Name: preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages
Uploaded: 2014-04-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages at JoVE.com

저자는 Drs에 많은 감사를하고 싶습니다. 작은 물고기와 양서류이 문화 프로토콜의 개발과 응용 프로그램에서 자신의 전문 지식에 대한 호셉 Planas와 후안 카스티요. 덕분에, 때문에 끊임없이 마태, Delci 크리스텐슨, 재커리 파울러, 브룩 프란 젠, 나단 프뢰 리히, 키라 마샬 충전 등 많은 물고기 (종 및 숫자 모두)에서 근육 조직의 박리와 해리에 지원 한 수많은 개인도 있습니다 벤 마이어, 이단 Remily 및 Sinibaldo 로메로. 이 작품은 생물 창업 자금 버밍엄학과, 프로테아제 연구 NIH 그랜트 # 2P20 RR015566, NIH NIAMS 그랜트 # R03AR055350 센터에서 알라바마 대학의 지원 및 PRB에 NDSU 사전 FORWARD NSF 그랜트 # HRD-0811239했다. 지원도 UAB 영양 비만 연구 센터 수상 # 1 P30DK056336, NIH NIDDK에 의해 제공되었다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 그 필요는 없습니다NIH의 공식 견해를 나타냅니다.

윤리 문 : 여기에 설명 척추 동물을 포함한 모든 실험은 버밍햄에 위치한 앨라배마 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회의 사전 승인 및 실험 동물 복지, 미국 국립 보건 연구소의 사무실에 의해 설립 된 가이드 라인과 일치했다 보건 복지부. 문화 1. 준비 <ol><li> (2 L 당 26.96 g 13.48 g / L) 9 mM의 탄산 수소 나트륨 (2 L 당 1.51 g), DMEM에서 20 mM의 HEPES (2 L 당 9.53 g)을 ?...

근육 조직이 프로그램은, 어느 검사 종, 가장 쉽게 체외 시스템을 통해 공부하실 수 있습니다. 사실, 격리에, 근원 성 전구 세포 (MPC를) 생선이나 포유류의 myosatellite 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 쉽게 증식, 세포주기 취소 될 수 있으며, 근육 아세포의 단말 차별화 및 초기 myotubes에 그 근원 세포의 융합을 포함하는이 규제가 심한 과정을 입력합니다. (제브라 피쉬 (67) 및 무지개 송어 <s...

포유 동물의 근육 생성의 상당한 이해 C2C12 5, 모두 기본 마우스 (뮤스 musculus)의 근 모세포 문화와 잘 설명 마우스 유래 세포주에이 과정의 반복 설을 통해 얻을 수있다. 1950 년대 6 년부터이 문화가 다른 척추 동물의 확장, 근육 생성에 의해, murinemyogenic 프로그램의 이해에 많은 발전을 주도하고있다. 또한, 하나의 세포 근섬유 이식편 기술은 위성 세포와 주변 근섬유 7-9 사이의 상호 작용에 대한 이해를 증가하고있다. 세포 배양은 근육 생성의 조사에 특히 인해 짧은 시간에 전구체로부터 분화 된 세포 10, RNAi를위한 형질의 상대적 용이성 11 ~ 14, 15, 16 및 과발현 형질 전환 연구 14,17,18, 체외에서 생체 이식 18 ~ 20 다음에 확장, 심지어 샘플분류군 (21, 22)에서, 근원 전구 세포와 그 통제 요원의 Arison는. 때문에 문화 시스템의 인공 환경에 차이가 5,23을 설명 하였지만, 이러한 생체 시스템은 다핵의 형성을 지배하는 복잡한 프로그램을 우리의 해부에 필수적인적일 수있다, 말기 차별화 된 myofibersfrom는 myosatellite로 알려진 증식 전구 세포를 mononucleated 포유 동물 사이 세포 (중간 엽 줄기 세포). 클래스 포유의 이상으로, 그러나, 근육 생성을 제어하는 메커니즘의 보존 및 / 또는 분기 저조한 인해 크게 다양한 생물 군에서 근육 조직 전구 세포 (MPC를) 및 근육 아세포를 배양의 어려움으로 이해된다. 사실, 기본 근원 세포 배양은 3 새 24 ~ 26, 하나의 파충류 (27), 몇 양서류 28-30, 일부 물고기 1,3,4,31-33에 설명되어있다. 했습니다에서 연속 근육 조직 세포 라인설치류 34-36 이외의 rtebrates 일본 메추라기 (Cortunix 자포니카)에서 파생되는 유일한 비 포유 동물의 근육 조직 세포 라인, QM7 37 더욱 드물다. 불멸화에서 많은 시도에도 불구하고, 경골, 근원 세포 라인은 애매 남아 이러한 세포의 효율적인 형질 전환을위한 프로토콜은 올해 15 출판되었다. 따라서, 척추 동물의 다양한 기본하여 MPC와 근육 아세포를 배양하기위한 명확하고 잘 최적화 된 프로토콜은 매우 더 근육 조직 프로그램의 진화에 대한 우리의 지식을 확장 할뿐만 아니라에서 돌파구를 만들기 위해 비교 생리학의 힘을 사용하는 데 필요한 인간 골격근 질환 및 장애의 치료. 문학은 MPC / 근원 세포 분리 38-49의 많은 보고서가 포함되어 있지만, 그것은 저자는 간단한 종종 불완전, 형식 등의 절연 부에 대한 프로토콜을 설명하는 일반적입니다. 또한, 대부분의 교훈 프로토콜 REPOrted 쥐 50-53를 위해 개발되었으며, 이들 중 일부는 이러한 프로토콜을 사용할 수 없게하거나 근육의 생물 학자에 의해 이용 허무 가장 깊은 비 설치류하고, 항체의 선택 (54, 55) 또는 형광 형질 전환 유전자 56, 57에 의존하고 있습니다. 시청각지도와 함께와 관계가 먼 종에서 입증 효율성을 설명 셨나요, 양서류 및 파충류 근육 생성, 상세하고 철저한 프로토콜에 대해 거의 알려진으로, 현장에 가장 도움이 될 것입니다. 1989 58 파월과 동료에 의해 ​​설명, 다음과 같은 프로토콜은 처음에 (즉, 무지개 송어, mykiss 앙 코링, 대서양 연어, 살모 살라) 연어과 물고기와 몇 가지 큰 cyprinids (즉, 금붕어, Carassiusauratusauratus)에서 MPC를하고 근육 아세포를 분리하기 위해 개발되었다 . 2000 년 Fauconneau 및 Paboeuf 무지개 송어 (59)에 대한 기본 근원 세포 배양을 최적화하고, minoroptimizations 엄마Danioninae의 clade의 (제브라 피쉬, 다니오의 rerio, 거대한 다니오, Devario aequipinnatus)으로 인해 제브라 피쉬의 작업에 사용할 수있는 다양한 유전 적 도구 (32)와, 따라서 그것의 가까운 친척의 여러 개의 작은 미노의 utilizable 해당 프로토콜 데. 경골 어류로 인해 (적어도 대부분의 종에서) 자신의 분기 성장 전략 연구를위한 매력적인 생물이다. 큰 연어류, 대부분의 물고기처럼, 심지어 나이 60 ~ 62 년 만기에 점근선으로 자유롭게 성장 잠재력 indeterminately 성장. 제브라 피쉬는 달리, 같은 거대한 다니오 (63)와 경골 어류의 일반적인 moustached 다니오 디스플레이 성장 잠재력, 자신의 직접 병렬 MPC 세포 운명의 선택이 비대 대 골격 근육 세포의 증식에 중요한 역할을 담당하고 있는지 이해를위한 이상적인 플랫폼으로 큰 danionins. 마찬가지로, 우리는 상대적으로 높은 세포 수율과 viab으로,이 프로토콜은 마우스와 axolotls와 함께 사용할 수 있다는 것을 증명하고있다ility 지수. 이러한 멕시코 Axolotl의 (Ambystomamexicanum) 등 Urodele 도롱뇽은 전체 사지와 꼬리 64-66 등의 조직을 재생하는 놀라운 능력을 가지고있다. 이 특성은 골격 근육 낭비하고 노화의 이러한 양서류 흥미로운 모델을 만든다. 이러한 연구에도 넓은 비교 컨텍스트를 제공 많은 어종에서 수행 한 바와 같이 아래에 설명 된 프로토콜을 사용하여, 유사한 방식이 수행 될 수있다. 많은 진정으로 비교 생물학 데이터 (여기에서, 전체 척추 동물의 혈통) 넓은 스펙트럼 내에서 분석 할 때 기초 생물학 및 번역 상 생물 의학에서 가장 의미있는 발전 할 수있다, 감사합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Detailed Reagent Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:205px;">Reagent</td>
			<td style="width:217px;">Company (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:161px;">Quantity per Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">&#947;-irradiated poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td>
			<td>P5899 (ICN19454405)</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td>
			<td>MT-50-003-PB (D7777)</td>
			<td>2 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Laminin</td>
			<td>BD Biosciences (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>CB-40232 (L2020)</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP328-500 (S5761)</td>
			<td>1.51 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">HEPES (C8H18N2O4S)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP310-1 (H6147)</td>
			<td>9.53 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SV3007901 (A5955)</td>
			<td>17-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BW17-519Z (G1397)</td>
			<td>2-3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Donor Equine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007403 (H1270)</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007103 (F2442)</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Collagenase (Type IV)</td>
			<td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>LS004189 (C9891)</td>
			<td>0.44 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Trypsin (from Pancreas)</td>
			<td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>ICN15357125 (T5266)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Consumables, Tools and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Consumable</td>
			<td style="width:204px;">Tools</td>
			<td style="width:199px;">Equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;">Cell Culture Plates</td>
			<td>Forceps (Coarse)</td>
			<td>Serological Pipettor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Sterile 50 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:204px;">Forceps (Fine)</td>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Laboratory Tape</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Handles</td>
			<td>Chilling Incubator (Echotherm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">0.2 &#956;m Vacuum Sterilization Systems</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Blades (#10, #11)</td>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Water-repellant Autoclave Paper</td>
			<td style="width:204px;">Surgical Scissors</td>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Serological Pipettes</td>
			<td>Glass Petri Dishes</td>
			<td>Microosmolality Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;"></td>
			<td>12-16 G Cannulas with Luer Locks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:167px;">Plate Size</td>
			<td style="width:192px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:132px;">Poly-L-lysine*</td>
			<td style="width:145px;">Laminin**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.6 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>0.16</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">*0.1 mg/mL concentration</td>
			<td colspan="2">** 0.020 mg/mL concentration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:155px;">Isolation</td>
			<td style="width:127px;">Wash</td>
			<td style="width:127px;">Dissociation</td>
			<td>Complete</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">Base Medium</td>
			<td>419.25 mL</td>
			<td>395.40 mL</td>
			<td>297.00 mL</td>
			<td>178.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PSF*</td>
			<td>5.00 mL</td>
			<td>4.00 mL</td>
			<td>3.00 mL</td>
			<td>2.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Gentamicin Sulfate**</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>0.60 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Donor Equine Serum</td>
			<td>75.00 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Fetal Bovine Serum***</td>
			<td style="width:155px;">-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="19" style="height:19px;width:660px;">* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:75px;">Plate Size</td>
			<td style="width:103px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:145px;">Dilution</td>
			<td style="width:111px;">Plating Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>250 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>150 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>50-100 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 6. Average number of cells per g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Average # cells/g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio rerio</td>
			<td colspan="2">6,400,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Danio dangila</td>
			<td colspan="2">1,783,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Devario aequipinnatus</td>
			<td colspan="2">1,797,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Oncorhynchus mykiss</td>
			<td colspan="2">66,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 7. Recommended Incubation Temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio/ Devario spp.</td>
			<td colspan="2">26 - 28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Oncorhynchus/Salmo spp.</td>
			<td colspan="2">10* - 18 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Ambystoma mexicanum</td>
			<td colspan="2">18&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">* Lower temperatures support lower proliferation rates.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages

때문에 생체 내에서 근육 조직 프로그램을 공부와 관련된 고유의 어려움과 시간, 골격 근육의 주민 성체 줄기 세포에서 파생 된 주 문화 시스템은 근육 조직 전구 세포 (MPC를)은 포유 동물의 골격 근육 발달에 대한 우리의 이해에 필수적인 입증했다 성장. 특히 척추 동물의 기초 분류군 사이에서, 그러나, 데이터는 자기 갱신, 확산 및 MPC와의 분화를 조절하는 분자 메커니즘을 설명하는 제한됩니다. 특히 관심을 부속 기관 손실 (즉, urodele 양서류) 다음과 같은 상당한 치하의 골격 근섬유 세포의 증식 (즉, 경골 어류) 및 완전 재생을 받아야하는 기초 척추 동물의 능력을 기초 잠재적 인 메커니즘이다. 또한, 배양 된 근육 아세포의 사용은 재생 및 근육 조직 프로그램 재현부와 그들 사이의 차이의 이해를 도울 수있다. 에이 말은, 우리는 세부 사항에 강력하고 효율적인 프로토콜을 설명 (및 유사 안에) 더 많은 시작, 근육 조직 프로그램의 진화를 이해하기위한 플랫폼으로 세포 배양에서, MPC는 그들의 자손, 근원 세포와 미성숙 myotubes을 분리하고 유지 기초 척추 동물. 제브라 피쉬 (다니오 rerio)의 모델 생물의 상태를 대문자로, 우리는 잉어 clade의 Danioninae의 작은 물고기에이 프로토콜의 응용 프로그램에보고합니다. 탠덤,이 프로토콜은 멕시코 Axolotl의 (Ambystomamexicanum)에서도 실험실 설치류에서 MPC를 분리하여 넓은 비교 방법을 실현하는데 사용된다. 이 프로토콜은 현재 널리 무지개 송어, 연어, 도미 1-4 등 여러 물고기 종에 근육 생성을 연구하는 데 사용됩니다.

주야 후 파종, 근육 조직 전구 세포 (MPC를)는 (그림 1A와 1D 참조) 라미닌의 기질에 부착 볼 수 있어야합니다. 파종 후, 세포 (MPC를)이 세포 유형을 나타내는 스핀들 형상 (그림 1)를 채택하고 MyoD1 + (그림 2)이다. 다니오 종에서 MPC는이 앙 코링 및 살모 종 MPC를하는 것보다 작은 바이폴라 프로세스와보다 컴팩트 한 것으로 나타납니다. 그러나, ?...

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Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

체외 배양 시스템은 척추 근육 생성에 대한 우리의 이해에 필수적인 입증했다. 그러나, 많은, 특히 기초 분류군, nonmammalian 골격 근육 발달과 성장에 대해 배웠 겠죠. 이 조직, 근육 조직 전구 세포 (MPC를)의 성체 줄기 세포를 분리하고, 차 문화 속에서 자신의 자기 갱신, 증식 및 분화를 유지하기위한 효율적이고 강력한 프로토콜에 걸쳐 보존 및 분기 규제 메커니즘의 식별 가능 척추 동물의 계통.

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