytte eller bryde den skelsættende arterier bas og AICA. Bemærk: Ved dura punktere cerebrospinalvæske vil flyde ud. Rengør området med Ringer-opløsning og holde fugtet gennem hele forsøget. </li></ol></li></ol> 4.. Elektrofysiologi Experiment <ol><li> Vælg polytrode ifølge eksperiment design (figur 7a). Brug en fin pensel til pels polytrode med Dil. Overfør Dil opløsning i en 1 ml mikrocentrifugerør, dyppe penslen i løsningen og forsigtigt strejke polytrode under visuel vejledning (dvs. ved hjælp af en stereoscope). Start på spidsen af ​​sonden og omhyggeligt indtil alle elektroder er belagt ensartet. <ol><li> Placer jordelektroden inde i mundhulen. Indlæs polytrode i elektrodeholderen (figur 7b </strong&gt;). </li><li> Tænd for forstærkeren og kontrollere, at alle forbindelser fungerer godt. </li></ol></li><li> Placer elektroden over bas på den gren punkt AICA (position nul). Flyt elektroden til det ønskede målpunkt ved anvendelse af den passende rostralt-sidekoordinaten (fig. 7c). <ol><li> Sæt elektroden på hjernen overflade og flytte det til den ønskede dybde i trin på 5-10 mM. </li></ol></li><li> Udfør optagelse i henhold til eksperimentel design. Gemme data til yderligere analyse. </li></ol> 5. To-foton Imaging Experiment <ol><li> Tænd mikroskopet. Indstil excitationsbølgelængden og bruge en passende emission filter. Excitation ved 800 nm og en 607 ± 45 nm band-pass emission filter arbejde godt for billeddannelse TRITC-dextran. </li><li> Identificer højre eller venstre halspulsåre. Ved stump teknik dissekere halspulsåren fra de tilstødende bindevæv eller nerver. <ol><li> Pluk og hold carotisarterie med en hæmostat. Bind tre stykker af sutur omkring halspulsåren. </li><li> Spænd tråden tættere på hjertet side for at stoppe blodgennemstrømningen og efterlade de to andre tråde løs. </li><li> Brug fine saks til at lave et lille snit i en 45 ° vinkel på halspulsåren mellem den bundne tråd og den næste løs tråd. Bemærk: Rengør blod med absorberende papir. </li></ol></li><li> Cannulate halspulsåren. Sæt slangen fyldt op med TRITC-dextranopløsningen i snit på halspulsåren omkring 5 mm dyb orienteret mod hvalpen hoved. <ol><li> Spænd de to andre tråde omkring arterien for at holde slangen og arterien sammen. Stram trådene, trim og tilføje elastomer til yderligere at stabilisere. Bemærk: Den anden side af røret er forbundet med sprøjten med TRITC-dextran-opløsning (fremstillet i trin 1.1). </li></ol></li><li> Fastgør sprøjten på sprøjtepumpen. <ol><li> Sethastigheden halspulsåren blod strømningshastighed pup. Tænd sprøjtepumpen nogle få sekunder, og kontrollér manuelt at farvestoffet opløsning kan injiceres i halspulsåren. Bemærk: Hvis man antager, at blod flow i halspulsåren af voksne rotter (240-280 g), er omkring 3 ml / min 14, kan blodgennemstrømningen sats for en rotteafkommets (fx P10 pup vejer 15-25 g) beregnes til området fra 0,16 til 0,3 ml / min. </li></ol></li><li> Placer dyret under mikroskop mål. Sprøjt fluorescerende dextran ind i blodbanen. <ol><li> Identificere områder af interesse på den ventrale hjernestammen med en 5x luft mål. Skift til en 20X eller 40X målsætning (nedsænkning i vand, NA = 0,5 eller 0,8, henholdsvis) for at fokusere regionen af ​​interesse (ROI). </li><li> Start billedbehandling og justere billedet erhvervelse parametre (f.eks eksponering tid, laser magt, detektor gain), indtil fluorescensintensitet i karrene af ROI er optimeret (dvs.ikke er for lavt, men ikke mættet). </li><li> Tænd sprøjtepumpen at injicere farveopløsning i halspulsåren og erhverve en tidsserie på et fast brændplan. </li></ol></li></ol> 6.. Animal Care følgende procedure <ol><li> Dette er en terminal procedure. Ved afslutningen af ​​et eksperiment dyr skal aflives med en overdosis pentobarbital (100 mg / kg, intraperitoneal injektion), eller enhver anden metode af eutanasi er godkendt af American Veterinary Medical Association eutanasi retningslinjerne. Bemærk: Perfusion gennem hjertet med Ringer-opløsning fulgt med en fikseringsopløsning anbefales for yderligere histologisk analyse. </li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. N. D., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Sigler, A., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+2-photon+imaging+of+fine+structure+in+the+rodent+brain:+before,+during,+and+after+stroke.">In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain: before, during, and after stroke.</a> Stroke. 41 (10), 117-123 (2010).</li><li>Shi, L., Zeng, M., Sun, Y., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+blood-brain+barrier+solute+permeability+and+brain+transport+by+multiphoton+microscopy.">Quantification of blood-brain barrier solute permeability and brain transport by multiphoton microscopy.</a> ASME J. of Biomech. Eng. 136 (3), 031005-031005 (2014).</li><li>Galambos, R., Schwartzkopff, J., Rupert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+study+of+superior+olivary+nuclei.">Microelectrode study of superior olivary nuclei.</a> Am. J. Physiol. 197, 527-536 (1959).</li><li>Goldberg, J., Brown, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+binaural+neurons+of+dog+superior+olivary+complex+to+dichotic+tonal+stimuli:+some+physiological+mechanisms+of+sound+localization.">Response of binaural neurons of dog superior olivary complex to dichotic tonal stimuli: some physiological mechanisms of sound localization.</a> J. Neurophysiol. 32 (4), 613-636 (1969).</li><li>Guinan, J. J., Guinan, S. S., Norris, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+auditory+units+in+the+superior+olivary+complex+I:+responses+to+sounds+and+classifications+based+on+physiological+properties.">Single auditory units in the superior olivary complex I: responses to sounds and classifications based on physiological properties.</a> Intern. J. Neurosci. 4, 101-120 (1972).</li><li>Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recordings+from+cat+trapezoid+body+and+HRP+labeling+of+globular+bushy+cell+axons.">Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons.</a> J. Neurophysiol. 63 (5), 1169-1190 (1990).</li><li>Khosrovani, S., Der Giessen, R. S. V. a. n., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mouse+inferior+olive+neurons+exhibit+heterogeneous+subthreshold+oscillations+and+spiking+patterns.">In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (40), 15911-15916 (2007).</li><li>Rodr&#237;guez-Contreras, A., Van Hoeve, J. S., Habets, R. L., Locher, H., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+development+of+the+calyx+of+Held+synapse.">Dynamic development of the calyx of Held synapse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (14), 5603-5608 (2008).</li><li>Lorteije, J. A., Rusu, S. I., Kushmerick, C., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+precision+of+the+mouse+calyx+of+Held+synapse.">Reliability and precision of the mouse calyx of Held synapse.</a> J. Neurosci. 29 (44), 13770-13784 (2009).</li><li>Tritsch, N. X., Rodr&#237;guez-Contreras, A., Crins, T. T., Wang, H. C., Borst, J. G. G., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+action+potentials+in+hair+cells+pattern+auditory+neuron+activity+before+hearing+onset.">Calcium action potentials in hair cells pattern auditory neuron activity before hearing onset.</a> Nat. Neurosci. 13 (9), 1050-1052 (2010).</li><li>Tong, H., Steinert, J. R., Robinson, S. W., Chernova, T., Read, D. J., Oliver, D. L., Forsythe, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Kv+channel+expression+and+neuronal+excitability+in+rat+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body+maintained+in+organotypic+culture.">Regulation of Kv channel expression and neuronal excitability in rat medial nucleus of the trapezoid body maintained in organotypic culture.</a> J. Physiol. 588 (9), 1451-1468 (2010).</li><li>Sonntag, M., Englitz, B., Kopp-Scheinpflug, C., R&#252;bsamen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+postnatal+development+of+spontaneous+and+acoustically+evoked+discharge+activity+of+principal+cells+of+the+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body:+an+in+vivo+study+in+mice).">Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body: an in vivo study in mice).</a> J. Neurosci. 29 (30), 9510-9520 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Villal&#243;n, A. L., Roda, J. M., Alvarez, F., G&#243;mez, B., Di&#233;guez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+blood+flow+in+anesthetized+rats:+effects+of+carotid+ligation+and+anastomosis.">Carotid blood flow in anesthetized rats: effects of carotid ligation and anastomosis.</a> Microsurgery. 13 (5), 258-261 (1992).</li><li>Yuan, W., Lv, Y., Zeng, M., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+the+measurement+of+solute+permeability+of+rat+pial+microvessels.">Non-invasive method for the measurement of solute permeability of rat pial microvessels.</a> Microvasc. Res. 77 (2), 166-173 (2009).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Ha&#252;sser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo.">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Tid er kritisk. En erfaren forsker bør være i stand til at fuldføre denne protokol i 1 time (trin 1-3). Begrundelsen for de forskellige trin tider antager en medium til høj grad af ekspertise. Korrekt og rettidig trakeostomi og intubation er kritiske, da dårlig ventilation kontrol kan føre til kvælning og død for dyret. Omhyggelig clearance af muskel-og fedtvæv er også meget vigtigt, fordi fejl kan føre til ukontrolleret blødning og død for dyret. Tilsvarende, når udarbejdelsen af ​​halspulsåren for kanyle indsættelse, er man nødt til at stramme og skære arterien omhyggeligt, hvis tråden knude bliver løs ukontrolleret blødning vil finde sted. Endelig bør kraniotomi gøres omhyggeligt, uden at forstyrre vartegn kar. Careless fjernelse af det ydre meningeal lag (dura), kan føre til alvorlige blødninger og skader på den arterielle forsyning. Ventilation indstillinger vælges efter dyrets alder.De fleste kommercielle leverandører give nyttige oplysninger om disse indstillinger. Forsøg med rotter er ældre end P15 vil kræve anvendelse af et stort dyr ventilator. Voksne dyr måske ikke brug for ventilation, hvis bedøvet med ketamin / xylazin, men anbefales intubation for at undgå væske ind i luftrøret. En af de største begrænsning af denne protokol er, at eksperimenter kan kun udføres akut. I vores laboratorium har vi foretaget eksperimenter varighed på mellem to og op til ti timer. En anden begrænsning er, at forsøgene skal udføres under bedøvelse. Derfor er valget af bedøvelsesmiddel er en vigtig variabel at overveje i planlægning og design af eksperimenter. Et beslægtet problem er, at nyfødte dyr kan være særligt følsomme over for overdosering. For eksempel, hvis du vælger ketamin / xylazin mix, beregne dosis baseret på pup vægt og administrere lægemidler på ⅓ af den maksimale lydstyrke. Kontroller tilstanden af ​​dyret hver 5-10 minutter ved tå knivspids response. Hvis du bruger isofluran, er der også behov forholdsregler for at opretholde et sikkert miljø for investigator (ordentlig ventilation, og en korrekt kalibreret fordamper). Stereomikroskop kan monteres på en fleksibel holder til at justere betragtningsvinkel og lette plads clearance at placere elektroderne og flytning af dyret for to-foton mikroskop. Anvendelse af et batteri til magten ventilatoren kan lette at flytte dyr og reducere elektriske artefakter under elektrofysiologiske eksperimenter. Til dette formål kan en lille breadboard (7,5 x 12 inches) anvendes til at samle sammen ventilatoren varmepuden og bedøvede dyr (figur 2a). En nyttig og vigtig modifikation denne opsætning er tilføjelsen af ​​en indretning til overvågning af vitale tegn i løbet af operationen. En oxymeter eller andre analoge enheder kan bruges, afhængigt af laboratoriets budget. Denne protokol er blevet anvendt med elektrofysiologi og billedbehandling opfyldttoder, herunder patch clamp optagelser 8,10,11, polytrode optagelser (fig. 7), og to-foton billeddannelse 9 (figur 6 og 8). En mulig fremtidig anvendelse vil være at kombinere disse metoder til målretning fluorescens-mærkede celler til elektrofysiologiske optagelse 16. Nye programmer til billedbehandling kan også omfatte 2-D eller serie 3-D tid ved hjælp af to-foton mikroskopi. For eksempel ved hjælp af bolus lastning af calcium indikatorer til at studere aktiviteten af ​​hjernestammen neuronal og glial cellepopulationer. Som vist i figur 8, et farvestof opløsning injiceres i blodcirkulationen gennem halspulsåren kan bruges til at generere billeder med høj kontrast af hjernen vaskulaturen. Som fluorescens farvestof fylder mikrokar lumen og spredes i det omgivende væv, kan det ikke kun anvendes til at beregne den tilsyneladende opløste permeabiliteten af ​​blodhjernebarrieren, men også det opløste diffusion coefkelige i hjernevævet 3. En af hovedårsagerne til at injicere fluorescensmærkede opløste via halspulsåren at farveopløsningen direkte kan gå til mikrokar i hjernen uden at gå til hjertet først som en injektion i halevenen. Dette bringer mindst to fordele. Den ene er, at koncentrationen fluorescens farvestof i mikrokardannelse lumen kan være praktisk talt konstant hvis perfusionshastigheden fastsættes på kanyleringssted. Dette sikrer en nøjagtig bestemmelse af blod-hjerne-barriere-permeabilitet. En anden er, at hvis en prøve middel er inkluderet i perfusatet, vil det gå direkte til blod-hjerne-barrieren uden at blive fortyndet eller kombineret med andre faktorer fra kroppen cirkulation. Nye eksperimenter kan også drage fordel af transgene dyr med genetisk kodet fluorescerende journalister. Dette ville give den fordel, at fluorescerende prober ikke behøver at blive indlæst i situ (medmindre udformningen af forsøgetanfører andet), hvilket sparer tid og eventuelt giver mulighed for mere intakte præparater (f.eks kraniel vindue 17). Endelig kan forsøgene gøres i andre hjernestammen regioner, såsom ringere oliven eller ansigtets motoriske kerne. Viden om neuroanatomi og udvikling af specifikke cellulære populationer i en given art vil være vigtigt i denne retning, især da anatomiske kendetegn kan ændre sig som dyr vokse (Figur 1). Vi håber, at denne protokol opfordrer andre til at studere ventrale hjernestammen strukturer ved hjælp af in vivo elektrofysiologiske og billeddannende metoder.

Anvendelsen af en kraniotomi i kombination med fluorescensimagografi og elektrofysiologiske teknikker tillader overvågning blodgennemstrømning, blod-hjerne-barriere-permeabilitet og måling af aktiviteten af neuroner og gliaceller i levende dyr 1-3. Adskillige laboratorier har brugt denne metode til at give indsigt i hjernens fysiologi i sunde og sygdomstilstande, men der er stadig huller i vores forståelse af, hvordan disse processer opstå under udvikling. Endvidere har de fleste undersøgelser fokuseret på de områder af hjernen, som er let tilgængelige fra ryg overfladen af kraniet, således at ventrale hjernestammen strukturer med forskellige fysiologiske roller er blevet studeret de fleste bruger ex vivo metoder. Det vigtigste mål med denne protokol er at give en metode til at åbne en kraniotomi på den ventrale kraniet af gnavere. Denne fremgangsmåde blev tilpasset fra klassiske studier udført i større pattedyr, såsom hunde og katte til sensoriske neurofysiologi Recordings af det auditive hjernestamme 4-7. I denne protokol er der dog romanen udfordring at udføre proceduren i nyfødte dyr. Brug landmærker vaskulatur, har det tilpasset protokol tidligere været anvendt til at studere den auditive hjernestammen af nyfødte rotter, voksne mus og andre hjernestammen regioner som ringere oliven 8-11 (figur 1). En væsentlig fordel ved en ventral kraniotomi i forhold til eksisterende metoder til at studere ventrale hjernestammen kerner er, at det giver direkte adgang til de strukturer af interesse i levende dyr. For eksempel er de auditive celler af den overlegne olivary kompleks lokaliseret nogle få snese mikrometer fra hjernens overflade, som er vigtig for målrettet placering af prober og til anvendelse af to-foton-billedteknik hvor billeddannelse dybde kan begrænses til 0,5 mm ved lys væv spredning og absorption. En ventrale kraniotomi giver også et præparat med relativt intakte neurale forbindelser, WHICH er forstyrret i akutte og organotypiske skive præparater 12. I modsætning til andre protokoller til in vivo neurofysiologi eksperimenter 13, kan en ventral tilgangen kombineres med multi-elektrode optagelse og billeddiagnostiske metoder, der giver oplysninger om cellulære ensembler (figur 6 og 7). Endelig, i kombination med denne protokol en fluorescens-mærket opløst stof kan injiceres i karrene at måle ændringer i blod-hjerne-barriere-permeabilitet til det opløste stof (figur 8).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Absorbant pads</td>
			<td style="width:71px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:119px;">Sugi 31603</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:216px;">Cautery</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">GEM&#160;5917</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1287-500MG</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dissecting Chisel</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">10095-12</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DiI</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">V-22885</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Elastomer</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">KWIK-SIL</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fine Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14060-09</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11027-12,11617-12, 11616-16</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Spring Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15009-08</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Heating pad</td>
			<td style="width:71px;">FHC</td>
			<td style="width:119px;">40-90-2</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Intubation tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">BIO CO-KIT</td>
			<td style="width:167px;">Choose age appropriate size</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Light source</td>
			<td style="width:71px;">Spach Optics</td>
			<td style="width:119px;">Schott Ace illuminator&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Micro drill</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">MD-1200&#160;120V</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Paper tape</td>
			<td style="width:71px;">Walgreens</td>
			<td style="width:119px;">Generic brand</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:216px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">28145-483</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">52459-008</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">SZ61</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture</td>
			<td style="width:71px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">Prolene 86979</td>
			<td style="width:167px;">6-0 size</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120</td>
			<td style="width:167px;">Other options depending on pup&#8217;s age</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vaporizer (isoflurane)</td>
			<td style="width:71px;">Vetequip Incorporated</td>
			<td align="right" style="width:119px;">911103</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ventilator (minivent)</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">730043</td>
			<td style="width:167px;">Use for P0-P12 rats</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to make a craniotomy on the ventral skull of neonate rodents

Anvendelsen af en kraniotomi til in vivo eksperimenter giver en mulighed for at undersøge dynamikken i forskellige cellulære processer i pattedyrs hjerne i voksenalderen og under udvikling. Selv om de fleste in vivo metoder bruger en craniotomy til at studere hjernen regioner, der ligger på den dorsale side, hjernestammen regioner såsom pons, der ligger på den ventrale side forbliver relativt understudied. Det vigtigste mål med denne protokol er at lette adgangen til ventrale hjernestammen strukturer, så de kan studeres in vivo ved hjælp af elektrofysiologiske og billeddannende metoder. Denne fremgangsmåde giver mulighed for undersøgelse af strukturelle ændringer i langtrækkende axoner, mønstre af elektrisk aktivitet i single og ensembler af celler, og ændringer i blod-hjerne barrieren permeabilitet i nyfødte dyr. Selv om denne protokol er blevet anvendt for det meste til at studere den auditive hjernestammen hos nyfødte rotter, kan det nemt tilpasses til studier i andre gnaver arter såsom nyfødte mus, voksen Rodents og andre hjernestammen regioner.

Elektroporation af neurale sporstoffer Den mediale kerne trapez legeme (MNTB) er en gruppe af celler i den overlegne olivary kompleks, der er blevet undersøgt tidligere ved hjælp af denne protokol. For eksempel kan patch-clamp pipetter anvendes til at elektroporere neurale sporstoffer (figur 6) 9. Når pipetter er placeret i nærheden af midterlinjen som vist i figur 6a, er resultatet, at decussating afferente axoner er mærket. En to-foton mikroskop udstyret med en høj numerisk apertur vand immersionsobjektivet kan anvendes til afbildning af fibrene når frem til MNTB, herunder meget fine sidelinier (pile i figur 6b). Neurale sporstoffer kan også blive leveret til MNTB direkte, som vist i figur 6c. Resultatet er mærkning af MNTB celler og afferente axoner, som kan forstås af billeddannelse med en lavere numeriske åbning vand immersionsobjektivet (figur 6d). Den main fordel ved at bruge den lavere forstørrelse målet er, at kan undersøges et bredere synsfelt, og selv om dette resulterer i et fald i rumlig opløsning på grund af den lavere objektive numeriske åbning kan individuelle MNTB celler anes godt (pile i figur 6d) . Den gennemsnitlige varighed af disse eksperimenter for aldre P1-P5 er 3,1 ± 1,4 time (n = 22 hvalpe). Elektrofysiologi optagelser Spontan burst fyring er en form for udviklingsmæssig elektriske aktivitet observeret i enkelte MNTB celler før starten af at høre 11,13. Ved hjælp af denne kirurgiske protokol er det også muligt at målrette multielectrode arrays (polytrodes) til MNTB (7a-b). Resultatet er en optagelse af spontan aktivitet i et ensemble af MNTB celler. Figur 7e viser et repræsentativt polytrode optagelse fra en P6 rotte. I dette eksperiment blev polytrode belagt med de lipofile farvestof Dil hjælpen tynd pensel (se trin 4.1). Efter udførelse af optagelsen hjernen blev forarbejdet til histologisk analyse og placeringen af Dil-mærkede polytrode spor blev anvendt til at bekræfte korrekt målretning mod MNTB (figur 7d). Den gennemsnitlige varighed af eksperimenter for aldre P1-P6 er 2,0 ± 0,7 time (n = 33 hvalpe). Måling mikrokardannelse permeabilitet Denne protokol kan også anvendes til at udføre to-foton billeddannelse eksperimenter vaskulær permeabilitet. En fluorescerende opløste (TRITC-dextran, MW 155 kD, Stokes radius ~ 8,5 nm) blev opløst i 1% BSA Ringer-opløsning og injiceres i den cerebrale cirkulation via en kanyle indsat i halspulsåren 14. I modsætning haleveneinjektioner denne procedure omgår hjertet og indfører fluorescerende opløste stof direkte i mikrocirkulationen i hjernen. 8a illustrerer kvaliteten af ​​mærkning af blod vasculature at resultaterne fra at bruge denne procedure. Efter kontinuerligperfusion af mærkede opløste stoffer i blodet, er det muligt at opnå en tidsforskudt sekvens af et område af interesse, som vist i figur 8b. Den totale fluorescens intensitet i området af interesse blev målt offline og en matematisk model, der anvendes til at bestemme blod-hjerne-barriere-permeabilitet til fluorescensmærket opløste stoffer (figur 8c) 15. Den gennemsnitlige varighed af eksperimenter for aldre P9-P10 er 2,3 ± 0,8 time (n = 3 hvalpe). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. Relative placering af ventrale hjernestamme neurale strukturer med hensyn til seværdigheder vaskulatur hos neonatale rotter. En, fra siden af hjernen. B ventrale visning af hjernen. Større blodkar er vist i røde og neurale strukturer af interesse er INDlemstore af farve firkanter. Ikke målfast. AICA = forreste ringere cerebellare arterie; bas = basilararterien; ICV = ringere cerebral vene; MCA = midtcerebralarterie; vert = vertebral arterie; VSP = ventral spinal arterie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2. Kirurgisk setup. En, kan kirurgi udføres på et lille brød bord (1) hviler på toppen af en stabil bordplade. En varmepude (2) og et lille dyr ventilator (3) kan fastgøres til brød bord for at lette flytte hele præparat, når det er nødvendigt. Den lille dyr ventilator kan drives af et batteri (4). En magnetisk holder (5) kan anvendes til at fastgøre næsekeglen anvendt til at levere bedøvelsesmiddel. Næsekeglen kanogså medvirke til at sikre hovedet i en stabil position. Hvis dyret ikke behøver at blive flyttet, en mikromanipulator (6) kan anvendes til at placere prober til elektrofysiologi eller neurale sporingsforanstaltninger eksperimenter. En lyskilde (7) og en stereoskop (ikke afbilledet) er nødvendige for at visualisere skelsættende konstruktioner under mikrokirurgi. B er en lille saks der anvendes i trin 1.4. C, er Tang anvendes i trin 1.4, 1.6.1, 1.8 og 1.8.1 . d, der forår saks anvendes i trin 1.5, 1.6 og 1.7. e er dissekere mejsel anvendes i trin 3.1.2. Målestokken i e = 1 mm, gælder bd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3.. Udsættes luftrøret for intubation.a, Dyret bedøves, placeret i bugleje og fastgøres med næsen kegle og tape (stiplede linjer). B, Huden skæres og placeres til side for at eksponere den underliggende fedtlag. c, The overliggende fedt og kirtler (vist i gråt) er skubbet til side for at blotlægge trachea. Tape bruges til at sikre den overliggende hud (stiplede linjer). D, er luftrøret dissekeres fra muskulatur. E, Visualisering af trakeal ringe indikerer vellykket fjernelse af overliggende muskler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4.. Intubating dyret. En, to suturtråde (hvide pile) er bundet omkring trachea(T). B, skal den intubationsrøret (det) være tæt forbundet til y rør af dyret ventilator. C, er en trakeostomi mellem de to suturtråde (sort pil). D, ventilation tube er indsat, og to suturtråde er spændt. Enderne af trådene strammes igen i en krydset måde (angivet med hvide og sorte pilespidser). E bliver suturen endelser bundet. F, bliver suturen endelser trimmes og intubation er færdig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig4highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5.. Fjernelse af luftrøret og gøre kraniotomi. En, er forberedelsen stabiliseret med elastomer (område insi<html> de grønne stiplede linier). B, Luftrøret identificeret og derefter nedskæringer er lavet først at adskille luftrøret væk fra intubationsrøret og derefter at skære underkæbens muskler (stiplede linier). c, Rengør overfladen af kraniet ved stump teknik til at fjerne muskler og bruge absorberende papir for at fjerne fedt og blod. d, Eksempel på et rent område viser det sidste ryghvirvler (v) og basi-occipital bone (bo). Der er en naturlig kløft mellem de to knogler (sorte pile). E, Brug en mikroborehuller eller ultralyd sæbe tynde kraniet i en omvendt U-form (sorte pile). Forsigtigt bryde den fortyndede kraniet og fjern det lille stykke knogle. Landmark vasculature skal være synlig. F, høj forstørrelse billede af vaskulære vartegn på den udsatte hjernestammen overfladen. Bas = basilararterien; AICA = anterior ringere cerebellar arterie. Målestokken i b = 1 mm, gælder CE.highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik her for at se større billede. <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig6highres.jpg" width="500" /> Figur 6.. Elektroporation af neurale sporstoffer. A, Et glas elektrode indeholder den neurale sporstof mikro-rubin blev placeret i nærheden af midterlinjen (rød cirkel). Sporstof blev elektroporeret under anvendelse af syv sekunder lang -5 uA impulser afgivet hver 14 sekunder 15 minutter. Efter 1 times restitutionstid den indrammede område blev afbildet med en to-foton mikroskop. P1 rotteafkommets. B Exemplar z-stak billede af afferente axon mærkning i MNTB. Pile peger på individuelle sikkerhedsstillelse filialer. C. blev Et glas elektrode fyldt med mikro-rubin placeret på toppen af MNTB (rød cirkel). Sporstof blev elektroporeret med de samme indstillinger, der er beskrevet i et. Efter 1 times nyttiggørelse tid var det indrammede områdeafbildet med en to-foton mikroskop. P5 rotte hvalp. D, Exemplar z-stak billede af mærkede celler og axoner i MNTB. Pile angiver single MNTB celler. Etiketter i b og c angiver objektiv forstørrelse og numerisk blænde, hhv. Skala bar i en og c = 300 m; Målestokken i b = 45 m; Målestokken i d = 90 um. AICA = forreste ringere cerebellare arterie; bas = basilararterien; r = rostralt; l = lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig6highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a> <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7.. Målrettet polytrode optagelse. A, Polytrode består af 4 skafter med 4 elektroder pr skaft (sorte cirkler). Intra-og inter-skaft afstande mellem elektroderne er angivet. B, </strong&gt; Exemplar billede af elektrofysiologi eksperiment. En reference elektrode er indsat i bucal hulrum og en ploytrode er tilsluttet hovedtrin. P6 rotteafkommets. C, Højere forstørrelse udsigt over vartegn vasculature bruges til at målrette polytrode. Den polytrode er placeret ved hjælp rostral-laterale koordinater til at målrette den mediale kerne af trapez krop (rød boks). D, Posthoc histologisk analyse viser korrekt målretning af Dil-belagt polytrode (polytrode spor er vist i rødt). E, Exemplar multi -enhed optagelse. Trace ordre er den samme som elektrode orden i panelet en. Inden skaft optagelser har samme farve. Målestokken i e = 5 sekunder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig7highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a> <img alt="Figur 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig8highres.jpg"width = &quot;600&quot; /&gt; Fig. 8. In vivo-to-foton-billeddannelse af hjernen mikrokar. en, 2-D billede (sammenfaldet Z-stack) af hjernen vaskulaturen efter perfusion af TRITC-dextran-155 kD i halspulsåren. Området afbildes ligner den, der er vist i figur 7c. 20x/0.5 nedsænkning i vand mål. P10 rotteafkommets. B, Region af interesse (ROI), der anvendes til at måle fluorescens intensitet (rød ramme lukket område). Den mikrokar havde en diameter på ~ 14,2 um og blev placeret 182 um under hjernestammen overfladen. C Typisk kurve fluorescensintensitet (normaliseret værdi) som en funktion af tiden. I 0 er det skridt stigning i fluorescens intensitet i ROI, når fluorescens løsning blot fylder op karhulrummet. (DI / dt) 0 og I 0 anvendes til at bestemme mikrokar permeabilitet for det opløste stof. Permeabiliteten for TRITC-dextran-155 kD blev beregnet til at være 1,5 x 10 -7 cm / sek.Målestokken i b = 100 um, gælder for en. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig8highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents at JoVE.com

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

Et kirurgisk fremgangsmåde er beskrevet for at eksponere den ventrale kraniet hos nyfødte rotter. Med denne fremgangsmåde er det muligt at åbne en kraniotomi at udføre akut elektrofysiologi og to-foton mikroskopi eksperimenter i hjernestammen af ​​bedøvede hvalpe.

En metode til at tjene en kraniotomi på den ventrale Skull for neonatal Gnavere

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

a-method-to-make-a-craniotomy-on-the-ventral-skull-of-neonate-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

En fuldt automatiseret og meget alsidige system for afprøvning Multi-kognitive funktioner og registrering af Neurale Aktiviteter i Gnavere

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

I ovo Angivelse af MicroRNA i Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Laser Capture mikrodissektion - en demonstration af Isolering af Individual dopaminneuroner og hele Ventral tegmentalområde

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Live-Imaging af Nikotin induceret Calcium Signaling og neurotransmitterfrigivelse Langs ventrale Hippocampale Axoner

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

Kraften i Interstimulus Interval for vurdering af tidsmæssige forarbejdes i Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

In vivo billeddannelse af cerebrospinalvæske transport gennem intakt mus kraniet ved hjælp af fluorescens makroskopi

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement learning. Understanding how the diverse neuronal inputs into the VTA control phasic DA release can provide a better picture of the circuitry that controls reward processing and reinforcement learning. Here, we describe a method that combines intra-VTA cannula infusions of pharmacological agonists and antagonists with stimulation-evoked phasic DA release (combined infusion and stimulation, or CIS) as measured by in vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV). Using CIS-FSCV in anesthetized rats, a phasic DA response can be evoked by electrically stimulating the VTA with a bipolar electrode fitted with a cannula while recording in the nucleus accumbens core. Pharmacological agonists or antagonists can be infused directly at the stimulation site to investigate specific VTA receptors&#39; roles in driving phasic DA release. A major benefit of CIS-FSCV is that VTA receptor function can be studied in vivo, building on in vitro studies.

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry CIS-FSCV to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

The goal of this protocol is to directly manipulate ventral tegmental area receptors to study their contribution to subsecond dopamine release.

Kombineret infusion og stimulering med hurtigscanning cyklisk voltammetri (CIS-FSCV) til vurdering af ventral tegmental område receptor regulering af Phasic dopamin

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement ...