Name: a method to make a craniotomy on the ventral skull of neonate rodents
Uploaded: 2014-05-22T14:00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag G12-RR003060 från NIH / NCRR / RCMI bevilja SC1HD068129 från Eunice Shriver National Institute of Child Health &amp; Human Development, National Science Foundation CBET 0.754.158 och PSC-CUNY 62.337-00 40 från City University i New York.

Följande protokoll följer de riktlinjer djurskötsel fastställts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) på The City College i New York. 1. Animal Intubation (10-20 min) <ol><li> Före operation, förbereda däggdjur Ringers lösning. Montera kirurgiska verktyg, värmedyna, och små djur ventilator på bänken (Figur 2). <ol><li> För mätningar av blod-hjärnbarriären permeabilitet göra 10 ml av 1% bovint serumalbumin (BSA)-lösning i Ringer och lös TRITC-dextran 155 kD vid 8 mg / ml i 1% BSA-lösning, filtrerades lösningen med 25 mm sprutfilter (0,2 | im porstorlek) och förvara i en folietäckt spruta i mörkret. </li></ol></li><li> Bedöva djuret med hjälp av isofluran. Använd 5,0% för induktion och 1,5-3,0% för underhåll. Alternativt kan en blandning av ketamin (41,7 mg / kg) och xylazin (2,5 mg / kg kroppsvikt) kan användas. Kan kontrolleras anestesidjup genom tå nypa reflex avövre och nedre extremiteterna. <ol><li> Efterföljande doser av ketamin (41,7 mg / kg kroppsvikt) och xylazin (2,3 mg / kg kroppsvikt) bör administreras i steg om ⅓ av den maximala dosen för att undvika överdosering. Användning av en gnagare ventilator rekommenderas att motverka xylazin-inducerad andningsdepression. </li></ol></li><li> Placera sövd pup liggande på ryggsidan och säkra dess huvud med plastmembran används för att leverera bedövningsmedel (figur 3a). <ol><li> Säkra djuret med tejp på frambenen och svansen (figur 3a). </li><li> Ett alternativ för att säkra valpens huvud är att använda en huvudplatta fäst vid en metallstång. OBS: Se till att värmedynan är satt till 37 ° C för att undvika hypotermi (figur 3a). </li></ol></li><li> Använd en sax (Figur 2b) för att göra en longitudinell och fyra sido snitt på huden som ligger över halsen (Figur 3b). Med hjälp av trubbiga teknik, dissekera huden och lägg den åt sidan med hjälp av pincett (figur 2c och 3c). <ol><li> Håll huden ner med hjälp av tejp. Stabilisera huvudet i horisontellt läge (Figur 3c). </li></ol></li><li> Använda våren sax (figur 2d) och trubbiga teknik, tryck körtlar och fettlager åt sidan för att exponera luftstrupen (Figur 3c). Identifiera placeringen av halspulsåder. <ol><li> Håll halspulsåder bort från luftstrupen. Notera: punktera halspulsådern kan leda till massiv blodförlust och död av valpen. </li></ol></li><li> Använda våren sax (figur 2d) dissekera de längsgående muskler som täcker luftstrupen. Skär de längsgående muskler sitter under luftstrupen (figur 3d). Obs! Trakealringar ska synas tydligt (Figur 3e). <ol><li> Användapincett (Figur 2c), slips två bitar av sutur kring luftstrupen. En bit av suturen kommer att säkra ventilationsröret och den andra gängan kommer att användas för att stänga luftstrupen rostralt till ventilationsröret insättningspunkten (Figur 4a). Obs: fukta exponerad vävnad regelbundet med Ringer-lösning för att förhindra uttorkning. </li></ol></li><li> Använda våren sax (figur 2d) göra ett snitt på en av de trakeala ringarna som är belägna mellan de två trådarna placerade i steg 1.6.1 (figur 4c). OBS: Se till att ingen vätska kommer in i öppna luftstrupen. Vätska i trakea kommer att orsaka kvävning. </li><li> Sätt i intubation röret (figur 4b) i luftstrupen och dra undertråden för att säkra den. Använd pincett (Figur 2c), dra övertråden för att stänga luftstrupen bakre till insättningspunkten för intubation röret. <ol><li> Filttätn och trimma ändarna av de två trådarna (fig 4d-f). OBS: Ånga inuti intubering röret är ett gott tecken på luftkontroll. </li></ol></li><li> Genast växla isofluran försörjningen till ventilatorn. Justera slagvolymen och ventilationsgraden i enlighet med vikten hos djuret. <ol><li> Täta exponeras omgivande vävnad med elastomeren (figur 5a). Håll ytan fuktig och ren. </li></ol></li></ol> 2. Trachea och Muscle Removal att Exponera Cranium (5-10 min) <ol><li> Använd fjäder sax (figur 2d) för att skära luftstrupen i anslutning till ventilationsröret. Utför två snitt längs muskelväggen av munhålan för att avslöja den kaudala änden av gommen (figur 5b). OBS: Om det behövs, använd en cauterizer att stoppa blödning. Okontrollerad blödning orsakar djuret dör. </li><li> Rengörområde med rikliga mängder av Ringer-lösning (Figur 5c). Identifiera gapet mellan den sista kotorna och basi-occipital ben (figur 5d). OBS: Klyftan mellan benen är en användbar skalle landmärke att lokalisera hjärnstamsstrukturer. Den sämre oliv finns under denna lucka. Hörsel överlägsna olivary komplex ligger under basi-occipital ben i den rostrala riktningen från denna lucka (se även figur 1). </li><li> Rengör området med hjälp av pincett (Figur 2c) och våren sax (figur 2d). Gör inte hål blodkärl. OBS: Om det behövs, bränna för att stoppa blödning. <ol><li> Efter det exponerade området är rent av fett-och muskelvävnad, bör det utrymme som skiljer basi-occipital ben och den sista kotan vara synlig (Figur 5d). </li></ol></li></ol> 3. Kraniotomi (15-30 min) <ol><li> Använd en Microdrill eller en ultrasonic rengöringsmedel. Leta reda på den mediala väggen i bulla. <ol><li> Tunna skallen genom att göra en inverterad D formen tills de underliggande blodkärlen syns (Figur 5e). Obs: basilar artär (BAS) körs på toppen av hjärnstammen mittlinjen. Den främre sämre cerebellar artären (AICA) filialer bilateralt och kan användas tillförlitligt som ett landmärke som den har en konstant position i olika djur. </li><li> När skallen förtunnas, försiktigt bryta den med en dissekera stämjärn (figur 2e). Ta bort ben bit med pincett (Figur 2c). Alternativt, lyfta och bryta skallen med en böjd nål. OBS: Upprepa detta tills storleken och formen på kraniotomi är lämplig för den planerade experiment. BAS och AICA ska vara synlig genom dura membranet (figur 5f). </li></ol></li><li> Rengör området flera gånger med färska Ringers lösning. Med hjälp av absorberande pads torka ytan av dura membranet. <ol><li> Använd vid behov en sutur nål för att ta bort dura membranet utan att tränga undan eller bryta landmärke artärer bas och AICA. OBS: Vid dura punktering cerebrospinalvätska rinner ut. Rengör området med Ringer-lösning och hålla fuktade under hela experimentet. </li></ol></li></ol> 4. Elektro Experiment <ol><li> Välj polytrode enligt experimentets utformning (figur 7a). Använd en fin pensel för att belägga polytrode med Dil. Överför DII lösningen i en 1 ml mikrocentrifugrör, doppa penseln i lösningen och försiktigt strejk polytrode under visuell ledning (dvs. med hjälp av en stereoskop). Start vid sondens spets och försiktigt fortsätta tills alla elektroder är belagda jämnt. <ol><li> Placera jordelektroden inuti munhålan. Fyll på polytrode i elektrodhållaren (Figur 7b </strong&gt;). </li><li> Slå på förstärkaren och kontrollera att alla anslutningar fungerar bra. </li></ol></li><li> Placera elektroden ovanför bas vid grenpunkten AICA (läge noll). Flytta elektroden till önskad målpunkt genom användning av den lämpliga rostral-lateral koordinat (fig. 7c). <ol><li> Placera elektroden på hjärnans yta och flytta den till det önskade djupet i steg om 5 till 10 | im. </li></ol></li><li> Utför inspelning enligt experimentell design. Spara information för vidare analys. </li></ol> 5. Två-foton Imaging Experiment <ol><li> Slå på mikroskopet. Ställ excitationsvåglängden och använda ett lämpligt filter utsläpp. Excitation vid 800 nm och en 607 ± 45 nm bandpassemissionsfilter fungerar bra för avbildning TRITC-dextran. </li><li> Identifiera höger eller vänster halspulsådern. Att använda trubbiga teknik dissekera halspulsådern från intilliggande bindväv och nerver. <ol><li> Plocka och håll halspulsådernartär med en hemostat. Knyt tre stycken av sutur runt halspulsådern. </li><li> Dra åt tråden närmare hjärtat sida för att stoppa blodflödet och lämna de andra två trådar lös. </li><li> Använd fina sax för att göra ett litet snitt i 45 ° vinkel på halspulsådern mellan den bundna tråden och nästa lös tråd. OBS: Rengör blod med absorberande papper. </li></ol></li><li> Kanylera karotidartären. För in slangen fylls med TRITC-dextranlösning i snitt på halspulsådern ca 5 mm djup inriktad mot valpens huvud. <ol><li> Dra åt de andra två trådar runt artären för att hålla slangen och artären tillsammans. Dra trådarna, trim och lägga elastomer att ytterligare stabilisera. Anmärkning: Det andra sidan av slangen är ansluten till sprutan innehållande TRITC-dextran-lösning (framställd i steg 1.1). </li></ol></li><li> Fäst sprutan på sprutpumpen. <ol><li> Sethastigheten vid karotidartären blodflödeshastigheten i valp. Slå på sprutpump under några sekunder och kontrollera manuellt att färgämnet lösningen kan injiceras i karotidartären. Anmärkning: Om man antar att blodflödeshastigheten i halsartären hos vuxna råttor (240-280 g) är ca 3 ml / min 14 kan blodflödeshastigheten för en råttunge (t.ex. P10 pup vägande 15-25 g) beräknas till intervallet 0,16 till 0,3 ml / min. </li></ol></li><li> Placera djuret under mikroskop målet. Injicera fluorescerande dextran i blodomloppet. <ol><li> Identifiera områden av intresse på den ventrala hjärnstammen med en 5x luft mål. Växla till en 20X eller 40X mål (nedsänkning i vatten, NA = 0,5 eller 0,8, respektive) för att fokusera på regionen av intresse (ROI). </li><li> Börja avbildning och justera bildinsamlingsparametrar (t ex exponeringstid, lasereffekt, detektorns förstärkning) tills fluorescensintensiteten i vaskulaturen av ROI är optimerad (dvs.inte är för låg men inte mättad). </li><li> Slå på sprutpumpen för att injicera färgämneslösningen i karotidartären och förvärva en tidsserie till ett fast fokalplan. </li></ol></li></ol> 6. Djurvård följande procedur <ol><li> Detta är en terminal förfarande. I slutet av ett experiment djur måste avlivas med en överdos av pentobarbital (100 mg / kg, intraperitoneal injektion) eller någon annan metod för dödshjälp godkänd av American Veterinary Medical Association Eutanasi riktlinjer. OBS: perfusion genom hjärtat med Ringer-lösning, följt med en fixeringslösning rekommenderas för vidare histologisk analys. </li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. N. D., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Sigler, A., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+2-photon+imaging+of+fine+structure+in+the+rodent+brain:+before,+during,+and+after+stroke.">In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain: before, during, and after stroke.</a> Stroke. 41 (10), 117-123 (2010).</li><li>Shi, L., Zeng, M., Sun, Y., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+blood-brain+barrier+solute+permeability+and+brain+transport+by+multiphoton+microscopy.">Quantification of blood-brain barrier solute permeability and brain transport by multiphoton microscopy.</a> ASME J. of Biomech. Eng. 136 (3), 031005-031005 (2014).</li><li>Galambos, R., Schwartzkopff, J., Rupert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+study+of+superior+olivary+nuclei.">Microelectrode study of superior olivary nuclei.</a> Am. J. Physiol. 197, 527-536 (1959).</li><li>Goldberg, J., Brown, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+binaural+neurons+of+dog+superior+olivary+complex+to+dichotic+tonal+stimuli:+some+physiological+mechanisms+of+sound+localization.">Response of binaural neurons of dog superior olivary complex to dichotic tonal stimuli: some physiological mechanisms of sound localization.</a> J. Neurophysiol. 32 (4), 613-636 (1969).</li><li>Guinan, J. J., Guinan, S. S., Norris, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+auditory+units+in+the+superior+olivary+complex+I:+responses+to+sounds+and+classifications+based+on+physiological+properties.">Single auditory units in the superior olivary complex I: responses to sounds and classifications based on physiological properties.</a> Intern. J. Neurosci. 4, 101-120 (1972).</li><li>Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recordings+from+cat+trapezoid+body+and+HRP+labeling+of+globular+bushy+cell+axons.">Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons.</a> J. Neurophysiol. 63 (5), 1169-1190 (1990).</li><li>Khosrovani, S., Der Giessen, R. S. V. a. n., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mouse+inferior+olive+neurons+exhibit+heterogeneous+subthreshold+oscillations+and+spiking+patterns.">In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (40), 15911-15916 (2007).</li><li>Rodr&#237;guez-Contreras, A., Van Hoeve, J. S., Habets, R. L., Locher, H., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+development+of+the+calyx+of+Held+synapse.">Dynamic development of the calyx of Held synapse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (14), 5603-5608 (2008).</li><li>Lorteije, J. A., Rusu, S. I., Kushmerick, C., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+precision+of+the+mouse+calyx+of+Held+synapse.">Reliability and precision of the mouse calyx of Held synapse.</a> J. Neurosci. 29 (44), 13770-13784 (2009).</li><li>Tritsch, N. X., Rodr&#237;guez-Contreras, A., Crins, T. T., Wang, H. C., Borst, J. G. G., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+action+potentials+in+hair+cells+pattern+auditory+neuron+activity+before+hearing+onset.">Calcium action potentials in hair cells pattern auditory neuron activity before hearing onset.</a> Nat. Neurosci. 13 (9), 1050-1052 (2010).</li><li>Tong, H., Steinert, J. R., Robinson, S. W., Chernova, T., Read, D. J., Oliver, D. L., Forsythe, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Kv+channel+expression+and+neuronal+excitability+in+rat+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body+maintained+in+organotypic+culture.">Regulation of Kv channel expression and neuronal excitability in rat medial nucleus of the trapezoid body maintained in organotypic culture.</a> J. Physiol. 588 (9), 1451-1468 (2010).</li><li>Sonntag, M., Englitz, B., Kopp-Scheinpflug, C., R&#252;bsamen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+postnatal+development+of+spontaneous+and+acoustically+evoked+discharge+activity+of+principal+cells+of+the+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body:+an+in+vivo+study+in+mice).">Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body: an in vivo study in mice).</a> J. Neurosci. 29 (30), 9510-9520 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Villal&#243;n, A. L., Roda, J. M., Alvarez, F., G&#243;mez, B., Di&#233;guez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+blood+flow+in+anesthetized+rats:+effects+of+carotid+ligation+and+anastomosis.">Carotid blood flow in anesthetized rats: effects of carotid ligation and anastomosis.</a> Microsurgery. 13 (5), 258-261 (1992).</li><li>Yuan, W., Lv, Y., Zeng, M., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+the+measurement+of+solute+permeability+of+rat+pial+microvessels.">Non-invasive method for the measurement of solute permeability of rat pial microvessels.</a> Microvasc. Res. 77 (2), 166-173 (2009).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Ha&#252;sser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo.">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

Tiden är kritisk. En erfaren forskare ska kunna slutföra detta protokoll i 1 timme (steg 1-3). Tiderna som anges för de olika stegen antar en medelhög till hög kompetens. Korrekt och aktuell trakeotomi och intubation är kritiska, eftersom dålig ventilation kontroll kan leda till kvävning och djuret dör. Noggrann clearance av muskel-och fettvävnader är också mycket viktigt eftersom misstag kan leda till okontrollerad blödning och djuret dör. På samma sätt vid upprättandet av halspulsådern för kanyl insättning, måste man dra åt och skära artären försiktigt, om tråden knut lossnar okontrollerad blödning kommer att ske. Slutligen bör kraniotomi göras försiktigt, utan att störa de landmärken kärlbädden. Vårdslös borttagande av det yttre meningeal skikt (dura) kan leda till allvarlig blödning och skada på det arteriella försörjningen. Ventilationsinställningarna väljs efter djurets ålder.De flesta kommersiella leverantörer ger användbar information om dessa inställningar. Experiment på råttor äldre än P15 kommer att kräva användning av ett stort djur ventilator. Vuxna djur kanske inte behöver ventilation om bedövas med ketamin / xylazin, men intubation rekommenderas att undvika att vätska kommer in i luftstrupen. En viktig begränsning i detta protokoll är att experiment endast kan utföras akut. I vårt laboratorium har vi utfört experiment som varar mellan två och upp till tio timmar. En andra begränsning är att experiment måste utföras under anestesi. Därför är valet av narkosmedel en viktig variabel att beakta vid planeringen och utformningen av experiment. En annan risk är att nyfödda djur kan vara särskilt känsliga för överdosering. Till exempel, om du väljer ketamin / xylazin mix, beräkna dosen baserat på valpens vikt och administrera läkemedel på ⅓ av den maximala volymen. Kontrollera tillståndet för djuret varje 5-10 minuter från tå nypa response. Om du använder isofluran, skall säkerhetsåtgärder också behövs för att upprätthålla en säker miljö för forskaren (ventilation, och en riktigt kalibrerad förångare). Den stereomikroskop kan monteras på en flexibel hållare för att justera betraktningsvinkel och underlätta utrymme klare att placera elektroder och flytt av djuret till två-photon mikroskop. Användning av ett batteri för att driva fläkten kan underlätta att flytta djuret och minska elektriska artefakter under elektrofysiologi experiment. För detta ändamål kan en liten kopplingsdäck (7,5 x 12 inches) användas för att montera ihop ventilatorn värmedyna och sövda djur (Figur 2a). En användbar och viktig modifiering av denna inställning är tillägget av en anordning för övervakning av vitala funktioner under kirurgi. En oxymeter eller andra analoga enheter kan användas beroende på laboratoriebudgeten. Detta protokoll har använts med elektrofysiologi och bildhantering möttestrågen, inklusive patch clamp inspelningar 8,10,11, polytrode inspelningar (figur 7) och två-foton-avbildning 9 (fig 6 och 8). En möjlig framtida applikation skulle vara att kombinera dessa metoder för inriktning fluorescerande celler för elektrofysiologiska inspelning 16. Nya bildprogram kan också innehålla 2-D eller 3-D tidsserier med hjälp av två-photon mikroskopi. Exempelvis med användning av bolus-lastning av kalcium indikatorer för att studera aktiviteten av hjärnstammen neuronala och gliala cellpopulationer. Såsom visas i fig 8, insprutas en färgämneslösning in i blodcirkulationen genom halspulsådern kan användas för att alstra bilder med hög kontrast av hjärnan vasculature. Eftersom fluorescens färgämne fyller mikrokärllumen och sprider sig in i den omgivande vävnaden, kan den användas inte bara för att beräkna den skenbara upplösta ämnet permeabiliteten hos blod-hjärnbarriären, utan även det lösta ämnet diffusion coefligt i hjärnvävnaden 3. En viktig anledning till att injicera fluorescerande lösta ämnen via halspulsådern är att färglösningen direkt kan gå till mikrokärl i hjärnan utan att gå till hjärtat först som i en svansveninjektion. Detta medför åtminstone två fördelar. En är att den fluorescerande färgämneskoncentrationen i mikrokärls lumen kan vara praktiskt taget konstant om perfusionshastighet är fast vid kanyle platsen. Detta säkerställer noggrann bestämning av blod-hjämbarriären. En annan är att, om ett testmedel ingår i perfusatet, kommer det att gå direkt till blod-hjärnbarriären utan att bli utspädd eller i kombination med andra faktorer från kroppen cirkulationen. Nya experiment kan också dra nytta av transgena djur med genetiskt kodade fluorescerande reportrar. Detta skulle ge den fördelen att fluorescerande prober inte skulle behöva laddas in situ (om utformningen av experimentetsäger annat), vilket sparar tid och eventuellt möjliggör mer intakta preparat (t ex skallfönster 17). Slutligen kan experiment utföras i andra hjärnstamsregioner såsom sämre olivolja eller ansiktsmotorkärnan. Kunskap om neuroanatomi och utveckling av specifika cellpopulationer i en viss art kommer att vara viktigt i detta syfte, särskilt som anatomiska landmärken kan förändras när djuren växer (Figur 1). Vi hoppas att detta protokoll uppmuntrar andra att studera ventrala hjärnstamsstrukturer med hjälp av in vivo-elektrofysiologiska och avbildningsmetoder.

Användningen av en kraniotomi i kombination med fluorescensavbildning och elektrofysiologiska tekniker medger övervakning blodflöde, blodhjärnbarriären permeabilitet och mätning av aktiviteten av neuroner och gliaceller i levande djur 1-3. Flera laboratorier har använt denna metod för att ge insikt i hjärnans fysiologi hos friska och sjukdomstillstånd, men fortfarande brister i förståelsen av hur dessa processer uppkommer under utveckling. Dessutom har de flesta studier fokuserat på områden i hjärnan som är lätt åtkomliga från den dorsala ytan av skallen, så att ventrala hjärnstamsstrukturer med olika fysiologiska roller har studerats mestadels använder ex vivo metoder. Det huvudsakliga målet med detta protokoll är att tillhandahålla en metod för att öppna en kraniotomi på den ventrala skallen av gnagare. Detta tillvägagångssätt var anpassad från klassiska studier på större däggdjur som hundar och katter för sensoriska neurofysiologi recordings av den auditiva hjärnstammen 4-7. I detta protokoll föreligger emellertid den nya utmaningen att utföra proceduren i nyfödda djur. Med hjälp av landmärken kärl har detta anpassat protokoll använts tidigare för att studera den auditiva hjärnstammen av nyfödda råttor, vuxna möss och andra hjärnstams regioner som underlägsna oliv 8-11 (figur 1). En stor fördel med en ventral kraniotomi över befintliga metoder för att studera ventrala hjärnstamskärnor är att det ger direkt tillgång till de strukturer av intresse i levande djur. Till exempel är hörselcellerna i den överlägsna olivary komplex lokaliserat några tiotals mikrometer från hjärnans yta, vilket är viktigt för riktad placering av sonder och för att använda två-photon avbildning där bilddjupet kan begränsas till 0,5 mm med ljusvävnadsspridning och absorption. En ventrala kraniotomi ger också ett preparat med relativt intakta neurala kopplingar, WHich störs i akuta och organotypic slice förberedelser 12. I motsats till andra protokoll för in vivo neurofysiologi experiment 13, kan kombineras en ventral strategi med multielektrod inspelning och avbildningsmetoder som ger information om cellulära ensembler (figur 6 och 7). Slutligen, i kombination med detta protokoll ett fluorescerande löst ämne kan injiceras i kärlsystemet för att mäta förändringar i blod-hjärnbarriären permeabilitet till lösta ämnet (Figur 8).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Absorbant pads</td>
			<td style="width:71px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:119px;">Sugi 31603</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:216px;">Cautery</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">GEM&#160;5917</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1287-500MG</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dissecting Chisel</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">10095-12</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DiI</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">V-22885</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Elastomer</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">KWIK-SIL</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fine Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14060-09</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11027-12,11617-12, 11616-16</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Spring Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15009-08</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Heating pad</td>
			<td style="width:71px;">FHC</td>
			<td style="width:119px;">40-90-2</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Intubation tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">BIO CO-KIT</td>
			<td style="width:167px;">Choose age appropriate size</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Light source</td>
			<td style="width:71px;">Spach Optics</td>
			<td style="width:119px;">Schott Ace illuminator&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Micro drill</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">MD-1200&#160;120V</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Paper tape</td>
			<td style="width:71px;">Walgreens</td>
			<td style="width:119px;">Generic brand</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:216px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">28145-483</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">52459-008</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">SZ61</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture</td>
			<td style="width:71px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">Prolene 86979</td>
			<td style="width:167px;">6-0 size</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120</td>
			<td style="width:167px;">Other options depending on pup&#8217;s age</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vaporizer (isoflurane)</td>
			<td style="width:71px;">Vetequip Incorporated</td>
			<td align="right" style="width:119px;">911103</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ventilator (minivent)</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">730043</td>
			<td style="width:167px;">Use for P0-P12 rats</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to make a craniotomy on the ventral skull of neonate rodents

Användningen av en kraniotomi för experiment in vivo ger en möjlighet att undersöka dynamiken hos olika cellulära processer i däggdjurshjärnan i vuxen ålder och under utveckling. Även om de flesta in vivo-metoder använder en kraniotomi för att studera hjärnregioner som ligger på ryggsidan, hjärnstammen regioner som pons, som ligger på den ventrala sidan förblir relativt understudied. Det huvudsakliga målet med detta protokoll är att underlätta tillgången till ventrala hjärnstamsstrukturer så att de kan studeras in vivo med hjälp av elektrofysiologiska och avbildningsmetoder. Detta tillvägagångssätt gör studie av strukturella förändringar i långväga axoner, mönster av elektrisk aktivitet i singel och ensembler av celler, och förändringar i blod-hjärnbarriären permeabilitet i nyfödda djur. Även om detta protokoll har använts främst för att studera den auditiva hjärnstammen i nyfödda råttor, kan det enkelt anpassas för studier i andra gnagare såsom nyfödda möss, vuxen rodents och andra hjärnstamsregioner.

Elektroporering av neurala spårämnen Den mediala kärnan hos den trapetsformade kroppen (MNTB) är en grupp av celler i superior olivary komplex som tidigare har studerats med hjälp av detta protokoll. Till exempel kan patch clamp-pipetter kan användas för att elektroporera neurala spårämnen (fig 6) 9. När pipetterna är placerade i närheten av mittlinjen, såsom visas i figur 6a, är resultatet att decussating afferenta axoner är märkta. En två-photon mikroskop utrustat med en hög numerisk apertur nedsänkning i vatten mål kan användas för att bilden fibrerna når MNTB, inklusive mycket fina säkerheter grenar (pilar i figur 6b). Neurala spårämnen kan också levereras till MNTB direkt, såsom visas i fig. 6c. Resultatet är märkning av MNTB celler och afferenta axoner, såsom kan inses av avbildning med lägre numerisk apertur vattenimmersionsobjektiv (figur 6d). Den main fördel med att använda den lägre förstoring mål är att ett bredare synfält kan undersökas, och även om detta leder till en minskning i spatial upplösning på grund av den lägre objektiv numerisk apertur kan individuella MNTB celler urskiljas väl (pilarna i figur 6d) . Den genomsnittliga längden på dessa experiment för åldrarna P1-P5 är 3,1 ± 1,4 timmar (n = 22 valpar). Elektrofysiologiska registreringar Spontan sprack bränning är en form av utvecklings elektrisk aktivitet observerats i enstaka MNTB celler före uppkomsten av hörsel 11,13. Med användning av denna kirurgiska protokollet är det också möjligt att rikta multielektrodtyp kedjor (polytrodes) till MNTB (Figur 7a-b). Resultatet är en inspelning av spontan aktivitet i en ensemble av MNTB celler. Figur 7e visar ett representativt polytrode inspelning från en P6 råtta. I detta experiment var den polytrode belagd med de lipofila färgämnet Dil använderen tunn pensel (se steg 4.1). Efter utförande av inspelning hjärnan bearbetades för histologisk analys och placeringen av Dil-märkta polytrode spår användes för att bekräfta korrekt målinriktning mot MNTB (figur 7d). Den genomsnittliga längden på experiment för åldrarna P1-P6 är 2,0 ± 0,7 timmar (n = 33 valpar). Mätning mikrokärls permeabilitet Detta protokoll kan också användas för att utföra två-photon imaging experiment av vaskulär permeabilitet. En fluorescerande löst ämne (TRITC-dextran, molekylvikt 155 kD, Stokes-radie ~ 8,5 nm) löstes i 1% BSA-Ringer-lösning och injiceras i den cerebrala cirkulationen genom en kanyl insatt i halsartären 14. Till skillnad från svansvenen injektioner, detta förfarande leds förbi hjärtat och introducerar den fluorescerande lösta ämnet direkt in i hjärnan mikrocirkulationen. Figur 8a illustrerar kvaliteten på märkning av blodkärlen, som resulterar från användning av denna procedur. Efter kontinuerligperfusion av märkta lösta ämnen in i blodströmmen är det möjligt att erhålla en tidsförlopp sekvens av en region av intresse, såsom visas i fig. 8b. Den totala fluorescensintensiteten i regionen av intresse mättes offline och en matematisk modell används för att bestämma blod-hjärnbarriären permeabilitet för fluorescensmärkta lösta ämnen (figur 8c) 15. Den genomsnittliga längden på experiment i evig P9-P10 är 2,3 ± 0,8 timmar (n = 3 valpar). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. Relativ placering av ventrala hjärnstams neurala strukturer med avseende på landmärken kärl i den neonatala råttan. Ett, från sidan av hjärnan. B, ventral bild av hjärnan. Stora blodkärl visas i rött och neurala strukturer av intresse är indicated av färg rutor. Inte ritade i skala. AICA = anterior sämre cerebellär artär; bas = basilaris artär; icv = sämre cerebral ven; MCA = mellersta cerebral artär; vert = vertebral artär; VSP = ventrala spinal artär. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2. Kirurgisk setup. Ett, kan operation göras på ett litet bröd bräda (1) som vilar på toppen av en stabil bordsskivan. En värmedyna (2) och en liten djur ventilator (3) kan sättas fast på brödkortet för att underlätta förflyttning av hela preparatet när det behövs. Det lilla djuret fläkten kan drivas av ett batteri (4). En magnethållare (5) kan användas för att säkra noskonen används för att leverera bedövningsmedel. Noskonen kanockså bidra till att säkra huvudet i ett stabilt läge. Om djuret inte behöver flyttas, en mikromanipulator (6) kan användas för att placera sonderna för elektrofysiologi eller neurala spårning experiment. En ljuskälla (7) och en stereoskop (ej på bild) som är nödvändiga för att visualisera landmärkes strukturer under mikrokirurgi. B är liten sax används i steg 1,4. C, Tång används i steg 1.4, 1.6.1, 1.8 och 1.8.1 . d, våren sax används i steg 1.5, 1.6 och 1.7. e är dissekera mejsel används i steg 3.1.2. Skala bar i e = 1 mm, gäller för bd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig2highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3. Exponera luftstrupen för intubation.a, är djuret bedövas, placeras i liggande läge och säkras med noskonen och tejp (streckade linjer). B, Huden skärs och placeras åt sidan för att avslöja den underliggande fettlagret. c., den överliggande fett och körtlar (visas i grått) skjuts åt sidan för att exponera luftstrupen. Tejp används för att fästa den överliggande huden (streckade linjer). D., är Luftstrupen dissekeras från muskulaturen. E, Visualisering av trakealringar indikerar lyckad borttagning av överliggande muskler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig3highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4. Intuberande djuret. En, två sutur trådar (vita pilar) är bundna runt luftstrupen(T). B, ska den intubation rör (det) vara tätt kopplad till y röret av djuret respirator. C, är en trakeostomi görs mellan de två sutur trådar (svart pil). D, Ventilationsröret är insatt och två suturtrådar är åtdragna. Ändarna av trådarna dras åt igen i en korsad sätt (anges med vita och svarta pilspetsar). E, är suturen ändelser bundna. F., är suturen ändelser trimmas och intubation är klar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig4highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5. Ta bort luftstrupen och göra kraniotomi. En är Beredningen stabiliseras med elastomer (område insi<html> de gröna streckade linjer). b., är Luftstrupen identifieras och sedan nedskärningar görs först för att separera luftstrupen från intubation röret, och sedan skära den mandibular musklerna (streckade linjer). c, Rengör ytan av skallen med hjälp av trubbiga teknik för att ta bort muskler och använda absorberande papper för att ta bort fett och blod. d. Exempel på ett rent område visar den sista kotorna (v) och basi-occipital ben (bo). Det finns en naturlig gapet mellan de två benen (svarta pilar). E, Med användning av en mikroborr eller ultraljudsrengöring tunna skallen i en inverterad D form (svarta pilar). Bryta försiktigt uttunnade skallen och ta bort den bit av benet. Landmark kärlsystemet ska vara synliga. F., hög förstoring bild av kärllandmärken på den exponerade hjärnstammen ytan. Bas = basilaris artär; AICA = anterior sämre cerebellär artär. Skala bar i b = 1 mm, gäller för ce.highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicka här för att visa en större bild. <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig6highres.jpg" width="500" /> Figur 6. Elektroporation av neurala spårämnen. En, en glaselektrod som innehåller neurala spårmikro ruby var placerad nära mittlinjen (röd cirkel). Spårämnet elektroporerades med användning av 7 andra lång -5 iA pulser varje 14 sekunder under 15 minuter. Efter 1 timme av återhämtning tid den inramade området avbildades med ett två-foton-mikroskop. P1 hos råttungar. B, föredöme z-stack bild av afferenta axon märkning i MNTB. Pilarna pekar på individuella kollaterala grenar. C, en glaselektrod fylld med mikro rubin positionerad ovanpå MNTB (röd cirkel). Den spårades elektro med samma inställningar som beskrivs i ett. Efter 1 timme av återhämtning tid den inramade området varavbildas med en två-foton-mikroskop. P5 hos råttungar. D., föredöme z-stack bild av märkta celler och axoner i MNTB. Pilar anger enkel MNTB celler. Etiketter i b och c anger objektivförstoring och numerisk bländare, respektive. Scale bar in a och c = 300 pm; skalstock i b = 45 um; skalstock i d = 90 um. AICA = anterior sämre cerebellär artär; bas = basilaris artär; r = rostral; l = sidled. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig6highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a> <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7. Riktad polytrode inspelning. A, Polytrode består av 4 skaft med 4 elektroder per skaft (svarta cirklar). Intra-och interskaft avstånd mellan elektroderna anges. B, </strong&gt; Exemplar bild av elektrofysiologi experiment. En referenselektrod införs i bucal kaviteten och en ploytrode är ansluten till huvudsteg. P6 hos råttungar. C, högre förstoring bild av landmärken kärl används för polytrode inriktning. Den polytrode Ingen placeras med rostral-laterala koordinater för att rikta den mediala kärnan i den trapetsformade kroppen (röd ruta). D, Posthoc histologiska analys visar korrekt inriktning av Dil belagda polytrode (polytrode spår visas i rött). E, föredöme multi -enhet inspelning. Trace ordning är samma som elektrod ordning i panel a. Inom skaft inspelningar har samma färg. Skala bar i e = 5 sekunder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig7highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a> <img alt="Figur 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig8highres.jpg"width = &quot;600&quot; /&gt; Figur 8. In vivo två-photon avbildning av hjärnan mikrokärl. a, 2-D bild (kollapsade Z-stack) av hjärnans kärl efter perfusion av TRITC-dextran 155 kD in i halspulsådern. Området avbildas är liknande den som visas i figur 7c. 20x/0.5 nedsänkning i vatten mål. P10 hos råttungar. B, region av intresse (ROI) som används för att mäta fluorescensintensiteten (röd ram sluten region). Den mikrokärls hade en diameter på ~ 14,2 ^ m och var belägen 182 pm under hjärnstammen ytan. C, typisk kurva av fluorescensintensitet (normaliserat värde) som en funktion av tiden. I 0 är ökningen steg i fluorescensintensiteten i ROI när fluorescenslösningen fyller bara upp kärllumen. (Di / dt) 0 och jag 0 används för att bestämma mikrokärls permeabilitet för det lösta ämnet. Permeabiliteten för TRITC-dextran 155 kD beräknades vara 1,5 x 10 -7 cm / sek.Skala bar i b = 100 um, gäller för en. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig8highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents at JoVE.com

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

En kirurgisk metod beskrivs för att exponera den ventrala skallen på nyfödda råttor. Med hjälp av denna metod är det möjligt att öppna en kraniotomi att utföra akuta elektrofysiologi och två-photon mikroskopi experiment i hjärnstammen på sövda valpar.

En metod för att göra en Kraniotomi på den ventrala Skull of Neonatal Gnagare

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

a-method-to-make-a-craniotomy-on-the-ventral-skull-of-neonate-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Kronisk Imaging av Mouse syncentrum Använda en uttunnade skallen Förberedelser

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Hela berget Beredning av vuxna Drosophila På magen Nerve Snodd till Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Organotypic Slice kulturer av embryonala på magen mitthjärnan: Ett system att studera Dopaminerga nervsystemets utveckling In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

En helt automatiserad och Mycket mångsidig system för att testa flera kognitiva funktioner och spela in neurala Aktiviteter i Gnagare

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

I ovo Uttryck av MikroRNA i ventrala Chick mitthjärnan

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Laser Capture Microdissection - En demonstration av Isolering av Individuell dopaminneuroner och hela Ventrala tegmentområdet

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Live avbildning av nikotin inducerad kalciumsignalering och frisättning av signalsubstans Längs Ventral Hippocampus Axoner

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

Kraften i Interstimulus intervall för bedömning av Temporal bearbetning i gnagare

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

In vivo avbildning av cerebrospinalvätska transport genom intakt mus skalle med Fluorescensmakroskopi

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement learning. Understanding how the diverse neuronal inputs into the VTA control phasic DA release can provide a better picture of the circuitry that controls reward processing and reinforcement learning. Here, we describe a method that combines intra-VTA cannula infusions of pharmacological agonists and antagonists with stimulation-evoked phasic DA release (combined infusion and stimulation, or CIS) as measured by in vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV). Using CIS-FSCV in anesthetized rats, a phasic DA response can be evoked by electrically stimulating the VTA with a bipolar electrode fitted with a cannula while recording in the nucleus accumbens core. Pharmacological agonists or antagonists can be infused directly at the stimulation site to investigate specific VTA receptors&#39; roles in driving phasic DA release. A major benefit of CIS-FSCV is that VTA receptor function can be studied in vivo, building on in vitro studies.

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry CIS-FSCV to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

The goal of this protocol is to directly manipulate ventral tegmental area receptors to study their contribution to subsecond dopamine release.

Kombinerad infusion och stimulering med snabbskanning cyklisk voltammetri (CIS-FSCV) för att bedöma ventral tegmental område receptorreglering av phasic dopamin

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement ...