Name: mouse hindbrain ex vivo culture to study facial branchiomotor neuron migration
Uploaded: 2014-03-18T15:45:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration at JoVE.com

MT understøttes af en ph.d. studentship [ref. 092839/Z/10/Z] og CR af en ny Investigator Award [ref. 095623/Z/11/Z] fra Wellcome Trust.

1.. Valgfrit: Forbered Affi-gel Heparin Beads (gel perler) til FBM seværdighed Assay BEMÆRK: Forbered gelperler mindst 1 dag før start eksplantatet procedure. <ol><li> Vask 100 pi gel heparin perleopslæmning med sterilt PBS i 20 min på en rulle ved stuetemperatur (RT). </li><li> Pellet perler i en bordcentrifuge i 5 minutter ved 13.000 x g. Tilføj steril PBS og gentag vaskeproceduren 4x. </li><li> Efter den sidste vask fjernes PBS og suge perler i et lille volumen af ​​en steril opløsning, der indeholder det rekombinante protein af valg, idet man dække perlerne med opløsningen. Denne protokol bruger 100 ng / ul rekombinant human VEGF165 i PBS til at gengive et tidligere udgivet eksperiment 16. </li><li> Inkubér gel heparin perler med det rekombinante protein løsning i mindst 12 timer og højst 1 uge på en rulle ved 4 ° C. </li></ol> 2. Overfladebehandling af Kultur Inserts Baghjernen eksplantater dyrkes på Corning kultur indsatser med en 8 um porestørrelse eller tilsvarende skær. Kultur indsatse kan genanvendes efter afslutningen af ​​protokollen, forudsat at de er vasket med destilleret vand, steriliseret med ethanol og opbevaret i 70% ethanol indtil brug. BEMÆRK: De følgende trin skal udføres i et stinkskab under sterile betingelser. <ol><li> Forbered eksplantat dyrkningsmedier bestående af Neurobasal medium suppleret med B27 (20 ul / ml), glucose (6 mg / ml) og penicillin / streptomycin (5 ug / ul). </li><li> Vask kultur indsatser med sterilt PBS i 5 minutter og tørre i 5-10 minutter under stinkskab. </li><li> Placer den ene kultur indsatsen i hvert enkelt brønd i en 12well plade. Bemærk: indsatse kan have brug for et lille skub til at passe stramt i brønden. </li><li> Dæk kultur skær med 10-20 mg / ml muselaminin i Neurobasal medium og placere dem i en vævsdyrkningsinkubator (37 ° C, 5% CO <sub&gt; 2) i 1 time. Bemærk: Coating bør udføres på dagen for eksplanteres. </li></ol> 3. Dissektion af Hindbrains fra E11.5 musefostre <ol><li> Frasortering timet gravid hunmus med en etisk godkendt procedure på embryonale dag (E) 11.5 og placere livmoderen indeholder embryoner i en 100 mm plast skål med iskoldt L15 medium. BEMÆRK: Alle dissektion trin skal udføres i iskoldt L15. </li><li> Ved hjælp af et dissektionsmikroskop og Dumont urmager pincetter nummer 5, rive livmoderens muskel væggen for at afsløre de embryoner, slipper hvert foster, klippe navlestrengen, og fjern forsigtigt blommesækken. </li><li> Ved hjælp af en plastik Pasteur pipette med en bred-boring åbning, overføre hver embryo i en ren plast skål med iskoldt L15. </li><li> Brug Dumont pincet, halshugge fosteret lige over forbenene. Hvis forsøget kræver genotypebestemmelse af embryonerne, indsamle vævsprøver til genomisk DNA isolation (fx en lille piece af blommesækken eller halespids 16,20). </li><li> Dreje hovedet dorsale side op og identificere 4. ventrikel, der er dækket af et tyndt vævslag (figur 2B). Gennembore forsigtigt roofplate og begynder at flå det væk caudally langs midterlinien over bageste baghjerne og rygmarven, og rostrally over midthjernen. Baghjerne bør nu blive eksponeret for (figur 2C). </li><li> Drille forsigtigt væk de resterende hoved mesenkymet og eventuelle meninges, der er knyttet til den pial side af baghjerne (Figur 2D). </li><li> Fjern midthjernen og rygmarven væv, så baghjerne unfurls og kan ligge fladt i en åben bog forberedelse (Figur 2E). </li><li> Ved hjælp af en bred-boring plast Pasteur pipette hver dissekeret baghjerne til en 12-brønds plade indeholdende iskold L15 og gemme dem på is, indtil alle hindbrains er blevet dissekeret. </li><li> Ved hjælp af en bred-boring plast Pasteur pipette en syndgle baghjerne til en tom skål, holde det en åben bog forberedelse, ventrikulær opad i en dråbe omtrentlig 100 ul L15. </li><li> Overfør nogle mikroliter af de rugede gel heparin perler til samme dråbe. Bemærk: Da størrelsen af ​​perlerne er variable, er det tilrådeligt at overføre omkring 10 perler og derefter vælge en optimal størrelse for transplantation i baghjerne. </li><li> Lav en lille revne i baghjerne væv og indsæt forsigtigt 1-3 gelperler i baghjerne væv ved niveauet for r5 / 6, omkring halvvejs mellem midterlinjen og sidekant baghjerne, sænke dem ind i vævet, således at perle er placeret lige under baghjerne overflade. BEMÆRK: dissektion procedure kan tage mellem 5-20 min / baghjerne, afhængig af erfaring, og kan strække sig over en længere periode, hvis kuld er store, og i alle tilfælde bør hindbrains være i kultur ikke længere end 3 timer post mortem for god resultater. </li></ol> 4.. BaghjerneEksplantat Kultur <ol><li> Tag pladen indeholder kultur indsatser fra inkubatoren, opsug laminin belægning løsning. </li><li> Placer en kultur indsatsen i en separat kultur fad fyldt med iskold L15 og ved hjælp af en bred boring plast Pasteur pipette hver baghjernen ventrale side op på kulturen insertet (figur 2G). Baghjerne skal ligge helt fladt på indsatsen membran. </li><li> Løft forsigtigt kultur indsatsen fra fadet og dup det flere gange på rene silkepapir for at fjerne overskydende væske. Denne proces sikrer, at baghjerne klæber til kulturen indsats i en flad, åben bog forberedelse. Hvis baghjerne krøller op, kan dens væv uopretteligt vokse sammen. </li><li> Fyld den oprindelige 12-brønds plade med 500 ul forvarmet dyrkningsmedier og placere indsatsen tilbage i dette godt. Justér forsigtigt lydstyrken med en anden 400-600 ul af medier til blot dække baghjerne, der sikrer, at baghjerne ikke flyderfra membranen. Hvis det flyder tilbage til trin 4.4 og gentag indtil baghjerne forbliver fastgjort til membranen. </li><li> På dette tidspunkt er det muligt at tilføje biologiske inhibitorer af interesse for medierne til at studere deres effekt på migration af FBM neuroner. BEMÆRK: Hvis implantere perler eller administrere andre behandlinger, anbefales det at opretholde mindst 2 kontrolpunkter eksplanteret under normale vækstbetingelser pr eksperiment for at sikre, at forsøget er blevet oprettet med succes. </li><li> Inkuber eksplantater for 24-30 timer i en vævskulturinkubator (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 5.. Whole-mount immunfluorescensfarvning af baghjernen Eksplantater <ol><li> Aspirer mediet fra hver brønd, skylles i PBS og fikseredes i 2 timer ved 4 ° C med forsigtig omrøring i iskold 4% formaldehyd (frisk fremstillet eller frisk optøet 4% paraformaldehyd opløst i PBS). Bemærk: Du må ikke forsøge at fjerne baghjerne fra kulturen indsatsen før fikseringer færdig. </li><li> Skyl 3 gange med PBS. Træk forsigtigt de hindbrains fra kulturen indlæg med Dumont pincet. Nogle explanter er vanskelige at skalle af, men kan normalt løftes ved at anvende blide tryk gennem gentagne gange udstøde PBS fra en pipette. </li><li> Overfør hindbrains til 2,0 ml rundbundet rør til immunfluorescens mærkning. Permeabilisere hindbrains i 30 minutter ved stuetemperatur (RT) i PBS indeholdende 0,1% Triton X-100 (PBT) med forsigtig rulning. </li><li> Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i PBT indeholdende 10% varmeinaktiveret normalt gedeserum med forsigtig rulning. </li><li> Inkuber eksplantater med forsigtig rullende ved 4 ° C i 5 dage med primær antistof specifikt for ISL1, fortyndet 1:100 i PBT indeholdende 1% varmeinaktiveret normalt gedeserum. </li><li> Vask eksplantaterne ved RT 4x med PBT i 15 minutter hver. </li><li> Inkuber eksplantater med forsigtig rulning ved stuetemperatur i 3 timer med fluorofor-konjugeret gede-anti-muse-antistof (f.eks Alexa Fluor 488 ged antimus, fortyndet 1:200) i PBT indeholdende 1% varmeinaktiveret normalt gedeserum. </li><li> Vask eksplantaterne 4x ved RT med PBT i 15 minutter hver med blide rullende. </li><li> Efterudfastsætte eksplantaterne i 4% formaldehyd i 30 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Dæk en glasplade med 3 lag sort elektrisk tape og punktafgifter med en skalpel en lille firkant af den lagdelte tape til at skabe en lomme til eksplantaterne, alternativt bruge en depression objektglas. </li><li> Monter hver baghjernen i SlowFade reagens i en lomme og dække med et dækglas, omhyggeligt undgår at fange luftbobler og billede ved hjælp af en laser scanning konfokal mikroskop. BEMÆRK: Som et alternativ til immunfarvning, kan in situ hybridisering med riboprober der genkender FBMS (dvs. Isl1 eller Phox2b) bruges til at visualisere FBM neuroner 16,21. </li></ol> Resumé af trin og timing Timet parring at opnå E11.25 graviditeter: ~ 14 dage Valgfrit: Bead forberedelse (protocol 1): ~ 2 timer, dagen før embryo isolation Forbered kultur skær og medier (Protokol 2): ​​~ 30 min, før embryo isolation Embryo isolation og baghjerne dissektion (trin 3,1-3,4): ~ 10 min / foster Baghjerne dissektion (trin 3,5-3,7): ~ 5-10 min / baghjerne Eksplantation procedure (trin 3,8-3,9): ~ 5-10 min / baghjerne Valgfrit: perle implantation (trin 3,10-3,11): ~ 5-10 min / baghjerne Eksplantation kultur (trin 4.7): 24 timer Fiksering for antistof-farvning (trin 5.1): 2 timer Farvningsproceduren og billedbehandling (Protokol 5): 5 Dage

<ol>
	<li>Lumsden, A., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+patterns+of+neuronal+development+in+the+chick+hindbrain.">Segmental patterns of neuronal development in the chick hindbrain.</a> Nature. 337 (6206), 424-428 (1989).</li><li>Chandrasekhar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+heads:+development+of+vertebrate+branchiomotor+neurons.">Turning heads: development of vertebrate branchiomotor neurons.</a> Dev. Dyn. 229 (1), 143-161 (2004).</li><li>Mapp, O. M., Wanner, S. J., Rohrschneider, M. R., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle1b+mediates+interpretation+of+migratory+cues+during+zebrafish+facial+branchiomotor+neuron+migration.">Prickle1b mediates interpretation of migratory cues during zebrafish facial branchiomotor neuron migration.</a> Dev. Dyn. 239 (6), 1596-1608 (2010).</li><li>Glasco, D. M., Sittaramane, V., Biol, D. e. v. .., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse Wnt/PCP protein Vangl2 is necessary for migration of facial branchiomotor neurons, and functions independently of Dishevelled. 369 (2), 211-222 (2012).</li><li>Marillat, V., Sabatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Slit+Receptor+Rig-1/Robo3+Controls+Midline+Crossing+by+Hindbrain+Precerebellar+Neurons+and+Axons.">The Slit Receptor Rig-1/Robo3 Controls Midline Crossing by Hindbrain Precerebellar Neurons and Axons.</a> Neuron. 43 (1), 69-79 (2004).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Vivancos, V., Chen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activity+guides+facial+branchiomotor+neuron+migration+and+involves+the+PCP+pathway+and+JNK+and+ROCK+kinases.">Wnt activity guides facial branchiomotor neuron migration and involves the PCP pathway and JNK and ROCK kinases.</a> Neural Dev. 4, 7 (2009).</li><li>Guan, K. -. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues.">Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 941-956 (2003).</li><li>Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+axon+guidance+of+cranial+motor+neurons.">Patterning and axon guidance of cranial motor neurons.</a> Nat. Rev. 8 (11), 859-871 (2007).</li><li>Garel, S., Garcia-Dominguez, M., Charnay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+migratory+pathway+of+facial+branchiomotor+neurones.">Control of the migratory pathway of facial branchiomotor neurones.</a> Development. 127 (24), 5297-5307 (2000).</li><li>Gavalas, A., Ruhrberg, C., Livet, J., Henderson, C. E., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+defects+in+the+hindbrain+of+Hoxa1,+Hoxb1+and+Hoxb2+mutants+reflect+regulatory+interactions+among+these+Hox+genes.">Neuronal defects in the hindbrain of Hoxa1, Hoxb1 and Hoxb2 mutants reflect regulatory interactions among these Hox genes.</a> Development. 130 (23), 5663-5679 (2003).</li><li>Grant, P. K., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroepithelial+basement+membrane+serves+as+a+boundary+and+a+substrate+for+neuron+migration+in+the+zebrafish+hindbrain.">The neuroepithelial basement membrane serves as a boundary and a substrate for neuron migration in the zebrafish hindbrain.</a> Neural Dev. 5, 9 (2010).</li><li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+compartition+in+the+early+avian+hindbrain.">Segmentation and compartition in the early avian hindbrain.</a> Mech. Dev. 121 (9), 1081-1088 (2004).</li><li>Tsuchida, T., Ensini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79 (6), 957-970 (1994).</li><li>Qu, Y., Glasco, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+cadherins+Celsr1-3+differentially+regulate+migration+of+facial+branchiomotor+neurons+in+mice.">Atypical cadherins Celsr1-3 differentially regulate migration of facial branchiomotor neurons in mice.</a> J. Neurosci. 30 (28), 9392-9401 (2010).</li><li>Schwarz, Q., Gu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+controls+neuronal+migration+and+cooperates+with+Sema3A+to+pattern+distinct+compartments+of+the+facial+nerve.">Vascular endothelial growth factor controls neuronal migration and cooperates with Sema3A to pattern distinct compartments of the facial nerve.</a> Genes Dev. 18 (22), 2822-2834 (2004).</li><li>Stockinger, P., Ma&#238;tre, J. -. L., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+neuroepithelial+cell+cohesion+affects+tangential+branchiomotor+neuron+migration+in+the+zebrafish+neural+tube.">Defective neuroepithelial cell cohesion affects tangential branchiomotor neuron migration in the zebrafish neural tube.</a> Development. 138 (21), 4673-4683 (2011).</li><li>Wanner, S. J., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+tracts+guide+zebrafish+facial+branchiomotor+neuron+migration+through+the+hindbrain.">Axon tracts guide zebrafish facial branchiomotor neuron migration through the hindbrain.</a> Development. , (2013).</li><li>Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cranial+motor+neurons+in+live+transgenic+zebrafish+expressing+green+fluorescent+protein+under+the+control+of+the+islet-1+promoter/enhancer.">Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer.</a> Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).</li><li>Laird, P. W., Zijderveld, A., Linders, K., Rudnicki, M. A., Jaenisch, R., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+mammalian+DNA+isolation+procedure.">Simplified mammalian DNA isolation procedure.</a> Nucleic Acids Res. 19 (15), 4293 (1991).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1 (1), 4 (2001).</li><li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants:+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development.">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J. Vis. Exp. (74), (2013).</li><li>Holland, P. J., George, A. M., Worrell, L. T. C., Landsberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electroporation+of+the+lower+rhombic+lip+of+midgestation+mouse+embryos.">In vitro electroporation of the lower rhombic lip of midgestation mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (66), (2012).</li></ol>

Ingen af ​​forfatterne har konkurrerende interesser eller interessekonflikter.

Denne protokol beskriver whole-mount kultur E11.5 mus hindbrains i et transwell system til at studere migration af FBM neuroner. Protokollen giver mus baghjernen motoriske neuroner skal holdes i live og migrerer i en periode på 24 timer, så ex vivo manipulation. Denne metode har mange eksperimentelle fordele for efterforskerne søger at identificere de molekylære og cellulære mekanismer i neuronal migration. Mens de traditionelle migration assays eksplanterer små neurale væv stykker i matrix på kultur retter og muliggøre observation af individuelle neuroner, som de reagerer på udefrakommende stimuli, en stor fordel ved transwell analysen er dens egnethed til at manipulere migrerer neuroner inden værten orgel miljø og derfor en mere fysiologisk kontekst. Vigtigt er det, kan stofferne let anvendes på de ex vivo baghjernen explanter at teste deres virkning på neuronal migration, omgå mulige bivirkninger forbundet med administering af disse stoffer til en gravid mus. Endelig ex vivo model giver også mulighed for afprøvning af stoffer, der ikke krydser placentabarrieren, såsom funktions-blokerende antistoffer. På grund af disse fordele, ex vivo baghjerne kultur tilvejebringer en alternativ og supplerende metode til at bruge zebrafisk embryoner, som kan behandles med vandopløselige små molekyler i akvariet vand eller i utero elektroporation af embryonale hjerne, som kræver brug af specialiserede udstyr og er sværere at mestre end kulturen her beskrevne teknik. En anden fordel ved protokollen beskrevet her er dens modtagelighed for implantering perler gennemvædet i rekombinant protein eller andre reagenser, således at tillade anvendelse af en standard embryologiske metode udviklet til at manipulere kyllingefostre til en musemodel af neuronal migration. Navnlig kan ex vivo-kultur-modellen anvendes til hindbrains gensplejsede mus defekttive i specifikke molekyler impliceret i neuronal migration, såsom vækst eller vejledning faktor-receptorer, og kombineret med perle implantater at teste, om lydhørhed over for ligander er tabt. Ud over farmakologisk manipulation, kan ex vivo-kultur protokol også tilpasses til at elektroporere ekspressionsvektorer, som kan manipulere ekspressionen af gener af interesse, egnede metoder til elektroporation er tidligere blevet beskrevet 22,23. Denne protokol kan også tilpasses til at visualisere neuron migration ved time-lapse mikroskopi i baghjernen explanter fra transgene mus indeholdende fluorescensmærkede FBM neuroner, fx Isl1-Cre; Rosa26Yfp 21. Endelig kan protokollen også anvendes til at studere andre typer migrerende neuroner i baghjerne, såsom dem, der danner ringere oliven, selv om dette ville kræve anvendelse af hindbrains på ældre fosterstadiet og kan kræve kultur i op til 48 timer, afhængigt af neuronal levedygtighed <em&gt; Ex vivo. Kritiske trin og fejlfinding For succes i denne protokol, er det afgørende, at embryonerne opsamles tidligt på dagen E11.5 tættere på E11.25, da FBM neuron migration er lige begyndt. Imidlertid er det ikke altid muligt at fange fostrene udviklingsstadiet grund af naturlig parring variabilitet af mus, og derfor kan der være en vis variation i omfang af FBM vandring mellem forskellige eksperimenter. Variabilitet i FBM migration kan også observeres, hvis eksperimentet ikke er afsluttet inden for den tidsramme tildelt, omkring 3 timer, som det kan ses i figur 3E. Baghjerne væv fra E11.25 musefostre er delikat. Ved dissekering og hele eksplantatet procedure, er det vigtigt ikke at rive baghjerne væv i områderne fra R4-R6, hvor FBM neuroner er placeret. På grund af den følsomme karakter af dissfdeling proces, og fordi den hastighed, hvormed hindbrains placeres i kulturen påvirker resultatet, kan proceduren tage et par praksis løber til mester, især før der bruges dyrebare prøver eller reagenser. Endelig er det vigtigt, at baghjerne væv anbringes i en åben bog konfiguration på kulturen indsatsen, da foldning af baghjerne væv under kultur vil forhindre normal FBM migration (se figur 3F).

