Name: a method to make a craniotomy on the ventral skull of neonate rodents
Uploaded: 2014-05-22T14:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом G12-RR003060 от NIH / NCRR / RCMI, грант SC1HD068129 от Юнис Шрайвер Национального института здравоохранения и человеческого развития ребенка, Национальный научный фонд CBet 0754158 и PSC-CUNY 62337-00 40 из Городского университета Нью- Йорк.

Следующий протокол следует руководству по уходу за животными, установленные на уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC) в Городском колледже Нью-Йорке. 1. Животных интубации (10-20 мин) <ol><li> До операции, подготовить млекопитающих раствор Рингера. Соберите хирургические инструменты, грелку и небольшая животноводческая вентилятор на скамейке (рис. 2). <ol><li> Для измерения через гематоэнцефалический барьер, сделать 10 мл 1% бычьего сывороточного альбумина раствор (BSA) в Ringer и растворить TRITC-декстран 155 кД в 8 мг / мл в 1%-ном растворе БСА, фильтр раствора с 25 мм шприцевой фильтр (0,2 мкм размер пор) и хранить в шприце фольги, покрытой в темноте. </li></ol></li><li> Обезболить животное с помощью ИФ. Используйте 5,0% для индукции и 1.5-3.0% для технического обслуживания. Альтернативно смесь кетамина (41,7 мг / кг) и ксилазина (2,5 мг / кг массы тела) могут быть использованы. Глубина анестезии можно проверить ног пинч рефлексаверхних и нижних конечностей. <ol><li> Последующие дозы кетамина (41,7 мг / кг массы тела) и ксилазина (2,3 мг / кг массы тела) следует вводить с шагом ⅓ от максимальной дозы, чтобы избежать передозировки. Использование грызунов вентилятора рекомендуется, чтобы противодействовать ксилазина индуцированных дыхания. </li></ol></li><li> Поместите наркозом щенка, лежа на его спинной стороне и закрепите его голову с пластиковой конуса используется для доставки анестетика (рис. 3а). <ol><li> Закрепите животное с помощью клейкой ленты на передних конечностях и хвосте (рис. 3а). </li><li> Альтернативой обеспечить голову щенка является использование головы табличку, прикрепленную к металлическим прутом. Примечание: Убедитесь, что грелку установлен на 37 ° С, чтобы избежать переохлаждения (рис. 3а). </li></ol></li><li> Используйте ножницы (рис. 2, б), чтобы сделать один продольный и четыре боковые разрезы на коже, покрывающий шею (Рис. 3б). Использование тупой технику, рассекают кожу и поместить его в сторону с помощью щипцов (рис. 2в и 3в). <ol><li> Держите кожу вниз с помощью клейкой ленты. Стабилизация головку в горизонтальном положении (фиг. 3c). </li></ol></li><li> Использование пружинных ножниц (рис. 2d) и тупой технику, нажмите желез и жировых слоев в сторону, чтобы выставить в трахею (рис. 3в). Определить местоположение сонных артерий. <ol><li> Держите сонные артерии от трахеи. Примечание: прокалывание сонных артерий может привести к массивной кровопотери и смерти щенка. </li></ol></li><li> Использование пружинных ножниц (рис. 2, г) рассекают продольные мышцы, покрывающие трахеи. Вырезать продольные мышцы, расположенные под трахеи (рис. 3d). Примечание: кольца трахеи должны быть четко видны (рис. 3e). <ol><li> Использованиещипцы (рис. 2в), связать две части шва вокруг трахеи. Одна часть шва обеспечит вентиляционную трубу и второй поток будет использоваться, чтобы закрыть трахеи Ростральные к точке ввода вентиляции трубы (рис. 4а). Примечание: Смочите подвергаются ткани регулярно раствором Рингера, чтобы предотвратить обезвоживание. </li></ol></li><li> Использование пружинных ножниц (рис. 2, г) сделать надрез на одном из трахеи колец, расположенных между двумя потоками, размещенных в шаге 1.6.1 (рис. 4в). Примечание: Убедитесь, что жидкость не попадает в открытую трахею. Жидкость в трахее вызовет удушье. </li><li> Вставьте интубации трубки (рис. 4б) в трахею и затяните нижнюю нить, чтобы закрепить его. Использование щипцов (рис. 2в), натяжение верхней нити, чтобы закрыть трахеи кзади от точки вставки интубации трубки. <ol><li> Tighteп и обрезать концы двух нитей (рис. 4d-е). Примечание: пара внутри интубации трубки является хорошим признаком управления воздушным потоком. </li></ol></li><li> Оперативно переключить подачу ИФ к вентилятору. Регулировка ударного объема и расхода воздуха в зависимости от веса животного. <ol><li> Закройте открытую окружающие ткани с эластомера (рис. 5а). Держите поверхность смоченной и чистый. </li></ol></li></ol> 2. Трахеи и мышц Переезд в Expose черепа (5-10 мин) <ol><li> Используйте пружинные ножницы (рис. 2d) сократить трахею, прилегающей к вентиляционной трубе. Выполнение два разреза вдоль мышечной стенке ротовой полости, чтобы обнажить хвостовой конец вкус (фиг. 5b). Примечание: При необходимости, использовать cauterizer, чтобы остановить кровотечение. Неконтролируемое кровотечение может привести к смерти животного. </li><li> Очиститеплощадь используя обильное количество раствора Рингера (Рисунок 5в). Определите разрыв между последней позвонков и Basi-затылочной кости (рис. 5d). Примечание: Разрыв между костями является полезным череп вехой для поиска стволовых структур. Уступает оливковое находится под этот пробел. Слуховой превосходит овальный комплекс расположен под Basi-затылочные кости в ростральной направлении от этого разрыва (см. также рисунок 1). </li><li> Очистите область с помощью щипцов (рис. 2в) и весенние ножницы (рис. 2, г). Не прокола кровеносные сосуды. Примечание: При необходимости, прижигать, чтобы остановить кровотечение. <ol><li> После того, как подвергается поверхность чистая жира и мышечной ткани, пространство отделения Basi-затылочную кость и последний позвонок должен быть виден (рис. 5d). </li></ol></li></ol> 3. Краниотомия (15-30 мин) <ol><li> Используйте microdrill или ультразвуковая моющее. Найдите медиальной стенки буллы. <ol><li> Тонкий череп, сделав перевернутый D форму, пока основные артерии не могут видеть (рис. 5e). Примечание: основной артерии (бас) работает на верхней части ствола мозга средней линии. Передней нижней мозжечковой артерии (AICA) отделения двусторонней и может быть надежно использованы в качестве ориентира, поскольку оно имеет постоянное положение в различных животных. </li><li> Когда череп тоньше, мягко разорвать его помощью рассекает долото (рис. 2е). Снимите кости кусок щипцами (рис. 2в). С другой стороны, поднимать и сломать череп, используя изогнутую иглу. Примечание: Повторите эту процедуру до тех пор, размер и форма краниотомии не подходит для запланированного эксперимента. Барельеф и AICA должны быть видны через твердую мембрану (рис. 5е). </li></ol></li><li> Очистите область несколько раз со свежим раствором Рингера. Использование абсорбирующего годовыхDS высушить поверхность твердой мозговой оболочки. <ol><li> Если необходимо, используйте шовный иглу для удаления твердую мозговую оболочку не сворачивая или нарушение ориентир артерии бас и AICA. Примечание: При длительность прокалывания спинномозговую жидкость вытечет. Очистите область с раствором Рингера и держать увлажненной в течение всего эксперимента. </li></ol></li></ol> 4. Электрофизиологии Эксперимент <ol><li> Выберите polytrode в соответствии с дизайном эксперимента (рис. 7а). Используйте тонкую кисть, чтобы покрыть polytrode с DiI. Перенесите раствор Dii в 1 мл трубки микроцентрифужных, опустите кисть в растворе и аккуратно нанести polytrode под визуальным руководством (то есть с использованием стереоскоп). Запуск на кончике зонда и тщательно продолжают до тех пор, пока все электроды покрыты равномерно. <ol><li> Поместите заземляющий электрод внутри полости рта. Загрузите polytrode в держатель электрода (рис. 7б </stronг&gt;). </li><li> Включите усилитель и проверьте, что все соединения хорошо работать. </li></ol></li><li> Расположите выше барельеф электрод на точки ветвления AICA (положение нуля). Перемещение электрода на нужную целевую точку с помощью соответствующего ростральной-поперечной координаты (рис. 7с). <ol><li> Поместите электрод на поверхности мозга и переместить его на нужную глубину с шагом 5-10 мкм. </li></ol></li><li> Выполните запись в соответствии с экспериментальной конструкции. Сохранить данные для дальнейшего анализа. </li></ol> 5. Двухфотонное изображений Эксперимент <ol><li> Включите микроскопом. Установите длины волны возбуждения и использовать соответствующий фильтр выбросов. Возбуждение при 800 нм и 607 ± 45 нм полосовой фильтр выбросов хорошо работать для визуализации TRITC-декстран. </li><li> Определите правую или левую сонную артерию. Использование тупой метод препарировать сонной артерии от соседних соединительных тканей или нервов. <ol><li> Выберите и удерживайте соннойартерии с кровоостанавливающего. Свяжите три части шва вокруг сонной артерии. </li><li> Затянуть нить ближе к сердечной стороне, чтобы остановить поток крови и оставить две другие темы, свободно. </li><li> Используйте тонких ножниц сделать небольшой надрез под углом 45 ° на сонной артерии между привязанной резьбой и следующей нитку. Примечание: Очистите кровь с фильтровальной бумаги. </li></ol></li><li> Иглу сонную артерию. Вставьте трубку, заполненную с TRITC-Декстрана в разрез на сонной артерии около 5 мм в глубину, ориентированной на голову щенка. <ol><li> Затянуть две другие темы, вокруг артерии провести трубку и артерию вместе. Затянуть темы, отделка и добавить эластомера для дальнейшей стабилизации. Примечание: На другой стороне трубки соединен с шприц, содержащий TRITC-декстрана раствор (полученного на стадии 1.1). </li></ol></li><li> Закрепите шприц на шприцевой насос. <ol><li> Наборскорость при скорости потока крови сонной артерии на щенка. Включите шприцевой насос на несколько секунд и проверить вручную, что раствор красителя может быть введен в сонной артерии. Примечание: Если предположить, что скорость кровотока в сонной артерии взрослых крыс (240-280 г) составляет около 3 мл / мин 14, скорость потока крови на крысиной щенка (например, P10 щенок весом 15-25 г) может быть рассчитана с Диапазон от 0.16-0.3 мл / мин. </li></ol></li><li> Место животное под объектив микроскопа. Введите флуоресцентный декстран в кровоток. <ol><li> Определить области, представляющие интерес на брюшной мозга с воздуха цели 5X. Переключение на 20-кратным или 40-кратном цели (погружение в воду, NA = 0,5 или 0,8 соответственно), чтобы сосредоточиться область интереса (ROI). </li><li> Начните изображений и настраивайте параметры получения изображений (время например, воздействие, мощность лазера, увеличение детектор) до интенсивности флуоресценции в сосудистой системе ROI оптимизирован (т.е.не слишком низкое, но не насыщенный). </li><li> Включите шприцевого насоса для введения раствора красителя в сонную артерию и получить временной ряд при фиксированной фокальной плоскости. </li></ol></li></ol> 6. Уход животных следующую процедуру <ol><li> Это процедура терминал. В конце эксперимента животных должны быть умерщвлены с повышенной дозы фенобарбитала (100 мг / кг, внутрибрюшинно инъекции) или любой другой метод эвтаназии, утвержденной Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации эвтаназии принципов. Примечание: перфузии через сердце с раствором Рингера следуют с фиксирующим раствором рекомендуется для дальнейшего гистологического анализа. </li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. N. D., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Sigler, A., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+2-photon+imaging+of+fine+structure+in+the+rodent+brain:+before,+during,+and+after+stroke.">In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain: before, during, and after stroke.</a> Stroke. 41 (10), 117-123 (2010).</li><li>Shi, L., Zeng, M., Sun, Y., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+blood-brain+barrier+solute+permeability+and+brain+transport+by+multiphoton+microscopy.">Quantification of blood-brain barrier solute permeability and brain transport by multiphoton microscopy.</a> ASME J. of Biomech. Eng. 136 (3), 031005-031005 (2014).</li><li>Galambos, R., Schwartzkopff, J., Rupert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+study+of+superior+olivary+nuclei.">Microelectrode study of superior olivary nuclei.</a> Am. J. Physiol. 197, 527-536 (1959).</li><li>Goldberg, J., Brown, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+binaural+neurons+of+dog+superior+olivary+complex+to+dichotic+tonal+stimuli:+some+physiological+mechanisms+of+sound+localization.">Response of binaural neurons of dog superior olivary complex to dichotic tonal stimuli: some physiological mechanisms of sound localization.</a> J. Neurophysiol. 32 (4), 613-636 (1969).</li><li>Guinan, J. J., Guinan, S. S., Norris, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+auditory+units+in+the+superior+olivary+complex+I:+responses+to+sounds+and+classifications+based+on+physiological+properties.">Single auditory units in the superior olivary complex I: responses to sounds and classifications based on physiological properties.</a> Intern. J. Neurosci. 4, 101-120 (1972).</li><li>Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recordings+from+cat+trapezoid+body+and+HRP+labeling+of+globular+bushy+cell+axons.">Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons.</a> J. Neurophysiol. 63 (5), 1169-1190 (1990).</li><li>Khosrovani, S., Der Giessen, R. S. V. a. n., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mouse+inferior+olive+neurons+exhibit+heterogeneous+subthreshold+oscillations+and+spiking+patterns.">In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (40), 15911-15916 (2007).</li><li>Rodr&#237;guez-Contreras, A., Van Hoeve, J. S., Habets, R. L., Locher, H., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+development+of+the+calyx+of+Held+synapse.">Dynamic development of the calyx of Held synapse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (14), 5603-5608 (2008).</li><li>Lorteije, J. A., Rusu, S. I., Kushmerick, C., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+precision+of+the+mouse+calyx+of+Held+synapse.">Reliability and precision of the mouse calyx of Held synapse.</a> J. Neurosci. 29 (44), 13770-13784 (2009).</li><li>Tritsch, N. X., Rodr&#237;guez-Contreras, A., Crins, T. T., Wang, H. C., Borst, J. G. G., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+action+potentials+in+hair+cells+pattern+auditory+neuron+activity+before+hearing+onset.">Calcium action potentials in hair cells pattern auditory neuron activity before hearing onset.</a> Nat. Neurosci. 13 (9), 1050-1052 (2010).</li><li>Tong, H., Steinert, J. R., Robinson, S. W., Chernova, T., Read, D. J., Oliver, D. L., Forsythe, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Kv+channel+expression+and+neuronal+excitability+in+rat+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body+maintained+in+organotypic+culture.">Regulation of Kv channel expression and neuronal excitability in rat medial nucleus of the trapezoid body maintained in organotypic culture.</a> J. Physiol. 588 (9), 1451-1468 (2010).</li><li>Sonntag, M., Englitz, B., Kopp-Scheinpflug, C., R&#252;bsamen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+postnatal+development+of+spontaneous+and+acoustically+evoked+discharge+activity+of+principal+cells+of+the+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body:+an+in+vivo+study+in+mice).">Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body: an in vivo study in mice).</a> J. Neurosci. 29 (30), 9510-9520 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Villal&#243;n, A. L., Roda, J. M., Alvarez, F., G&#243;mez, B., Di&#233;guez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+blood+flow+in+anesthetized+rats:+effects+of+carotid+ligation+and+anastomosis.">Carotid blood flow in anesthetized rats: effects of carotid ligation and anastomosis.</a> Microsurgery. 13 (5), 258-261 (1992).</li><li>Yuan, W., Lv, Y., Zeng, M., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+the+measurement+of+solute+permeability+of+rat+pial+microvessels.">Non-invasive method for the measurement of solute permeability of rat pial microvessels.</a> Microvasc. Res. 77 (2), 166-173 (2009).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Ha&#252;sser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo.">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Время имеет решающее значение. Опытный исследователь должен иметь возможность завершить этот протокол в течение 1 часа (шаги 1-3). Времена, установленные для различных этапов предположить среду высокого уровня знаний. Правильное и своевременное трахеотомия и интубация имеют решающее значение, так как слабый контроль вентиляции может привести к удушению и гибели животного. Тщательное оформление мышечной и жировой тканей также очень важно, поскольку ошибки могут привести к неконтролируемому кровотечению и гибели животного. Точно так же, при подготовке сонную артерию для вставки канюли, нужно затянуть и сократить артерию тщательно, если поток узел становится свободным неконтролируемое кровотечение состоится. Наконец, трепанация черепа должны быть сделаны тщательно, не разрушая при этом ориентиры сосудов. Неосторожное удаление внешнего менингеального слоя (твердой мозговой) может привести к тяжелым кровотечением и повреждением артериальной питания. Настройки вентиляции выбираются в зависимости от возраста животного.Большинство коммерческих поставщики предоставляют полезную информацию о таких условиях. Эксперименты на крысах старше P15 потребует использование большого животного вентилятора. Взрослые животные не нуждаются вентиляцию, если наркоз кетамином / ксилазина, но интубации рекомендуется избегать жидкости в трахею. Один Основным ограничением этого протокола является то, что эксперименты могут быть выполнены только остро. В нашей лаборатории мы провели эксперименты продолжительностью от двух и до десяти часов. Второе ограничение заключается в том, что эксперименты должны быть выполнены под наркозом. Таким образом, выбор анестетика является важной переменной рассмотреть в процессе планирования и планирования экспериментов. С этим связан вопрос, что новорожденных животные могут быть особенно чувствительны к передозировке. Например, если выбрать кетамина / ксилазина микс, рассчитать дозу в зависимости от веса щенка и администрирования лекарства по ⅓ от максимальной громкости. Проверьте состояние животного каждые 5-10 минут на носок щепотку гesponse. При использовании изофлурана, меры предосторожности так же необходимы для поддержания безопасной среды для следователя (надлежащей вентиляции и правильно калиброванного испарителя). Стереомикроскоп может быть установлен на гибком держателе, чтобы отрегулировать угол обзора и облегчения пространство зазор разместить электроды и переселение животных в двухфотонного микроскопа. Использование батарея для питания вентилятора может облегчить перемещение животных и снизить электрические артефакты во время электрофизиологии экспериментов. С этой целью небольшой макет (7,5 х 12 дюймов) можно использовать, чтобы собрать вместе вентилятор, грелку и анестезированных животных (рис. 2а). Полезным и важным модификация этой установки является добавление устройства для мониторинга жизненно важных функций во время операции. Оксиметр или другие аналоговые устройства могут быть использованы в зависимости от лаборатории бюджета. Этот протокол был использован с электрофизиологии и визуализации встретилисьHODS, в том числе патч зажим записи 8,10,11, polytrode записей (рис. 7) и двухфотонного визуализации 9 (рис. 6 и 8). Один из возможных будущих приложений будет сочетать эти методы для ориентации флюоресцентно меченых клеток для электрофизиологические записи 16. Новые приложения визуализации также может включать в себя 2-D или 3-D временных рядов с помощью двухфотонного микроскопа. Например, с помощью болюса загрузку показателей кальция изучать активность ствола мозга нейронных и глиальных клеточных популяций. Как показано на фиг.8, раствор красителя вводят в кровоток через сонную артерию может быть использован для создания высокую контрастность изображения сосудистой мозга. Как флуоресценции краситель заполняет просвет микрососудов и распространяется в окружающие ткани, оно может быть использовано не только для расчета кажущейся растворенного проницаемость гематоэнцефалического барьера, но и растворенное вещество диффузии коэффициентфициента в ткани мозга 3. Одной из главных причин для впрыскивания флуоресцентно меченных растворенные вещества через сонную артерию, что раствор красителя может непосредственно перейти к микрососудов в мозге, не идя в сердце первую, как в инъекции в хвостовую вену. Это приводит по крайней мере два преимущества. Во-первых, концентрация флуоресценция красителя в микрососудов просвет может быть практически постоянным, если скорость перфузии фиксируется на катетеризации сайте. Это гарантирует точное определение гематоэнцефалический барьер проницаемости. Другим является то, что если тест агент включен в перфузате, он будет непосредственно перейти к гематоэнцефалический барьер без разбавления или в сочетании с другими факторами от циркуляции тела. Новые эксперименты также можете воспользоваться трансгенных животных с генетически кодируемых флуоресцентных журналистами. Это позволило бы обеспечить то преимущество, что флуоресцентные зонды не должны были бы быть загружены на месте (если только дизайн экспериментауказано иное), экономя время и, возможно, что позволяет более нетронутыми препаратов (например, черепно оконных 17). Наконец, эксперименты могут быть сделано в других регионах, таких как стволовых нижней оливы или лицевого ядра двигателя. Знания о нейроанатомии и развития специфических клеточных популяций в данного вида будет иметь важное значение для достижения этой цели, в частности, анатомические ориентиры могут измениться в животные растут (рис. 1). Мы надеемся, этот протокол побуждает других исследовать брюшной стволовых структур с использованием в естественных условиях электрофизиологических и методов визуализации.

Использование трепанации черепа в сочетании с флуоресцентной визуализации и методов электрофизиологии позволяет поток мониторирование артериального, через гематоэнцефалический барьер, и измерения активности нейронов и глиальных клеток в живых животных 1-3. Несколько лабораторий использовали этот подход для обеспечения понимания в физиологии мозга у здоровых и болезненных условий, но пробелы в нашем понимании того, как эти процессы возникают в процессе разработки. Кроме того, большинство исследований были сосредоточены на областях мозга, которые легко доступны из спинной поверхности черепа, так что брюшные стволовых структур с разнообразными физиологической роли были изучены в основном используя Экс Vivo подходы. Основная цель настоящего Протокола заключается в создании способа открытия трепанацию черепа на брюшной черепа грызунов. Этот подход был адаптирован из классических исследований, проведенных в более крупных млекопитающих, таких как собаки и кошки для сенсорных нейрофизиологии RECOrdings слухового ствола мозга 4-7. В этом протоколе однако, есть новый вызов выполнении операции в новорожденных животных. Использование сосудистой ориентиры, это адаптировать протокол был использован ранее для изучения слуховой ствола мозга новорожденных крыс, взрослых мышей и других регионов стволовых как нижней оливы 8-11 (рис. 1). Главное преимущество брюшной трепанации черепа по сравнению с существующими методами для изучения брюшной ядра ствола мозга является то, что он обеспечивает прямой доступ к структурам, представляющим интерес в живых животных. Например, слуховые клетки верхнем оливарном комплекса локализованы несколько десятков микрометров от поверхности мозга, что очень важно для целевого размещения зондов и для использования подходы изображений двухфотонного в котором глубина визуализации могут быть ограничены до 0,5 мм по рассеяния света ткани и поглощения. Вентральной трепанация черепа также обеспечивает подготовку с относительно нетронутых нервных связей, белыйич нарушается при острых и органотипических препаратов срезов 12. В отличие от других протоколов для в естественных условиях экспериментов нейрофизиологии 13, вентральный подход может сочетаться с записи многоэлектродной и методов визуализации, которые предоставляют информацию о сотовых ансамблей (рис. 6 и 7). Наконец, в сочетании с этим протоколом флуоресцентно меченных растворенного вещества могут быть введены в сосудистой чтобы измерить изменения в гематоэнцефалический барьер, в растворенного вещества (рис. 8).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Absorbant pads</td>
			<td style="width:71px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:119px;">Sugi 31603</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:216px;">Cautery</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">GEM&#160;5917</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1287-500MG</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dissecting Chisel</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">10095-12</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DiI</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">V-22885</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Elastomer</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">KWIK-SIL</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fine Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14060-09</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11027-12,11617-12, 11616-16</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Spring Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15009-08</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Heating pad</td>
			<td style="width:71px;">FHC</td>
			<td style="width:119px;">40-90-2</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Intubation tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">BIO CO-KIT</td>
			<td style="width:167px;">Choose age appropriate size</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Light source</td>
			<td style="width:71px;">Spach Optics</td>
			<td style="width:119px;">Schott Ace illuminator&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Micro drill</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">MD-1200&#160;120V</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Paper tape</td>
			<td style="width:71px;">Walgreens</td>
			<td style="width:119px;">Generic brand</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:216px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">28145-483</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">52459-008</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">SZ61</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture</td>
			<td style="width:71px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">Prolene 86979</td>
			<td style="width:167px;">6-0 size</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120</td>
			<td style="width:167px;">Other options depending on pup&#8217;s age</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vaporizer (isoflurane)</td>
			<td style="width:71px;">Vetequip Incorporated</td>
			<td align="right" style="width:119px;">911103</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ventilator (minivent)</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">730043</td>
			<td style="width:167px;">Use for P0-P12 rats</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to make a craniotomy on the ventral skull of neonate rodents

Использование трепанации черепа для естественных условиях экспериментов в предоставляет возможность исследовать динамику различных клеточных процессов в мозге млекопитающих в зрелом возрасте и во время развития. Хотя большинство естественных условиях подходы в использовании трепанации черепа для изучения участки мозга, расположенные на спинной стороне, ствола мозга такие регионы, как моста, расположенных на брюшной стороне остаются относительно изученной. Основная цель этого протокола заключается в облегчении доступа к вентральной стволовых структур, чтобы они могли быть изучены в естественных условиях с использованием электрофизиологических и методы воображения. Такой подход позволяет изучение структурных изменений в аксонов большой дальности, моделей электрической активности в одной и ансамблей клеток и изменения в крови мозга барьер проницаемости в новорожденных животных. Хотя этот протокол был использован в основном для изучения слуховой ствол мозга в новорожденных крыс, он может быть легко адаптирована для исследований в других видов грызунов, таких как новорожденных мышей, взрослого РоденTS и других регионов мозга.

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents at JoVE.com

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

Хирургический метод описан разоблачить брюшной череп в новорожденных крыс. Используя этот подход, можно открыть трепанации черепа для выполнения острый электрофизиологии и двухфотонные эксперименты микроскопии в стволе мозга анестезированных щенков.

Метод Сделать трепанации черепа на брюшной Череп новорожденного Грызуны

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Хронический изображений Мыши зрительной коры Использование тоньше черепа-подготовка

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Всего Подготовка горе взрослых Drosophila Брюшной нервной для инъекций Гигантские Dye Волоконно

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

Полностью автоматизированный и очень гибкая система для тестирования нескольких когнитивных функций и запись нейронов деятельности в Грызунов

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

В ово выражения микроРНК в Брюшной Chick мозга

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Лазерная Захват микродиссекция - Демонстрация изоляции отдельных допамина нейронами и вся область брюшной покрышки

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Живая съемка никотина индуцированной сигнализации кальция и высвобождение нейромедиаторов Наряду вентральной гиппокампа Аксоны

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Мощность Interstimulus интервала для оценки временных обработки грызунов

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Последствия взрыва индуцированной нейротравма под давлением грызунов средней мозговой артерии

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

В Vivo Изображение цереброспинальной жидкости транспорт через Череп мыши Intact с помощью флуоресценции Макроскопия

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry CIS-FSCV to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

Комбинированная инфузия и стимуляция с помощью циклической вольтамперометрии быстрого сканирования (CIS-FSCV) для оценки регуляции рецепторов вентральной тегментальной области фазового дофамина

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement ...