Name: preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages
Uploaded: 2014-04-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages at JoVE.com

著者は、博士に感謝を申し上げます。小さな魚や両生類にこの培養プロトコルの開発と応用での専門知識のためのジョセップPlanasは、フアンカスティーヨ。おかげで、原因疲れを知らずにマシューは、Delciクリステンセン、ザカリー·ファウラー、ブルック·フランツェン、ネイサンフレーリッヒ、キラマーシャルの充電など、多くの魚（種内および数の両方）からの筋組織の切開および解離を支援してきた無数の個人にもあるベン·メイヤー、イーサンRemily、およびSinibaldoロメロ。この作品は、PRBにセンタープロテアーゼ研究所NIHのグラント＃2P20 RR015566、NIHのグラントNIAMS＃R03AR055350とノシュアドバンスFORWARDためのNSFグラント＃HRD-0811239、生物スタートアップ資金のバーミンガム学科のアラバマ大学によってサポートされていました。サポートもUABの栄養肥満研究センター賞＃P30DK056336、NIH NIDDKによって提供された。 その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもないNIHの公式見解を表しています。

倫理に関する声明：本明細書中に記載の脊椎動物を含むすべての実験はバーミンガムのアラバマ大学の制度的動物実験委員会が事前に承認され、実験動物福祉局によって確立されたガイドラインと一致しているし、米国の国立衛生研究所保健社会福祉省。 文化1。準備<ol><li> 9のNaHCO 3（2 1L当たり1.51グラム）を、DMEM中の20のHEPES（2 1L当たり9.53グラム）（; 2...

筋原プログラムは、いずれの種において試験し、最も簡単にin vitro系を介して研究することができる。確かに、分離の際に、哺乳動物の魚やmyosatellite細胞（MSC）での筋原性前駆細胞（MPCは）容易に増殖、細胞周期の撤退、および端末筋芽細胞の分化と発生期の筋管にそれらの筋芽細胞の融合を含むこの高度に制御されたプロセスに入る。 （ゼブラフィッシュ67とニジマス69</...

哺乳動物の筋形成のかなりの理解がC2C12 5、両方の初代マウス（ ハツカネズミ ）筋芽細胞培養物と十分に記載されたマウス由来の細胞系において、このプロセスの要約を介して得られている。 1950 6年以降、これらの培養物をmurinemyogenicプログラムの理解に多くの進歩につながったと、ひいては、他の脊椎動物における筋形成している。さらに、単一細胞線維外植技術は、衛星細胞と周囲の筋線維7-9間の相互作用の理解を増加している。細胞培養はされて筋形成の調査のために特に魅力的なため、短時間に前駆体から分化した細胞10、RNAiのためのトランスフェクションが比較的容易にin vivoでの移植18〜20、さらにはCOMPに続く11月14日 、トランスジェニック15,16および過剰発現の研究14,17,18、in vitroで拡大分類群21,22の両端筋原性前駆細胞およびそれらの調節剤のアリソン。培養系の人工的な環境に起因する差異が5,23を説明してきたが、これらのin vitro系が多核体の形成を支配する複雑なプログラムの我々の切開に不可欠であることが証明された、最終分化myofibersfromはmyosatelliteとして知られている増殖性前駆細胞を単核哺乳類の中で細胞（MSC）。 哺乳綱の外では、しかし、筋形成を制御するメカニズムの保全、および/ ​​または発散はあまり大きく起因様々な分類群から筋原性前駆細胞（MPCは）と筋芽細胞を培養することが困難であるため、理解されている。確かに、一次筋芽細胞培養は、唯一の3鳥24〜26、1爬虫類27、いくつかの両生類28〜30、およびいくつかの魚1,3,4,31-33に記載されている。 VEのからの連続筋原細胞株げっ歯類34-36以外rtebratesは、日本ウズラ（Cortunixジャポニカ ）に由来している唯一の非哺乳類筋原細胞株と、QM7 37さらに稀である。不死で多くの試みにもかかわらず、硬骨魚筋原細胞株は、とらえどころのないまま、これらの細胞の効率的なトランスフェクションのためのプロトコルでのみ、今年15出版された。このように、脊椎動物の様々な一次のMPCと筋芽細胞を培養するための明確かつ十分に最適化されたプロトコルは、非常に多く、さらに筋原性プログラムの進化の我々の知識を拡大するだけでなく、ブレークスルーを作るために比較生理学の力を利用するために必要とされるヒト骨格筋疾患および障害の治療。 文学は、MPC /筋芽細胞の分離38-49の多くのレポートが含まれていますが、それは著者が簡単な、しばしば不完全で、フォーマットのようなアイソレーションのためのプロトコルを記述するのが一般的である。さらに、最も有益なプロトコルレポRTEDマウス50-53のために開発されており、これらのいくつかは、これらのプロトコルが使用不能または筋肉生物によって利用される非実用奥非げっ歯類種作り、抗体選択54,55または蛍光トランスジーン56,57に依存している。魚類、両生類、および爬虫類の筋形成についてはほとんど知られて、詳細かつ徹底したプロトコルは、視聴覚ガイダンスと遠縁種で実証効率で説明し、フィールドに最も参考になる。 まず1989年58パウエルらによって記載され、以下のプロトコルを最初に（つまり、ニジマス、 ニジマスサケ 、および大西洋サケ、 サルモ·サラル ）サケ科魚類および一部の大きなコイ科（ すなわち金魚、Carassiusauratusauratus）からのMPCおよび筋芽細胞を分離するために開発されました。 2000年には、FauconneauとPaboeufはニジマス59、およびminoroptimizationsミリアンペアのための一次筋芽細胞文化を最適化Danioninaeクレード （ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュ 、そして巨大なゼブラ、Devario aequipinnatus）はゼブラフィッシュの仕事のために利用できる多くの遺伝的なツールへの32、したがって、その近親者のいくつかの小さなミノーでの利用可能なそのプロトコルデ。硬骨魚は、（少なくともほとんどの種で）その発散成長戦略への研究のための魅力的な生物である。大規模なサケは、ほとんどの魚のように、さらに古い時代60〜62で、満期時に漸近線によってとらわれない成長の可能性と、不定成長する。このような巨大なゼブラ63と硬骨魚の典型的な髭ゼブラ表示の成長ポテンシャルとしてゼブラフィッシュとは異なり、大danionins、MPC細胞運命選択は肥大に対する骨格筋過形成の役割を果たしているかどうかを理解するための理想的なプラットフォームの直接の並置を作る。 同様に、我々は、比較的高い細胞収率およびviabで、このプロトコルは、マウスおよびアホロートルで使用できることを実証したility指数。このようなメキシコアホロートル（Ambystomamexicanum）などの有尾サンショウウオは、全体の手足や尾64-66を含む組織を再生させる驚くべき能力を持っている。この特性は、骨格筋萎縮や老化のこれらの両生類興味深いモデルになります。このような研究のためのより広い比較コンテキストを提供する、多くの魚種で行われているように、以下に記載されるプロトコルを使用して、類似のアプローチを行うことができる。多くの真の比較生物学者は理解ようにデータ（ここでは、全体の脊椎動物系統）広いスペクトル内で分析される場合、基礎生物学および翻訳生物医学における最も意味のある進歩を行うことができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Detailed Reagent Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:205px;">Reagent</td>
			<td style="width:217px;">Company (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:161px;">Quantity per Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">&#947;-irradiated poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td>
			<td>P5899 (ICN19454405)</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td>
			<td>MT-50-003-PB (D7777)</td>
			<td>2 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Laminin</td>
			<td>BD Biosciences (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>CB-40232 (L2020)</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP328-500 (S5761)</td>
			<td>1.51 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">HEPES (C8H18N2O4S)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP310-1 (H6147)</td>
			<td>9.53 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SV3007901 (A5955)</td>
			<td>17-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BW17-519Z (G1397)</td>
			<td>2-3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Donor Equine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007403 (H1270)</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007103 (F2442)</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Collagenase (Type IV)</td>
			<td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>LS004189 (C9891)</td>
			<td>0.44 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Trypsin (from Pancreas)</td>
			<td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>ICN15357125 (T5266)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Consumables, Tools and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Consumable</td>
			<td style="width:204px;">Tools</td>
			<td style="width:199px;">Equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;">Cell Culture Plates</td>
			<td>Forceps (Coarse)</td>
			<td>Serological Pipettor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Sterile 50 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:204px;">Forceps (Fine)</td>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Laboratory Tape</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Handles</td>
			<td>Chilling Incubator (Echotherm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">0.2 &#956;m Vacuum Sterilization Systems</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Blades (#10, #11)</td>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Water-repellant Autoclave Paper</td>
			<td style="width:204px;">Surgical Scissors</td>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Serological Pipettes</td>
			<td>Glass Petri Dishes</td>
			<td>Microosmolality Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;"></td>
			<td>12-16 G Cannulas with Luer Locks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:167px;">Plate Size</td>
			<td style="width:192px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:132px;">Poly-L-lysine*</td>
			<td style="width:145px;">Laminin**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.6 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>0.16</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">*0.1 mg/mL concentration</td>
			<td colspan="2">** 0.020 mg/mL concentration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:155px;">Isolation</td>
			<td style="width:127px;">Wash</td>
			<td style="width:127px;">Dissociation</td>
			<td>Complete</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">Base Medium</td>
			<td>419.25 mL</td>
			<td>395.40 mL</td>
			<td>297.00 mL</td>
			<td>178.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PSF*</td>
			<td>5.00 mL</td>
			<td>4.00 mL</td>
			<td>3.00 mL</td>
			<td>2.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Gentamicin Sulfate**</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>0.60 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Donor Equine Serum</td>
			<td>75.00 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Fetal Bovine Serum***</td>
			<td style="width:155px;">-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="19" style="height:19px;width:660px;">* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:75px;">Plate Size</td>
			<td style="width:103px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:145px;">Dilution</td>
			<td style="width:111px;">Plating Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>250 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>150 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>50-100 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 6. Average number of cells per g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Average # cells/g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio rerio</td>
			<td colspan="2">6,400,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Danio dangila</td>
			<td colspan="2">1,783,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Devario aequipinnatus</td>
			<td colspan="2">1,797,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Oncorhynchus mykiss</td>
			<td colspan="2">66,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 7. Recommended Incubation Temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio/ Devario spp.</td>
			<td colspan="2">26 - 28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Oncorhynchus/Salmo spp.</td>
			<td colspan="2">10* - 18 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Ambystoma mexicanum</td>
			<td colspan="2">18&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">* Lower temperatures support lower proliferation rates.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages

により生体内での筋原性プログラムを研究に関わる固有の難しさと時間に、骨格筋の常駐成体幹細胞由来の初代培養系では、筋原性前駆細胞（MPCは）、哺乳動物の骨格筋の発達の理解に不可欠な証明されています成長。特に脊椎動物の基底分類群のうち、しかしながら、データは自己再生、増殖、および分化のMPCを制御する分子機構を説明限られている。特に興味深いのは、付属肢の損失（ すなわち有尾両生類）以下のかなりのpostlarvalの骨格筋線維の過形成（ すなわち硬骨魚）とフル再生を受ける基礎脊椎動物の能力の基礎となる潜在的なメカニズムがあります。さらに、培養された筋芽細胞の使用は、再生と筋原性プログラムの要約と、それらの間の違いの理解を助けることができます。へこのため、我々は詳細に堅牢で効率的なプロトコルを記述（および変形文献）より始まる、筋原性プログラムの進化を理解するためのプラットフォームとして、細胞培養で、MPCはおよびその子孫、筋芽細胞と未熟筋管を分離し、維持するための基礎脊椎動物。ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）のモデル生物の状況を活かし、我々は、コイ科クレードDanioninaeの小さな魚に、このプロトコルの適用について報告する。タンデムに、このプロトコルは、メキシコアホロートル（Ambystomamexicanum）、さらに実験用げっ歯類からのMPCを単離することにより、より広い比較アプローチを実現するために利用することができる。このプロトコルは、現在広くニジマス、サケ、鯛1-4を含むいくつかの魚種で筋形成を研究で使用されています。

二十四時間播種後、筋原前駆細胞（MPCは）ラミニン基層に見える接続する必要があります（ 図1aおよび1Dを参照してください）。播種後、細胞（MPCは）この細胞型を示す紡錘状形状（ 図1）を採用し、MYOD1 +（ 図2）である。 ゼブラの種では、MPCはサケやサルモ種からのMPCが何よりも小さいバイポーラプロセスとのよりコン...

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Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

体外培養系では 、脊椎動物の筋形成の理解に不可欠であることが分かっている。しかし、多くの、特に基底の分類群において、非哺乳動物の骨格筋の発達と成長について学んだことを残る。この組織を、筋原性前駆細胞（MPCは）の成体幹細胞を単離すること、及び初代培養の設定におけるそれらの自己再生、増殖、および分化を維持するための効率的かつ堅牢なプロトコルは、全体にわたって保存された発散の調節機構の同定を可能脊椎動物の系統。

基礎脊椎動物の系統からの一次筋原前駆細胞/筋芽細胞培養液の調製

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Research

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Biology

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