Embryonale neuroner er født i den ventrikulære zone af hjernen, men efterfølgende migrere til nye destinationer for at nå passende målområder, der er placeret på en stor afstand. Den korrekte placering af nervecellelegemer på passende steder langs de dorso-ventrale og anterior-posterior akser i hjernens udvikling er afgørende for den korrekte ledningsføring, overlevelse og funktion af disse neuroner efter vandrende etape 1-4. Svarende til de molekylære mekanismer, der styrer Axon vejledning 5-7, er kombinatoriske sæt af attraktive og frastødende stikord menes at vejlede migrerer neuroner 1,8. Men på grund af vekselvirkninger af flere celletyper, de signaler, der styrer neuronal migration er blevet mindre grundigt undersøgt end dem, der er involveret i Axon vejledning, som kan studeres celle selvstændigt. Den udvikling baghjerne hvirveldyr er blevet anvendt i flere nylige undersøgelser for at forstå de molekylære og cellulære mekanismerneuronal migration, for eksempel i chick, mus og zebrafisk 1-4,9. Dette orgel indeholder flere forskellige typer af neuroner, herunder flere undertyper af precerebellar og motoriske neuroner 5,7,10,11. Baghjerne motorneuron er født i den ventrikulære zone tæt på gulvpladen, og de ​​differentierer til bestemte delmængder efter deres rhombomere oprindelsesland 1,12. Ansigtets branchiomotor (FBM) neuroner er genereret på rhombomere (R) 4 i baghjerne og udvide deres axoner dorsalt gennem en R4 udgangssted ind i den anden brankiebue innerverer ansigtets muskler 2,9,13. FBM neuroner i zebrafisk og mus giver gode modeller til at studere de molekylære og cellulære mekanismer neuronal migration i en proces, der let kan visualiseres, eftersom disse neuroner reproducerbart translokere deres somata i en spatiotemporally veldefineret proces. Hos mus FBM neuroner først migrere caudally gennem R5 og derefter både caudally og ventralt for at nå deres endelige holdning til pial side af baghjerne i det område af R6, hvor de danner de parrede kerner af det syvende kranienerver (VIIn) 10,11,14. I zebrafisk, FBM neuroner oprindeligt migrere ventralt og derefter ændre retning på r4-R5 grænsen til fortsat at migrere mod pial overflade i en laminin-afhængig måde 4,12,15,16. Denne migrering forløber over en periode på flere dage i udvikling, og kan opdeles i faser af tangential og radial migration, som muliggør identifikation af molekyler, der medierer disse to adskilte processer. I modsætning hertil FBM neuroner i den embryoniske kylling baghjerne forbliver i R4 3,13,17-19. Under deres migration, kan identificeres FBM neuroner, ligesom andre typer eller motoriske neuroner gennem deres udtryk for homoeodomain transkriptionsfaktoren holm 1 (ISL1) 14.. Således, engemount immunfluorescensfarvning eller in situ hybridisering for denne markør på forskellige udviklingsstadier afslører særskilte vandrende strøm af FBM somata strækker sig fra R4 til R6 i zebrafisk eller mus 4,15,16. Desuden har fluorescerende transgene reportere såsom ISL1-GFP blevet brugt som egnede værktøjer til at visualisere migrere FBM neuroner i zebrafisk 3,17-19. Ud over deres egnethed til billeddannelse, har mange forskere studeret migration af FBM neuroner i udviklingen zebrafisk, fordi deres fritlevende embryoner kan manipuleres nemt med celletransplantation teknikker og farmakologiske forbindelser anvendes direkte til akvarievandet. I modsætning hertil udvikler museembryo indesluttet i livmoderen, udelukker implantation af kugler, der bærer vejlednings stikord eller administration af funktions-blokerende antistoffer, der ikke krydser placenta. Endvidere kan farmakologiske forbindelser administreres til gravide mor har unønskede bivirkninger, som indirekte kan hæmme embryogenese. Omgå denne begrænsning, har vi udviklet en ex vivo kultur metode til hele mus baghjerne der er kompatibel med FBM neuron migration og overlevelse for 24 timer efter eksplanteres 7,16. Denne metode gør det nemt farmakologisk manipulation, implantation af kugler, der bærer vejlednings stikord eller administration af funktions-blokerende antistoffer og kan også tilpasses til at studere migration af andre neuronale undertyper i baghjerne på forskellige udviklingsstadier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="575">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">211-2120</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Cell culture plates, 12 well</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150628</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Plastic cell culture dish, 100 mm</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150288</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:104px;">3477</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:111px;">Dumont</td>
			<td style="width:104px;">91150-20</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P4417</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Laminin mouse protein</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">23017-015</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Primary antibody, Isl1</td>
			<td style="width:111px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:104px;">39.4D5</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">A11029</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21103</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">B27 supplement (50x)&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">17504-044</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Leibovitz&#8217;s L-15</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21083-027</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Penicillin/ streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15070</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Glucose</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">101174Y</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">G9023</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">T8787</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Slowfade Antifade Kit</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">S-2828</td>
			<td style="width:147px;">Alternative mounting solutions may be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0912</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Cover glass</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Affi-Gel Heparin Beads</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td style="width:104px;">153-6173</td>
			<td style="width:147px;">Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:215px;">Recombinant human VEGF165</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:104px;">293-VE</td>
			<td style="width:147px;">Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse hindbrain ex vivo culture to study facial branchiomotor neuron migration

Embryonale neuroner er født i den ventrikulære zone af hjernen, men efterfølgende migrere til nye destinationer for at nå passende mål. Decifrere de molekylære signaler, der beredvilligt vejlede neuronal migration i embryonale hjerne er derfor vigtigt at forstå, hvordan de komplekse neurale netværk danner der senere støtter postnatal liv. Facial branchiomotor (FBM) neuroner i museembryo baghjerne migrere fra rhombomere (R) 4 caudally at danne de parrede facial kerner i R6-afledte region baghjerne. Her giver vi en detaljeret protokol for whole-mount ex vivo kultur museembryo hindbrains egnede til at undersøge de signalveje, der regulerer FBM migration. I denne fremgangsmåde er hindbrains af E11.5 musefostre dissekeret og dyrket i en åben præparat bog på cellekultur indsatse til 24 timer. I løbet af denne tid, FBM neuroner migrere caudally mod R6 og kan blive udsat for funktions-blokerende antistoffer og små molecules i kultur medier eller heparin perler læsset med rekombinante proteiner til at undersøge roller for signalveje impliceret i vejledende neuronal migration.

Dette afsnit viser eksempler på resultater, der kan opnås ved at studere FBM neuron migration i mus baghjerne gennem ex vivo kultur. Vi viser, at de FBM neuroner i eksplanterede hindbrains fra dag 11 museembryoer først gennemgå en tangential migration (figur 3A) og derefter begynde at samle ansigtet motor kerner (figur 3B), svarende til deres adfærd i livmoderen (se figur 1). Vi viser yderligere, at implantation af en VEGF165-gennemblødt perle tiltrækker FBM neuroner (figur 3C og 3D), som tidligere vist 16. Vigtigere er det, denne protokol tillader studere FBM migration i fravær af blodkar eller skib-afledte faktorer, der kan påvirke FBM migration i livmoderen, fordi nonperfused vaskulaturen degenererer i kultur 16. Således uspecifik blodlegemer mærkning overholdes, når du bruger ISL1 museantistof på friskisolerede mus hindbrains (figur 1) ikke længere er til stede i baghjerne væv efter 24 timer i kultur (figur 3A-F). Endelig viser vi to eksempler på hindbrains, der ikke blev eksplanterede korrekt og derfor indeholder FBM neuroner i en unormal fordeling, enten fordi baghjerne ikke var eksplanteret hurtigt nok efter embryo isolation (figur 3E), eller fordi baghjerne væv foldet op i transwell ( Figur 3F). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1.jpg" /> Figur 1. FBM neuron migration Konfokal z-stak af vildtype mus hindbrains efter ISL1 whole-mount immunolabeling og flatmounting;.. Baghjerne midterlinjen er angivet med en stjerne i alle paneler (A) Ventrikulær overflade af en E11.5 baghjerne i<html> område, der indeholder ISL1-positive FBM neuroner (pil), viser deres tangential migration fra R4 til R6. stilling R4, R5 og R6 er angivet (A &#39;) pial overflade af den ene halvdel af den samme baghjerne i området indeholdende Anlage . en af de parrede FBM kerner (angivet med VIIn), samt andre ISL1-positive neuron populationer (B) Ventrikulær overflade af en E12.5 baghjerne indeholdende FBM neuroner, der vandrer tangentialt (pil); pilespidsen angiver et eksempel af et blodkar, der indeholder cirkulerende celler, der er uspecifikt mærket af krydsreaktion af anti-muse-sekundært antistof anvendes til at detektere ISL1 muse-IgG-antistof. (B &#39;) pial overflade af den ene halvdel af den samme E12.5 baghjerne, som indeholder en af ​​de parrede FBM kerner. Midterlinjen er angivet med en stjerne i hvert panel. Scale bar (alle paneler): 200 um. V, bug, P pial./ 51397fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik her for at se større billede. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2.jpg" /> Figur 2. E11.5 mus baghjerne dissektion og ex vivo kultur. (AE) Vigtige skridt i E11.5 baghjerne dissektion protokollen; skala bar:. 1 mm (A) Leder af fosteret efter at det blev skåret væk fra resten af embryoet på forelimb niveau (B) Den rostrale del af. Hovedet blev fjernet, og den resterende del af hovedet væv placeres således, at 4. ventrikel (pil) er orienteret opad. (C) Taget på 4. ventrikel blev skrællet væk, og baghjerne blev blotlagt ved skrælning vævet under baghjerne væk rostrally og caudally. (D) pial membran blev fjernet (bemærk, at i denne exrigelig nogle cervikal rygmarv (SC) væv har været knyttet til baghjerne). (E) Overskydende midthjernen (MB) og rygmarv (SC) væv er blevet fjernet for at fastholde netop baghjernen. (F) Kultur inserter blev overtrukket med laminin og anbragt i en 12 brønds vævskulturplade. (G) Hver baghjernen blev placeret på ét insert og dækket med medierne. (H) Skematisk fremstilling af den vej, ved at migrere FBM neuroner (blå) i løbet af 24 timer af kultur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3.jpg" /> Figur 3. Mus baghjerne ex vivo kultur. (A, B) En E11.5 baghjerne blev dyrket i 24 timer og immunofluoresc<html> ladende mærket ISL1 at illustrere FBM neuron vandring i et eksplantat, begge ventrikulær (A) og pial (B) sider af baghjerne er vist (C, D) E11.5 kuld hindbrains blev dyrket i nærvær af implanterede heparin perle gennemblødt. i PBS (C) eller VEGF165 (D), bemærk at FBM neuroner migreret hen imod og ind på VEGF165 perle, og vandrende strøm derfor udvides yderligere caudalt i forhold til den ubehandlede side af det samme baghjerne eller baghjerne indeholdende kontrol vulst (E. , F) Eksempler på utilfredsstillende E11.5 baghjernen explanter, hvor FBMS ikke har emigreret fra r4 (E), eller i hvilke baghjerne væv foldet under kultur (F). Midterlinjen er angivet med en stjerne i hvert panel. Skala bar (for alle paneler): 200 um. V, bug, P pial.&quot;&gt; Klik her for at se større billede.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration at JoVE.com

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonale neuroner er født i den ventrikulære zone af neuralrøret, men migrere til nå passende mål. Facial branchiomotor (FBM) neuroner er en nyttig model til at studere neuronal migration. Denne protokol beskriver whole-mount ex vivo kultur museembryo hindbrains at undersøge mekanismer, der regulerer FBM migration.

Mus baghjernen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur til Uddannelse Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live-Imaging af Single celledelinger i Mouse neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection gnaver neuroblasts til Studieinformationen neuroblast Migration<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetisk manipulation af Cerebellær granuleneuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; In Vivo</em&gt; At studere Neuronal morfologi og Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging af Postnatal cerebellare Granule Cell Migration Brug Konfokal makroskopi

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Low-Density Primær Hippocampal neuronkultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Musen baghjernen som en Model til at studere embryonale neurogenese

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

En alternativ metode til at studere primære begivenheder i Neurodegeneration ved hjælp af Ex Vivo rotte hjernen skiver

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

Facial Nerve Kirurgi i rat model til undersøgelse axonal hæmning og regenerering

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Ex vivo trykbærende Hippocampal kapillar-Parenchymal arteriole forberedelse til funktionel undersøgelse

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo Calcium Imaging af Mus Geniculate Ganglion Neuron Svar på Smag Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...