Name: preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages
Uploaded: 2014-04-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages at JoVE.com

Los autores quisieran expresar muchas gracias a los Dres. Josep Planas y Juan Castillo por su experiencia profesional en el desarrollo y aplicación de este protocolo de cultivo de pequeños peces y anfibios. Se agradece también a las innumerables personas que han colaborado incansablemente con la disección y la disociación del tejido muscular de muchos peces (tanto en las especies y número), entre ellos Mateo carga, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily y Sinibaldo Romero. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Alabama en el Departamento de Biología fondos iniciales Birmingham, Centro para la Investigación de la proteasa NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 y NDSU Avance ADELANTE NSF Grant # HRD-0811239 al PRB. El apoyo también fue proporcionado por el Centro de Investigación de la UAB Nutrición Obesidad premio # P30DK056336, NIH NIDDK. Sus contenidos son de exclusiva responsabilidad de sus autores y no necesariamenterepresentar los puntos de vista oficiales de la NIH.

Declaración de Ética: Todo experimentación con animales vertebrados se describen en el presente documento fue aprobado previamente por el Comité de la Universidad de Alabama en Birmingham Institucional Cuidado de Animales y el uso y está en consonancia con las directrices establecidas por la Oficina de Laboratorio Animal Welfare, Institutos Nacionales de Salud de los EE.UU. Departamento de Salud y Servicios Humanos. 1. Preparación para la Cultura <ol><li> Preparar el medio d...

El programa miogénica, en el que las especies examinadas, se puede estudiar más fácilmente a través de un sistema in vitro. De hecho, después del aislamiento, las células precursoras miogénicas (PSM) en el pescado o células myosatellite (MSC) en mamíferos entran fácilmente este proceso altamente regulado que implica la proliferación, la retirada del ciclo celular, y la diferenciación terminal de los mioblastos y la fusión de los mioblastos en miotubos nacientes. La falta general de cepas transgéni...

Entendimiento considerable de miogénesis mamíferos se ha obtenido a través de la recapitulación de este proceso en los dos cultivos de mioblastos de ratón primario (Mus musculus) y la línea celular derivada de ratón bien descrito, C2C12 5. A partir de la década de 1950 6, estas culturas han dado lugar a mucho progreso en la comprensión del programa murinemyogenic y, por extensión, la miogénesis en otros vertebrados. Además, una sola célula de las técnicas de miofibras de explantes han aumentado a cabo comprensión de las interacciones entre las células satélite y miofibras que rodean 7-9. Los cultivos celulares son particularmente atractivos para las investigaciones de la miogénesis debido al corto tiempo de precursor de célula diferenciada 10, relativa facilidad de la transfección para ARNi 11-14, transgénico 15,16 y sobreexpresión estudios 14,17,18, la expansión in vitro seguida de trasplante in vivo 18-20, e incluso un borradorarison de células precursoras miogénicas y sus agentes reguladores de todo taxa 21,22. Mientras que las diferencias debido a la ambiente artificial del sistema de cultivo han sido descritos 5,23, estos sistemas in vitro han demostrado ser indispensable para nuestra disección del programa intrincada que rige la formación de multinucleadas, myofibersfrom diferenciación terminal mononucleadas células progenitoras proliferativas conocidas como myosatellite células (MSC) entre los mamíferos. Fuera de la clase de los mamíferos, sin embargo, la conservación y / o divergencia de los mecanismos que controlan la miogénesis, son poco conocidos, en gran parte debido a la dificultad en el cultivo de células precursoras miogénicas (PSM) y mioblastos de varios taxones. De hecho, cultivos de mioblastos primarios sólo se han descrito en tres aves 24-26, un reptil 27, un par de anfibios 28-30, y algunos peces 1,3,4,31-33. Continuas líneas de células miogénicas de VErtebrates distintas de roedores 34-36 son aún más raros, con la única línea que no sean mamíferos miogénica de células que se deriva de la codorniz japonesa (Cortunix japonica), QM7 37. A pesar de muchos intentos de inmortalización, una línea celular miogénica teleósteos sigue siendo difícil de alcanzar y un protocolo para la transfección eficiente de estas células sólo se publicó este año 15. Por lo tanto, los protocolos claros y bien optimizados para el cultivo de los PSM primarias y mioblastos a partir de una variedad de vertebrados son muy necesarias, no sólo para ampliar aún más nuestro conocimiento de la evolución del programa miogénico, pero para emplear el poder de la fisiología comparada a hacer avances en el tratamiento de enfermedades del músculo esquelético y trastornos humanos. Mientras que la literatura contiene muchos informes de aislamiento MPC / mioblastos 38-49, es común que los autores describen los protocolos para estos aislamientos en breves, a menudo incompletos, formatos. Además, los protocolos más instructivas reportorted se han desarrollado para los ratones 50-53, y algunos de ellos dependen de la selección de anticuerpos 54,55 o 56,57 transgenes de fluorescencia, por lo que estos protocolos inutilizable o especie no roedora más íntimos poco prácticos utilizados por los biólogos musculares. Con poco conocido sobre piscine, anfibios y reptiles miogénesis, un protocolo detallado y minucioso, que se describe con la guía audiovisual y con una eficacia demostrada en especies alejadas, sería más útil para el campo. Descrita por primera vez por Powell y sus colegas en 1989 58, el siguiente protocolo fue desarrollado inicialmente para aislar PSM y mioblastos de salmónidos (a saber, la trucha arco iris, Oncorhynchus mykiss, y el salmón del Atlántico, Salmo salar) y algunos ciprínidos grandes (es decir, peces de colores, Carassiusauratusauratus) . En 2000, Fauconneau y Paboeuf optimizan una cultura de mioblastos primarios para la trucha arco iris 59 y minoroptimizations made ese protocolo utilizable en varios pececillos pequeños del clado Danioninae (pez cebra, Danio rerio, y danio gigante, Devario aequipinnatus) 32 debido a las muchas herramientas genéticas disponibles para el trabajo de pez cebra y por lo tanto sus familiares cercanos. Peces teleósteos son organismos atractivos para el estudio debido a su estrategia de crecimiento divergente (al menos en la mayoría de las especies). Las grandes salmónidos, como la mayoría de los peces, crecen indeterminadamente, con potencial de crecimiento sin restricciones de una asíntota en la madurez, incluso en edad 60-62 años. A diferencia de pez cebra, grandes danionins como el danio gigante 63 y potenciales de crecimiento display danio bigotudos típicas de los peces teleósteos, por lo que su yuxtaposición directa en una plataforma ideal para la comprensión de si la elección del destino celular MPC juega un papel en la hiperplasia del músculo esquelético en comparación con la hipertrofia. Asimismo, hemos demostrado que este protocolo se puede utilizar con ratones y ajolotes, con rendimiento relativamente alto de células y VIABíndices LIDAD. Salamandras urodele, como el ajolote mexicano (Ambystomamexicanum), poseen la notable capacidad de regenerar los tejidos, incluyendo las extremidades y la cola 64-66 enteras. Esta característica hace que estos anfibios interesantes modelos de pérdida de músculo esquelético y el envejecimiento. Utilizando el protocolo descrito a continuación, un enfoque similar puede llevarse a cabo como se ha hecho en muchas especies de peces, proporcionando un contexto comparativo aún más amplia para tales estudios. Como muchos biólogos verdaderamente aprecian comparativos, los avances más significativos en la biología básica y la biomedicina traslacional se pueden hacer cuando se analizan los datos dentro del más amplio espectro (en este caso, todo el linaje de vertebrados).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Detailed Reagent Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:205px;">Reagent</td>
			<td style="width:217px;">Company (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:161px;">Quantity per Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">&#947;-irradiated poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td>
			<td>P5899 (ICN19454405)</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td>
			<td>MT-50-003-PB (D7777)</td>
			<td>2 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Laminin</td>
			<td>BD Biosciences (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>CB-40232 (L2020)</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP328-500 (S5761)</td>
			<td>1.51 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">HEPES (C8H18N2O4S)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP310-1 (H6147)</td>
			<td>9.53 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SV3007901 (A5955)</td>
			<td>17-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BW17-519Z (G1397)</td>
			<td>2-3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Donor Equine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007403 (H1270)</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007103 (F2442)</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Collagenase (Type IV)</td>
			<td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>LS004189 (C9891)</td>
			<td>0.44 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Trypsin (from Pancreas)</td>
			<td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>ICN15357125 (T5266)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Consumables, Tools and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Consumable</td>
			<td style="width:204px;">Tools</td>
			<td style="width:199px;">Equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;">Cell Culture Plates</td>
			<td>Forceps (Coarse)</td>
			<td>Serological Pipettor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Sterile 50 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:204px;">Forceps (Fine)</td>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Laboratory Tape</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Handles</td>
			<td>Chilling Incubator (Echotherm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">0.2 &#956;m Vacuum Sterilization Systems</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Blades (#10, #11)</td>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Water-repellant Autoclave Paper</td>
			<td style="width:204px;">Surgical Scissors</td>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Serological Pipettes</td>
			<td>Glass Petri Dishes</td>
			<td>Microosmolality Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;"></td>
			<td>12-16 G Cannulas with Luer Locks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:167px;">Plate Size</td>
			<td style="width:192px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:132px;">Poly-L-lysine*</td>
			<td style="width:145px;">Laminin**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.6 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>0.16</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">*0.1 mg/mL concentration</td>
			<td colspan="2">** 0.020 mg/mL concentration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:155px;">Isolation</td>
			<td style="width:127px;">Wash</td>
			<td style="width:127px;">Dissociation</td>
			<td>Complete</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">Base Medium</td>
			<td>419.25 mL</td>
			<td>395.40 mL</td>
			<td>297.00 mL</td>
			<td>178.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PSF*</td>
			<td>5.00 mL</td>
			<td>4.00 mL</td>
			<td>3.00 mL</td>
			<td>2.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Gentamicin Sulfate**</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>0.60 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Donor Equine Serum</td>
			<td>75.00 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Fetal Bovine Serum***</td>
			<td style="width:155px;">-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="19" style="height:19px;width:660px;">* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:75px;">Plate Size</td>
			<td style="width:103px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:145px;">Dilution</td>
			<td style="width:111px;">Plating Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>250 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>150 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>50-100 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 6. Average number of cells per g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Average # cells/g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio rerio</td>
			<td colspan="2">6,400,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Danio dangila</td>
			<td colspan="2">1,783,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Devario aequipinnatus</td>
			<td colspan="2">1,797,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Oncorhynchus mykiss</td>
			<td colspan="2">66,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 7. Recommended Incubation Temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio/ Devario spp.</td>
			<td colspan="2">26 - 28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Oncorhynchus/Salmo spp.</td>
			<td colspan="2">10* - 18 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Ambystoma mexicanum</td>
			<td colspan="2">18&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">* Lower temperatures support lower proliferation rates.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages

Debido a la dificultad y el tiempo inherente implicado con estudiar el programa miogénico in vivo, los sistemas de cultivo primarios derivados de las células madre adultas residentes de músculo esquelético, las células precursoras miogénicas (PSM), han demostrado ser indispensable para nuestra comprensión del desarrollo del músculo esquelético de mamíferos y crecimiento. Particularmente entre los taxones basal de vertebrados, sin embargo, los datos son limitados describir los mecanismos moleculares que controlan la auto-renovación, la proliferación y diferenciación de los PSM. De particular interés son los posibles mecanismos que subyacen a la capacidad de los vertebrados basales a someterse considerable postlarvas miofibra hiperplasia esquelético (es decir, peces teleósteos) y la regeneración completa tras la pérdida apéndice (es decir urodelos anfibios). Además, el uso de mioblastos cultivados podría ayudar en la comprensión de la regeneración y la recapitulación del programa miogénico y las diferencias entre ellos. Aello, se describe en detalle un protocolo robusto y eficiente (y sus variaciones) para aislar y mantener PSM y su progenie, mioblastos y miotubos inmaduros, en cultivo celular como una plataforma para la comprensión de la evolución del programa miogénico, comenzando por el más vertebrados basales. Aprovechando la situación organismo modelo del pez cebra (Danio rerio), informe sobre la aplicación de este protocolo para pequeños peces del clado ciprínidos Danioninae. A la par, este protocolo puede utilizarse para realizar un enfoque comparativo más amplio mediante el aislamiento de los PSM del ajolote mexicano (Ambystomamexicanum) e incluso roedores de laboratorio. Este protocolo se utiliza ampliamente en el estudio de la miogénesis en varias especies de peces, como la trucha arco iris, el salmón, el besugo y 1-4.

Veinticuatro horas después de la siembra, las células precursoras miogénicas (PSM) deben ser visibles adjunto al sustrato de laminina (véanse las figuras 1a y 1d). Después de la siembra, las células (PSM) adoptan una forma de tipo huso, indicativo de este tipo de células (Figura 1) y son MyoD1 + (Figura 2). En las especies Danio, PSM parecen ser más compacto con procesos bipolares más pequeños que hacen PSM de especie Oncorhynchus...

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Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

El cultivo in vitro sistemas han demostrado ser indispensables para nuestra comprensión de la miogénesis de vertebrados. Sin embargo, queda mucho por aprender sobre el desarrollo del músculo esquelético no mamífero y el crecimiento, en particular en los taxones basal. Un protocolo eficiente y robusto para el aislamiento de las células madre adultas de este tejido, las células precursoras miogénicas (PSM), y el mantenimiento de su auto-renovación, la proliferación y la diferenciación en un entorno de cultivo primario permite la identificación de los mecanismos de regulación conservados y divergentes a lo largo los linajes de vertebrados.

Preparación de Primaria Myogenic precursor de célula / cultivos de mioblastos de basales Vertebrados Linajes

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