Name: preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages
Uploaded: 2014-04-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages at JoVE.com

Les auteurs tiennent à exprimer un grand merci à MM. Josep Planas et Juan Castillo pour leur expertise professionnelle dans le développement et l&#39;application de ce protocole de culture de petits poissons et d&#39;amphibiens. Merci également aux innombrables personnes qui ont inlassablement assisté à la dissection et la dissociation du tissu musculaire de nombreux poissons (à la fois en espèces et nombre), y compris Matthew charge, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily, et Sinibaldo Romero. Ce travail a été soutenu par l&#39;Université de l&#39;Alabama à Birmingham Département de fonds de démarrage biologie, Centre pour la recherche de la protéase NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH Grant NIAMS # R03AR055350, et NDSU Advance AVANT NSF Grant # DRH-0811239 de PRB. Appui a été fourni par l&#39;UAB nutrition obésité Research Center attribution # P30DK056336, NIH NIDDK. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairementreprésenter les points de vue officiels de la NIH.

Déclaration éthique: Tout l&#39;expérimentation sur les animaux vertébrés décrites ici a été approuvée à l&#39;avance par le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université de l&#39;Alabama à Birmingham et est conforme aux lignes directrices établies par le Bureau de la protection des animaux de laboratoire, National Institutes of Health des États-Unis ministère de la Santé et des Services sociaux. 1. Préparation de la Culture...

Le programme myogénique, quelle qu&#39;en soit les espèces examinées, peut être le plus facilement étudiée à travers un système in vitro. En effet, lors de l&#39;isolement, des cellules précurseurs myogéniques (PPM) chez les poissons ou les cellules myosatellite (MSC) chez les mammifères pénètrent facilement ce processus hautement régulé impliquant la prolifération, le retrait du cycle cellulaire et la différenciation terminale des myoblastes et la fusion de ces myoblastes en myotubes naissante...

Une bonne compréhension de la myogenèse mammifère a été obtenue par la récapitulation de ce processus dans les deux souris primaire (Mus musculus) cultures de myoblastes et la lignée cellulaire dérivée de la souris bien décrit, C2C12 5. Début dans les années 1950 6, ces cultures ont conduit à beaucoup de progrès dans la compréhension du programme murinemyogenic et, par extension, la myogenèse chez les autres vertébrés. En outre, les techniques myofiber d&#39;explants cellulaires unique ont augmenté sur la compréhension des interactions entre les cellules satellites et les fibres musculaires entourant 7-9. Cultures de cellules sont particulièrement attrayants pour les enquêtes de la myogenèse en raison de la courte période de précurseur de cellule différenciée 10, relative facilité de transfection pour ARNi 11-14, 15,16 transgénique et surexpression études 14,17,18, l&#39;expansion in vitro suivie d&#39;une greffe in vivo 18-20, et même échantillonarison de cellules précurseurs myogéniques et leurs agents de régulation entre des taxons 21,22. Bien que les différences dues à l&#39;environnement artificiel du système de culture ont été décrits 5,23, ces systèmes in vitro se sont révélés être indispensable à notre dissection du programme complexe qui régit la formation des multinucléées, myofibersfrom mononucléées différenciation terminale des cellules progénitrices prolifératives appelées myosatellite cellules (CSM) chez les mammifères. En dehors de la classe des mammifères, cependant, la conservation et / ou la divergence des mécanismes contrôlant la myogenèse sont mal comprises, en grande partie en raison de la difficulté de culture de cellules précurseurs myogéniques (PPM) et les myoblastes de divers taxons. En effet, les cultures de myoblastes primaires n&#39;ont été décrit dans trois oiseaux 24-26, un reptile 27, quelques amphibiens 28-30, et quelques poissons 1,3,4,31-33. Continue lignées cellulaires myogéniques de vertebrates autres que les rongeurs 34-36 sont encore plus rares, avec la seule ligne non mammifère myogénique cellule étant dérivé de la caille japonaise (Cortunix japonica), QM7 37. Malgré de nombreuses tentatives de immortalisation, une lignée de cellules myogéniques téléostéens reste insaisissable et un protocole pour la transfection efficace de ces cellules n&#39;a été publié cette année 15. Ainsi, des protocoles clairs et bien optimisés pour la culture PPM primaires et les myoblastes d&#39;une variété de vertébrés sont très nécessaires non seulement pour étendre notre connaissance de l&#39;évolution du programme myogénique, mais d&#39;utiliser la puissance de la physiologie comparée de faire des percées dans le traitement des maladies musculo-squelettiques et des troubles humains. Alors que la littérature contient de nombreux rapports de MPC / myoblastes isolement 38-49, il est fréquent que les auteurs décrivent les protocoles de ces isolements en bref, souvent incomplètes, les formats. En outre, les protocoles les plus instructifs pensINDIQ U EES ont été développés pour les souris 50-53, et certains d&#39;entre eux compter sur la sélection d&#39;anticorps 54,55 ou 56,57 transgènes de fluorescence, ce qui rend ces protocoles inutilisable ou espèces non-rongeurs intimes impraticables utilisés par les biologistes musculaires. Avec peu connu sur piscine, amphibiens et reptiles myogenèse, un protocole détaillé et complet, décrit avec l&#39;aide de l&#39;audiovisuel et à l&#39;efficacité démontrée dans les espèces apparentées de loin, serait plus utile sur le terrain. D&#39;abord décrite par Powell et ses collègues en 1989 58, le protocole suivant a été initialement développé pour isoler les PPM et les myoblastes de salmonidés (à savoir, la truite arc, Oncorhynchus mykiss, et le saumon de l&#39;Atlantique, Salmo salar) et des cyprinidés plus grands (c.-à-poisson rouge, Carassiusauratusauratus) . En 2000, Fauconneau et Paboeuf optimisés une culture primaire de myoblastes pour la truite arc 59, et ma minoroptimizationsde ce protocole utilisable dans plusieurs petits ménés du clade Danioninae (de poisson zèbre, Danio rerio, et danio géant, Devario aequipinnatus) 32 en raison des nombreux outils génétiques disponibles pour travailler le poisson zèbre et donc ses proches parents. poissons téléostéens sont des organismes intéressants pour l&#39;étude en raison de leur stratégie de croissance divergent (au moins dans la plupart des espèces). Grands salmonidés, comme la plupart des poissons, poussent pour une durée indéterminée, avec un potentiel de croissance sans entrave par une asymptote à l&#39;échéance, même dans les vieux 60-62 ans. Contrairement poisson zèbre, les grandes danionins comme le danio géant 63 et moustachus potentiels typiques de poissons téléostéens de croissance d&#39;affichage de danio, rendant leur juxtaposition directe une plate-forme idéale pour comprendre si le choix du destin cellulaire MPC joue un rôle dans l&#39;hyperplasie du muscle squelettique par rapport à l&#39;hypertrophie. De même, nous avons montré que ce protocole peut être utilisé avec la souris et l&#39;axolotl, avec un rendement de cellule relativement élevé et Viabindices ilité. Salamandres urodèles, comme l&#39;axolotl mexicain (Ambystomamexicanum), possèdent la capacité remarquable à régénérer les tissus, y compris les membres et la queue 64-66 entières. Cette caractéristique rend ces modèles amphibies intéressants de l&#39;atrophie du muscle squelettique et du vieillissement. Selon le protocole décrit ci-dessous, une approche similaire peut être effectuée comme cela a été fait dans de nombreuses espèces de poissons, fournissant un contexte comparatif encore plus large pour de telles études. Comme de nombreux biologistes vraiment apprécier comparatifs, les avancées les plus significatives en biologie fondamentale et translationnelle biomédecine peuvent être faites lorsque les données sont analysées dans le spectre le plus large (ici, l&#39;ensemble de la lignée des vertébrés).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Detailed Reagent Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:205px;">Reagent</td>
			<td style="width:217px;">Company (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:161px;">Quantity per Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">&#947;-irradiated poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td>
			<td>P5899 (ICN19454405)</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td>
			<td>MT-50-003-PB (D7777)</td>
			<td>2 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Laminin</td>
			<td>BD Biosciences (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>CB-40232 (L2020)</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP328-500 (S5761)</td>
			<td>1.51 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">HEPES (C8H18N2O4S)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP310-1 (H6147)</td>
			<td>9.53 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SV3007901 (A5955)</td>
			<td>17-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BW17-519Z (G1397)</td>
			<td>2-3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Donor Equine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007403 (H1270)</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007103 (F2442)</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Collagenase (Type IV)</td>
			<td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>LS004189 (C9891)</td>
			<td>0.44 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Trypsin (from Pancreas)</td>
			<td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>ICN15357125 (T5266)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Consumables, Tools and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Consumable</td>
			<td style="width:204px;">Tools</td>
			<td style="width:199px;">Equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;">Cell Culture Plates</td>
			<td>Forceps (Coarse)</td>
			<td>Serological Pipettor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Sterile 50 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:204px;">Forceps (Fine)</td>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Laboratory Tape</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Handles</td>
			<td>Chilling Incubator (Echotherm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">0.2 &#956;m Vacuum Sterilization Systems</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Blades (#10, #11)</td>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Water-repellant Autoclave Paper</td>
			<td style="width:204px;">Surgical Scissors</td>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Serological Pipettes</td>
			<td>Glass Petri Dishes</td>
			<td>Microosmolality Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;"></td>
			<td>12-16 G Cannulas with Luer Locks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:167px;">Plate Size</td>
			<td style="width:192px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:132px;">Poly-L-lysine*</td>
			<td style="width:145px;">Laminin**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.6 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>0.16</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">*0.1 mg/mL concentration</td>
			<td colspan="2">** 0.020 mg/mL concentration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:155px;">Isolation</td>
			<td style="width:127px;">Wash</td>
			<td style="width:127px;">Dissociation</td>
			<td>Complete</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">Base Medium</td>
			<td>419.25 mL</td>
			<td>395.40 mL</td>
			<td>297.00 mL</td>
			<td>178.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PSF*</td>
			<td>5.00 mL</td>
			<td>4.00 mL</td>
			<td>3.00 mL</td>
			<td>2.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Gentamicin Sulfate**</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>0.60 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Donor Equine Serum</td>
			<td>75.00 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Fetal Bovine Serum***</td>
			<td style="width:155px;">-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="19" style="height:19px;width:660px;">* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:75px;">Plate Size</td>
			<td style="width:103px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:145px;">Dilution</td>
			<td style="width:111px;">Plating Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>250 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>150 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>50-100 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 6. Average number of cells per g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Average # cells/g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio rerio</td>
			<td colspan="2">6,400,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Danio dangila</td>
			<td colspan="2">1,783,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Devario aequipinnatus</td>
			<td colspan="2">1,797,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Oncorhynchus mykiss</td>
			<td colspan="2">66,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 7. Recommended Incubation Temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio/ Devario spp.</td>
			<td colspan="2">26 - 28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Oncorhynchus/Salmo spp.</td>
			<td colspan="2">10* - 18 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Ambystoma mexicanum</td>
			<td colspan="2">18&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">* Lower temperatures support lower proliferation rates.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages

En raison de la difficulté et le temps inhérente d&#39;étudier le programme myogénique in vivo, les systèmes de culture primaire dérivées des cellules souches adultes résidents du muscle squelettique, les cellules précurseurs myogéniques (PPM), se sont révélés indispensables à notre compréhension du développement du muscle squelettique de mammifère et croissance. En particulier chez les taxons de base de vertébrés, cependant, les données sont limitées décrivant les mécanismes moléculaires qui contrôlent l&#39;auto-renouvellement, la prolifération et la différenciation des PPM. D&#39;intérêt particulier sont les mécanismes potentiels qui sous-tendent la capacité des vertébrés basales de subir postlarvaire hyperplasie des fibres musculaires squelettiques considérable (c. téléostéens de poisson) et la régénération complète suite à la perte appendice (c. urodèles des amphibiens). En outre, l&#39;utilisation de myoblastes en culture pourrait aider à la compréhension de la régénération et la réexposition du programme myogénique et les différences entre eux. Àcette fin, nous décrivons en détail un protocole robuste et efficace (et leurs variations) pour isoler et maintenir PPM et leur progéniture, les myoblastes et les myotubes immatures, en culture cellulaire comme une plate-forme pour la compréhension de l&#39;évolution du programme myogénique, en commençant par le plus vertébrés basales. Capitalisant sur ​​le modèle du statu organisme du poisson zèbre (Danio rerio), nous présentons l&#39;application de ce protocole aux petits poissons de la cyprinidés clade Danioninae. Parallèlement, ce protocole peut être utilisé pour réaliser une approche comparative plus large en isolant PPM de l&#39;axolotl mexicain (Ambystomamexicanum) et même les rongeurs de laboratoire. Ce protocole est maintenant largement utilisée dans l&#39;étude de la myogenèse dans plusieurs espèces de poissons, y compris la truite arc, le saumon et la dorade 1-4.

Vingt-quatre heures après l&#39;ensemencement, les cellules précurseurs myogéniques (PPM) doivent être visibles fixé au substrat de laminine (voir les figures 1a et 1d). Après ensemencement, les cellules (PPM) adoptent une forme de broche-like, indicative de ce type de cellule (figure 1) et sont MyoD1 + (figure 2). En espèces Danio, PPM semblent être plus compact avec des processus bipolaires petites que ne le font les PPM de Oncorh...

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Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

La culture in vitro systèmes ont prouvé indispensable à notre compréhension de la myogenèse des vertébrés. Cependant, il reste beaucoup à apprendre sur le développement du muscle squelettique non-mammifère et la croissance, en particulier dans les taxons de base. Un protocole efficace et robuste pour isoler les cellules souches adultes de ce tissu, les cellules précurseurs myogéniques (PPM), et de maintenir leur auto-renouvellement, la prolifération et la différenciation dans un contexte de culture primaire permet d&#39;identifier des mécanismes de régulation conservés et divergentes tout au long de les lignées de vertébrés.

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