Name: a method to make a craniotomy on the ventral skull of neonate rodents
Uploaded: 2014-05-22T14:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом G12-RR003060 от NIH / NCRR / RCMI, грант SC1HD068129 от Юнис Шрайвер Национального института здравоохранения и человеческого развития ребенка, Национальный научный фонд CBet 0754158 и PSC-CUNY 62337-00 40 из Городского университета Нью- Йорк.

Следующий протокол следует руководству по уходу за животными, установленные на уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC) в Городском колледже Нью-Йорке. 1. Животных интубации (10-20 мин) <ol><li> До операции, подготовить млекопитающих раствор Рингера. Соберите хирургические инструменты, грелку и небольшая животноводческая вентилятор на скамейке (рис. 2). <ol><li> Для измерения через гематоэнцефалический барьер, сделать 10 мл 1% бычьего сывороточного альбумина раствор (BSA) в Ringer и растворить TRITC-декстран 155 кД в 8 мг / мл в 1%-ном растворе БСА, фильтр раствора с 25 мм шприцевой фильтр (0,2 мкм размер пор) и хранить в шприце фольги, покрытой в темноте. </li></ol></li><li> Обезболить животное с помощью ИФ. Используйте 5,0% для индукции и 1.5-3.0% для технического обслуживания. Альтернативно смесь кетамина (41,7 мг / кг) и ксилазина (2,5 мг / кг массы тела) могут быть использованы. Глубина анестезии можно проверить ног пинч рефлексаверхних и нижних конечностей. <ol><li> Последующие дозы кетамина (41,7 мг / кг массы тела) и ксилазина (2,3 мг / кг массы тела) следует вводить с шагом ⅓ от максимальной дозы, чтобы избежать передозировки. Использование грызунов вентилятора рекомендуется, чтобы противодействовать ксилазина индуцированных дыхания. </li></ol></li><li> Поместите наркозом щенка, лежа на его спинной стороне и закрепите его голову с пластиковой конуса используется для доставки анестетика (рис. 3а). <ol><li> Закрепите животное с помощью клейкой ленты на передних конечностях и хвосте (рис. 3а). </li><li> Альтернативой обеспечить голову щенка является использование головы табличку, прикрепленную к металлическим прутом. Примечание: Убедитесь, что грелку установлен на 37 ° С, чтобы избежать переохлаждения (рис. 3а). </li></ol></li><li> Используйте ножницы (рис. 2, б), чтобы сделать один продольный и четыре боковые разрезы на коже, покрывающий шею (Рис. 3б). Использование тупой технику, рассекают кожу и поместить его в сторону с помощью щипцов (рис. 2в и 3в). <ol><li> Держите кожу вниз с помощью клейкой ленты. Стабилизация головку в горизонтальном положении (фиг. 3c). </li></ol></li><li> Использование пружинных ножниц (рис. 2d) и тупой технику, нажмите желез и жировых слоев в сторону, чтобы выставить в трахею (рис. 3в). Определить местоположение сонных артерий. <ol><li> Держите сонные артерии от трахеи. Примечание: прокалывание сонных артерий может привести к массивной кровопотери и смерти щенка. </li></ol></li><li> Использование пружинных ножниц (рис. 2, г) рассекают продольные мышцы, покрывающие трахеи. Вырезать продольные мышцы, расположенные под трахеи (рис. 3d). Примечание: кольца трахеи должны быть четко видны (рис. 3e). <ol><li> Использованиещипцы (рис. 2в), связать две части шва вокруг трахеи. Одна часть шва обеспечит вентиляционную трубу и второй поток будет использоваться, чтобы закрыть трахеи Ростральные к точке ввода вентиляции трубы (рис. 4а). Примечание: Смочите подвергаются ткани регулярно раствором Рингера, чтобы предотвратить обезвоживание. </li></ol></li><li> Использование пружинных ножниц (рис. 2, г) сделать надрез на одном из трахеи колец, расположенных между двумя потоками, размещенных в шаге 1.6.1 (рис. 4в). Примечание: Убедитесь, что жидкость не попадает в открытую трахею. Жидкость в трахее вызовет удушье. </li><li> Вставьте интубации трубки (рис. 4б) в трахею и затяните нижнюю нить, чтобы закрепить его. Использование щипцов (рис. 2в), натяжение верхней нити, чтобы закрыть трахеи кзади от точки вставки интубации трубки. <ol><li> Tighteп и обрезать концы двух нитей (рис. 4d-е). Примечание: пара внутри интубации трубки является хорошим признаком управления воздушным потоком. </li></ol></li><li> Оперативно переключить подачу ИФ к вентилятору. Регулировка ударного объема и расхода воздуха в зависимости от веса животного. <ol><li> Закройте открытую окружающие ткани с эластомера (рис. 5а). Держите поверхность смоченной и чистый. </li></ol></li></ol> 2. Трахеи и мышц Переезд в Expose черепа (5-10 мин) <ol><li> Используйте пружинные ножницы (рис. 2d) сократить трахею, прилегающей к вентиляционной трубе. Выполнение два разреза вдоль мышечной стенке ротовой полости, чтобы обнажить хвостовой конец вкус (фиг. 5b). Примечание: При необходимости, использовать cauterizer, чтобы остановить кровотечение. Неконтролируемое кровотечение может привести к смерти животного. </li><li> Очиститеплощадь используя обильное количество раствора Рингера (Рисунок 5в). Определите разрыв между последней позвонков и Basi-затылочной кости (рис. 5d). Примечание: Разрыв между костями является полезным череп вехой для поиска стволовых структур. Уступает оливковое находится под этот пробел. Слуховой превосходит овальный комплекс расположен под Basi-затылочные кости в ростральной направлении от этого разрыва (см. также рисунок 1). </li><li> Очистите область с помощью щипцов (рис. 2в) и весенние ножницы (рис. 2, г). Не прокола кровеносные сосуды. Примечание: При необходимости, прижигать, чтобы остановить кровотечение. <ol><li> После того, как подвергается поверхность чистая жира и мышечной ткани, пространство отделения Basi-затылочную кость и последний позвонок должен быть виден (рис. 5d). </li></ol></li></ol> 3. Краниотомия (15-30 мин) <ol><li> Используйте microdrill или ультразвуковая моющее. Найдите медиальной стенки буллы. <ol><li> Тонкий череп, сделав перевернутый D форму, пока основные артерии не могут видеть (рис. 5e). Примечание: основной артерии (бас) работает на верхней части ствола мозга средней линии. Передней нижней мозжечковой артерии (AICA) отделения двусторонней и может быть надежно использованы в качестве ориентира, поскольку оно имеет постоянное положение в различных животных. </li><li> Когда череп тоньше, мягко разорвать его помощью рассекает долото (рис. 2е). Снимите кости кусок щипцами (рис. 2в). С другой стороны, поднимать и сломать череп, используя изогнутую иглу. Примечание: Повторите эту процедуру до тех пор, размер и форма краниотомии не подходит для запланированного эксперимента. Барельеф и AICA должны быть видны через твердую мембрану (рис. 5е). </li></ol></li><li> Очистите область несколько раз со свежим раствором Рингера. Использование абсорбирующего годовыхDS высушить поверхность твердой мозговой оболочки. <ol><li> Если необходимо, используйте шовный иглу для удаления твердую мозговую оболочку не сворачивая или нарушение ориентир артерии бас и AICA. Примечание: При длительность прокалывания спинномозговую жидкость вытечет. Очистите область с раствором Рингера и держать увлажненной в течение всего эксперимента. </li></ol></li></ol> 4. Электрофизиологии Эксперимент <ol><li> Выберите polytrode в соответствии с дизайном эксперимента (рис. 7а). Используйте тонкую кисть, чтобы покрыть polytrode с DiI. Перенесите раствор Dii в 1 мл трубки микроцентрифужных, опустите кисть в растворе и аккуратно нанести polytrode под визуальным руководством (то есть с использованием стереоскоп). Запуск на кончике зонда и тщательно продолжают до тех пор, пока все электроды покрыты равномерно. <ol><li> Поместите заземляющий электрод внутри полости рта. Загрузите polytrode в держатель электрода (рис. 7б </stronг&gt;). </li><li> Включите усилитель и проверьте, что все соединения хорошо работать. </li></ol></li><li> Расположите выше барельеф электрод на точки ветвления AICA (положение нуля). Перемещение электрода на нужную целевую точку с помощью соответствующего ростральной-поперечной координаты (рис. 7с). <ol><li> Поместите электрод на поверхности мозга и переместить его на нужную глубину с шагом 5-10 мкм. </li></ol></li><li> Выполните запись в соответствии с экспериментальной конструкции. Сохранить данные для дальнейшего анализа. </li></ol> 5. Двухфотонное изображений Эксперимент <ol><li> Включите микроскопом. Установите длины волны возбуждения и использовать соответствующий фильтр выбросов. Возбуждение при 800 нм и 607 ± 45 нм полосовой фильтр выбросов хорошо работать для визуализации TRITC-декстран. </li><li> Определите правую или левую сонную артерию. Использование тупой метод препарировать сонной артерии от соседних соединительных тканей или нервов. <ol><li> Выберите и удерживайте соннойартерии с кровоостанавливающего. Свяжите три части шва вокруг сонной артерии. </li><li> Затянуть нить ближе к сердечной стороне, чтобы остановить поток крови и оставить две другие темы, свободно. </li><li> Используйте тонких ножниц сделать небольшой надрез под углом 45 ° на сонной артерии между привязанной резьбой и следующей нитку. Примечание: Очистите кровь с фильтровальной бумаги. </li></ol></li><li> Иглу сонную артерию. Вставьте трубку, заполненную с TRITC-Декстрана в разрез на сонной артерии около 5 мм в глубину, ориентированной на голову щенка. <ol><li> Затянуть две другие темы, вокруг артерии провести трубку и артерию вместе. Затянуть темы, отделка и добавить эластомера для дальнейшей стабилизации. Примечание: На другой стороне трубки соединен с шприц, содержащий TRITC-декстрана раствор (полученного на стадии 1.1). </li></ol></li><li> Закрепите шприц на шприцевой насос. <ol><li> Наборскорость при скорости потока крови сонной артерии на щенка. Включите шприцевой насос на несколько секунд и проверить вручную, что раствор красителя может быть введен в сонной артерии. Примечание: Если предположить, что скорость кровотока в сонной артерии взрослых крыс (240-280 г) составляет около 3 мл / мин 14, скорость потока крови на крысиной щенка (например, P10 щенок весом 15-25 г) может быть рассчитана с Диапазон от 0.16-0.3 мл / мин. </li></ol></li><li> Место животное под объектив микроскопа. Введите флуоресцентный декстран в кровоток. <ol><li> Определить области, представляющие интерес на брюшной мозга с воздуха цели 5X. Переключение на 20-кратным или 40-кратном цели (погружение в воду, NA = 0,5 или 0,8 соответственно), чтобы сосредоточиться область интереса (ROI). </li><li> Начните изображений и настраивайте параметры получения изображений (время например, воздействие, мощность лазера, увеличение детектор) до интенсивности флуоресценции в сосудистой системе ROI оптимизирован (т.е.не слишком низкое, но не насыщенный). </li><li> Включите шприцевого насоса для введения раствора красителя в сонную артерию и получить временной ряд при фиксированной фокальной плоскости. </li></ol></li></ol> 6. Уход животных следующую процедуру <ol><li> Это процедура терминал. В конце эксперимента животных должны быть умерщвлены с повышенной дозы фенобарбитала (100 мг / кг, внутрибрюшинно инъекции) или любой другой метод эвтаназии, утвержденной Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации эвтаназии принципов. Примечание: перфузии через сердце с раствором Рингера следуют с фиксирующим раствором рекомендуется для дальнейшего гистологического анализа. </li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. N. D., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Sigler, A., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+2-photon+imaging+of+fine+structure+in+the+rodent+brain:+before,+during,+and+after+stroke.">In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain: before, during, and after stroke.</a> Stroke. 41 (10), 117-123 (2010).</li><li>Shi, L., Zeng, M., Sun, Y., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+blood-brain+barrier+solute+permeability+and+brain+transport+by+multiphoton+microscopy.">Quantification of blood-brain barrier solute permeability and brain transport by multiphoton microscopy.</a> ASME J. of Biomech. Eng. 136 (3), 031005-031005 (2014).</li><li>Galambos, R., Schwartzkopff, J., Rupert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+study+of+superior+olivary+nuclei.">Microelectrode study of superior olivary nuclei.</a> Am. J. Physiol. 197, 527-536 (1959).</li><li>Goldberg, J., Brown, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+binaural+neurons+of+dog+superior+olivary+complex+to+dichotic+tonal+stimuli:+some+physiological+mechanisms+of+sound+localization.">Response of binaural neurons of dog superior olivary complex to dichotic tonal stimuli: some physiological mechanisms of sound localization.</a> J. Neurophysiol. 32 (4), 613-636 (1969).</li><li>Guinan, J. J., Guinan, S. S., Norris, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+auditory+units+in+the+superior+olivary+complex+I:+responses+to+sounds+and+classifications+based+on+physiological+properties.">Single auditory units in the superior olivary complex I: responses to sounds and classifications based on physiological properties.</a> Intern. J. Neurosci. 4, 101-120 (1972).</li><li>Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recordings+from+cat+trapezoid+body+and+HRP+labeling+of+globular+bushy+cell+axons.">Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons.</a> J. Neurophysiol. 63 (5), 1169-1190 (1990).</li><li>Khosrovani, S., Der Giessen, R. S. V. a. n., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mouse+inferior+olive+neurons+exhibit+heterogeneous+subthreshold+oscillations+and+spiking+patterns.">In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (40), 15911-15916 (2007).</li><li>Rodr&#237;guez-Contreras, A., Van Hoeve, J. S., Habets, R. L., Locher, H., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+development+of+the+calyx+of+Held+synapse.">Dynamic development of the calyx of Held synapse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (14), 5603-5608 (2008).</li><li>Lorteije, J. A., Rusu, S. I., Kushmerick, C., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+precision+of+the+mouse+calyx+of+Held+synapse.">Reliability and precision of the mouse calyx of Held synapse.</a> J. Neurosci. 29 (44), 13770-13784 (2009).</li><li>Tritsch, N. X., Rodr&#237;guez-Contreras, A., Crins, T. T., Wang, H. C., Borst, J. G. G., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+action+potentials+in+hair+cells+pattern+auditory+neuron+activity+before+hearing+onset.">Calcium action potentials in hair cells pattern auditory neuron activity before hearing onset.</a> Nat. Neurosci. 13 (9), 1050-1052 (2010).</li><li>Tong, H., Steinert, J. R., Robinson, S. W., Chernova, T., Read, D. J., Oliver, D. L., Forsythe, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Kv+channel+expression+and+neuronal+excitability+in+rat+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body+maintained+in+organotypic+culture.">Regulation of Kv channel expression and neuronal excitability in rat medial nucleus of the trapezoid body maintained in organotypic culture.</a> J. Physiol. 588 (9), 1451-1468 (2010).</li><li>Sonntag, M., Englitz, B., Kopp-Scheinpflug, C., R&#252;bsamen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+postnatal+development+of+spontaneous+and+acoustically+evoked+discharge+activity+of+principal+cells+of+the+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body:+an+in+vivo+study+in+mice).">Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body: an in vivo study in mice).</a> J. Neurosci. 29 (30), 9510-9520 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Villal&#243;n, A. L., Roda, J. M., Alvarez, F., G&#243;mez, B., Di&#233;guez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+blood+flow+in+anesthetized+rats:+effects+of+carotid+ligation+and+anastomosis.">Carotid blood flow in anesthetized rats: effects of carotid ligation and anastomosis.</a> Microsurgery. 13 (5), 258-261 (1992).</li><li>Yuan, W., Lv, Y., Zeng, M., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+the+measurement+of+solute+permeability+of+rat+pial+microvessels.">Non-invasive method for the measurement of solute permeability of rat pial microvessels.</a> Microvasc. Res. 77 (2), 166-173 (2009).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Ha&#252;sser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo.">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Время имеет решающее значение. Опытный исследователь должен иметь возможность завершить этот протокол в течение 1 часа (шаги 1-3). Времена, установленные для различных этапов предположить среду высокого уровня знаний. Правильное и своевременное трахеотомия и интубация имеют решающее значение, так как слабый контроль вентиляции может привести к удушению и гибели животного. Тщательное оформление мышечной и жировой тканей также очень важно, поскольку ошибки могут привести к неконтролируемому кровотечению и гибели животного. Точно так же, при подготовке сонную артерию для вставки канюли, нужно затянуть и сократить артерию тщательно, если поток узел становится свободным неконтролируемое кровотечение состоится. Наконец, трепанация черепа должны быть сделаны тщательно, не разрушая при этом ориентиры сосудов. Неосторожное удаление внешнего менингеального слоя (твердой мозговой) может привести к тяжелым кровотечением и повреждением артериальной питания. Настройки вентиляции выбираются в зависимости от возраста животного.Большинство коммерческих поставщики предоставляют полезную информацию о таких условиях. Эксперименты на крысах старше P15 потребует использование большого животного вентилятора. Взрослые животные не нуждаются вентиляцию, если наркоз кетамином / ксилазина, но интубации рекомендуется избегать жидкости в трахею. Один Основным ограничением этого протокола является то, что эксперименты могут быть выполнены только остро. В нашей лаборатории мы провели эксперименты продолжительностью от двух и до десяти часов. Второе ограничение заключается в том, что эксперименты должны быть выполнены под наркозом. Таким образом, выбор анестетика является важной переменной рассмотреть в процессе планирования и планирования экспериментов. С этим связан вопрос, что новорожденных животные могут быть особенно чувствительны к передозировке. Например, если выбрать кетамина / ксилазина микс, рассчитать дозу в зависимости от веса щенка и администрирования лекарства по ⅓ от максимальной громкости. Проверьте состояние животного каждые 5-10 минут на носок щепотку гesponse. При использовании изофлурана, меры предосторожности так же необходимы для поддержания безопасной среды для следователя (надлежащей вентиляции и правильно калиброванного испарителя). Стереомикроскоп может быть установлен на гибком держателе, чтобы отрегулировать угол обзора и облегчения пространство зазор разместить электроды и переселение животных в двухфотонного микроскопа. Использование батарея для питания вентилятора может облегчить перемещение животных и снизить электрические артефакты во время электрофизиологии экспериментов. С этой целью небольшой макет (7,5 х 12 дюймов) можно использовать, чтобы собрать вместе вентилятор, грелку и анестезированных животных (рис. 2а). Полезным и важным модификация этой установки является добавление устройства для мониторинга жизненно важных функций во время операции. Оксиметр или другие аналоговые устройства могут быть использованы в зависимости от лаборатории бюджета. Этот протокол был использован с электрофизиологии и визуализации встретилисьHODS, в том числе патч зажим записи 8,10,11, polytrode записей (рис. 7) и двухфотонного визуализации 9 (рис. 6 и 8). Один из возможных будущих приложений будет сочетать эти методы для ориентации флюоресцентно меченых клеток для электрофизиологические записи 16. Новые приложения визуализации также может включать в себя 2-D или 3-D временных рядов с помощью двухфотонного микроскопа. Например, с помощью болюса загрузку показателей кальция изучать активность ствола мозга нейронных и глиальных клеточных популяций. Как показано на фиг.8, раствор красителя вводят в кровоток через сонную артерию может быть использован для создания высокую контрастность изображения сосудистой мозга. Как флуоресценции краситель заполняет просвет микрососудов и распространяется в окружающие ткани, оно может быть использовано не только для расчета кажущейся растворенного проницаемость гематоэнцефалического барьера, но и растворенное вещество диффузии коэффициентфициента в ткани мозга 3. Одной из главных причин для впрыскивания флуоресцентно меченных растворенные вещества через сонную артерию, что раствор красителя может непосредственно перейти к микрососудов в мозге, не идя в сердце первую, как в инъекции в хвостовую вену. Это приводит по крайней мере два преимущества. Во-первых, концентрация флуоресценция красителя в микрососудов просвет может быть практически постоянным, если скорость перфузии фиксируется на катетеризации сайте. Это гарантирует точное определение гематоэнцефалический барьер проницаемости. Другим является то, что если тест агент включен в перфузате, он будет непосредственно перейти к гематоэнцефалический барьер без разбавления или в сочетании с другими факторами от циркуляции тела. Новые эксперименты также можете воспользоваться трансгенных животных с генетически кодируемых флуоресцентных журналистами. Это позволило бы обеспечить то преимущество, что флуоресцентные зонды не должны были бы быть загружены на месте (если только дизайн экспериментауказано иное), экономя время и, возможно, что позволяет более нетронутыми препаратов (например, черепно оконных 17). Наконец, эксперименты могут быть сделано в других регионах, таких как стволовых нижней оливы или лицевого ядра двигателя. Знания о нейроанатомии и развития специфических клеточных популяций в данного вида будет иметь важное значение для достижения этой цели, в частности, анатомические ориентиры могут измениться в животные растут (рис. 1). Мы надеемся, этот протокол побуждает других исследовать брюшной стволовых структур с использованием в естественных условиях электрофизиологических и методов визуализации.

Использование трепанации черепа в сочетании с флуоресцентной визуализации и методов электрофизиологии позволяет поток мониторирование артериального, через гематоэнцефалический барьер, и измерения активности нейронов и глиальных клеток в живых животных 1-3. Несколько лабораторий использовали этот подход для обеспечения понимания в физиологии мозга у здоровых и болезненных условий, но пробелы в нашем понимании того, как эти процессы возникают в процессе разработки. Кроме того, большинство исследований были сосредоточены на областях мозга, которые легко доступны из спинной поверхности черепа, так что брюшные стволовых структур с разнообразными физиологической роли были изучены в основном используя Экс Vivo подходы. Основная цель настоящего Протокола заключается в создании способа открытия трепанацию черепа на брюшной черепа грызунов. Этот подход был адаптирован из классических исследований, проведенных в более крупных млекопитающих, таких как собаки и кошки для сенсорных нейрофизиологии RECOrdings слухового ствола мозга 4-7. В этом протоколе однако, есть новый вызов выполнении операции в новорожденных животных. Использование сосудистой ориентиры, это адаптировать протокол был использован ранее для изучения слуховой ствола мозга новорожденных крыс, взрослых мышей и других регионов стволовых как нижней оливы 8-11 (рис. 1). Главное преимущество брюшной трепанации черепа по сравнению с существующими методами для изучения брюшной ядра ствола мозга является то, что он обеспечивает прямой доступ к структурам, представляющим интерес в живых животных. Например, слуховые клетки верхнем оливарном комплекса локализованы несколько десятков микрометров от поверхности мозга, что очень важно для целевого размещения зондов и для использования подходы изображений двухфотонного в котором глубина визуализации могут быть ограничены до 0,5 мм по рассеяния света ткани и поглощения. Вентральной трепанация черепа также обеспечивает подготовку с относительно нетронутых нервных связей, белыйич нарушается при острых и органотипических препаратов срезов 12. В отличие от других протоколов для в естественных условиях экспериментов нейрофизиологии 13, вентральный подход может сочетаться с записи многоэлектродной и методов визуализации, которые предоставляют информацию о сотовых ансамблей (рис. 6 и 7). Наконец, в сочетании с этим протоколом флуоресцентно меченных растворенного вещества могут быть введены в сосудистой чтобы измерить изменения в гематоэнцефалический барьер, в растворенного вещества (рис. 8).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Absorbant pads</td>
			<td style="width:71px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:119px;">Sugi 31603</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:216px;">Cautery</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">GEM&#160;5917</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1287-500MG</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dissecting Chisel</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">10095-12</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DiI</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">V-22885</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Elastomer</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">KWIK-SIL</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fine Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14060-09</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11027-12,11617-12, 11616-16</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Spring Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15009-08</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Heating pad</td>
			<td style="width:71px;">FHC</td>
			<td style="width:119px;">40-90-2</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Intubation tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">BIO CO-KIT</td>
			<td style="width:167px;">Choose age appropriate size</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Light source</td>
			<td style="width:71px;">Spach Optics</td>
			<td style="width:119px;">Schott Ace illuminator&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Micro drill</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">MD-1200&#160;120V</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Paper tape</td>
			<td style="width:71px;">Walgreens</td>
			<td style="width:119px;">Generic brand</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:216px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">28145-483</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">52459-008</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">SZ61</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture</td>
			<td style="width:71px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">Prolene 86979</td>
			<td style="width:167px;">6-0 size</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120</td>
			<td style="width:167px;">Other options depending on pup&#8217;s age</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vaporizer (isoflurane)</td>
			<td style="width:71px;">Vetequip Incorporated</td>
			<td align="right" style="width:119px;">911103</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ventilator (minivent)</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">730043</td>
			<td style="width:167px;">Use for P0-P12 rats</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to make a craniotomy on the ventral skull of neonate rodents

Использование трепанации черепа для естественных условиях экспериментов в предоставляет возможность исследовать динамику различных клеточных процессов в мозге млекопитающих в зрелом возрасте и во время развития. Хотя большинство естественных условиях подходы в использовании трепанации черепа для изучения участки мозга, расположенные на спинной стороне, ствола мозга такие регионы, как моста, расположенных на брюшной стороне остаются относительно изученной. Основная цель этого протокола заключается в облегчении доступа к вентральной стволовых структур, чтобы они могли быть изучены в естественных условиях с использованием электрофизиологических и методы воображения. Такой подход позволяет изучение структурных изменений в аксонов большой дальности, моделей электрической активности в одной и ансамблей клеток и изменения в крови мозга барьер проницаемости в новорожденных животных. Хотя этот протокол был использован в основном для изучения слуховой ствол мозга в новорожденных крыс, он может быть легко адаптирована для исследований в других видов грызунов, таких как новорожденных мышей, взрослого РоденTS и других регионов мозга.

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents at JoVE.com

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

Хирургический метод описан разоблачить брюшной череп в новорожденных крыс. Используя этот подход, можно открыть трепанации черепа для выполнения острый электрофизиологии и двухфотонные эксперименты микроскопии в стволе мозга анестезированных щенков.

Метод Сделать трепанации черепа на брюшной Череп новорожденного Грызуны

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

a-method-to-make-a-craniotomy-on-the-ventral-skull-of-neonate-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Хронический изображений Мыши зрительной коры Использование тоньше черепа-подготовка

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Всего Подготовка горе взрослых Drosophila Брюшной нервной для инъекций Гигантские Dye Волоконно

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Органотипической культур Кусочек Эмбриональные Брюшной мозга: системы по изучению дофаминергической нейронов развития В пробирке</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

Полностью автоматизированный и очень гибкая система для тестирования нескольких когнитивных функций и запись нейронов деятельности в Грызунов

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

В ово выражения микроРНК в Брюшной Chick мозга

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Лазерная Захват микродиссекция - Демонстрация изоляции отдельных допамина нейронами и вся область брюшной покрышки

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Живая съемка никотина индуцированной сигнализации кальция и высвобождение нейромедиаторов Наряду вентральной гиппокампа Аксоны

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

Мощность Interstimulus интервала для оценки временных обработки грызунов

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

В Vivo Изображение цереброспинальной жидкости транспорт через Череп мыши Intact с помощью флуоресценции Макроскопия

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement learning. Understanding how the diverse neuronal inputs into the VTA control phasic DA release can provide a better picture of the circuitry that controls reward processing and reinforcement learning. Here, we describe a method that combines intra-VTA cannula infusions of pharmacological agonists and antagonists with stimulation-evoked phasic DA release (combined infusion and stimulation, or CIS) as measured by in vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV). Using CIS-FSCV in anesthetized rats, a phasic DA response can be evoked by electrically stimulating the VTA with a bipolar electrode fitted with a cannula while recording in the nucleus accumbens core. Pharmacological agonists or antagonists can be infused directly at the stimulation site to investigate specific VTA receptors&#39; roles in driving phasic DA release. A major benefit of CIS-FSCV is that VTA receptor function can be studied in vivo, building on in vitro studies.

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry CIS-FSCV to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

The goal of this protocol is to directly manipulate ventral tegmental area receptors to study their contribution to subsecond dopamine release.

Комбинированная инфузия и стимуляция с помощью циклической вольтамперометрии быстрого сканирования (CIS-FSCV) для оценки регуляции рецепторов вентральной тегментальной области фазового дофамина

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement ...