Name: mouse hindbrain ex vivo culture to study facial branchiomotor neuron migration
Uploaded: 2014-03-18T15:45:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration at JoVE.com

MT er støttet av et PhD student [ref. 092839/Z/10/Z] og CR av en ny Investigator Award [ref. 095623/Z/11/Z] fra Wellcome Trust.

En. Valgfritt: Forbered Affi-gel Heparin Perler (gelkuler) for FBM attraksjon analysen MERK: Forbered gelkuler minst en dag før du starter explant prosedyren. <ol><li> Vask 100 pl gel heparin perlesuspensjon med steril PBS i 20 minutter på en valse ved romtemperatur (RT). </li><li> Pellet perler i en bordsentrifuge for 5 min ved 13 000 x g. Legg sterile PBS og gjenta vaskeprosedyren 4x. </li><li> Etter den siste vask, fjerner PBS og suge kulene i et lite volum av en steril løsning inneholdende det rekombinante protein av valg, å ta vare for å dekke kulene med løsningen. Denne protokollen bruker 100 ng / mL rekombinant humant VEGF165 i PBS for å reprodusere en tidligere utgitt eksperiment 16. </li><li> Inkuber gel heparin perler med det rekombinante proteinløsning i minst 12 timer og maksimalt en uke på en valse ved 4 ° C. </li></ol> 2. Coating Kultur Inserts Hindbrain eksplantater dyrkes på Corning kultur setter inn med en 8 mikrometer porestørrelse, eller tilsvarende innsatser. Kultur innsatser kan brukes om igjen etter fullførelse av protokollen, forutsatt at de er vasket med destillert vann, sterilisert med etanol, og lagret i 70% etanol inntil nødvendig. MERK: Følgende trinn skal utføres i en flyt hette under sterile forhold. <ol><li> Forbered eksplantering dyrkningsmedium bestående av Neurobasal medium supplert med B27 (20 ul / ml), glukose (6 mg / ml) og penicillin / streptomycin (5 mg / mL). </li><li> Vask kultur innsatser med steril PBS i 5 minutter og tørre etter 5-10 min under strømningshette. </li><li> Plasser en kultur innsats i hver enkelt brønn av en 12well plate. Merk: inserts kan trenge en liten dytt for å passe godt inn i brønnen. </li><li> Dekk til kulturinnsatser med 10-20 mikrogram / ml mus laminin i Neurobasal medium og plassere dem i en vev kultur inkubator (37 ° C, 5% CO <sub&gt; 2) i 1 time. Merk: Belegg bør utføres på dagen for eksplantere. </li></ol> Tre. Disseksjon av Hindbrains fra E11.5 mus embryoer <ol><li> Cull timet gravid kvinne mus med en etisk godkjent prosedyre på embryonale dag (E) 11,5 og plassere livmoren inneholder embryoene i en 100 mm plast tallerken med iskald L15 medium. MERK: Alle disseksjon trinnene må utføres i iskald L15. </li><li> Ved hjelp av en dissekere mikroskop og Dumont urmaker tang nummer fem, rive livmor muskelen veggen for å eksponere embryoene, slipper hvert embryo, kutte navlestrengen, og fjern forsiktig plommesekken. </li><li> Ved hjelp av en plast Pasteur pipette med et bredt-boring åpning, overføre hvert embryo i en ren plast tallerken med iskald L15. </li><li> Bruke Dumont tang, halshogge embryoet like over forbein. Hvis eksperimentet krever genotyping av embryoene, samle vevsprøver for genomisk DNA isolering (f.eks en liten piece av plommesekken eller haletipp 16,20). </li><li> Snu hodet ryggsiden opp og identifisere de 4 th ventrikkel, som er dekket av et tynt vev lag (figur 2B). Pierce nøye roofplate og begynne å skrelle den bort caudally langs midtlinjen over den bakre hindbrain og ryggmargen, og rostrally over midthjernen. Hindbrain skal nå bli eksponert (fig. 2C). </li><li> Nøye erte bort de resterende hode mesenchyme og eventuelle hjernehinnene som er knyttet til den pial siden av hindbrain (figur 2D). </li><li> Fjern midthjernen og ryggmargen vev slik at hindbrain unfurls og kan ligge flatt i en åpen bok forberedelse (figur 2E). </li><li> Ved hjelp av en bred-boring plast Pasteur pipette, overføre hver dissekert hindbrain til en 12-brønns plate som inneholder iskald L15 og lagre dem på is inntil alle hindbrains har blitt dissekert. </li><li> Ved hjelp av en bred-boring plast Pasteur pipette, overføre en syndgle hindbrain til en tom tallerken, holder den en åpen bok forberedelse, ventrikkel siden opp i en dråpe med omtrentlig 100 mL L15. </li><li> Overfør noen få mikroliter av de inkuberte gel heparin perler til den samme dråpene. Merk: Fordi størrelsen på perler er variabel, er det tilrådelig å overføre rundt 10 perler og velg deretter en optimal størrelse for transplantasjon inn i hindbrain. </li><li> Lag et lite rift i hindbrain vev og forsiktig sette 1-3 gel-perler inn i hindbrain vev på nivået av r5 / 6, omtrent halvveis mellom midtlinjen og den laterale kant av hindbrain, senke dem inn i vevet, slik at vulsten er plassert like under hindbrain overflate. MERK: disseksjon prosedyren kan ta mellom 5-20 min / hindbrain, avhengig av erfaring, og kan strekke seg over en lengre periode hvis kull er store, i alle fall bør hindbrains være i kultur ikke lenger enn tre timers post-mortem for god resultater. </li></ol> 4. HindbrainEksplantering Culture <ol><li> Fjern platen inneholdende kulturinnsatser fra inkubatoren, suge laminin beleggoppløsningen. </li><li> Plasser en kultur sette inn i en egen kultur tallerken fylt med iskald L15 og, ved hjelp av et bredt-boring plast Pasteur pipette, overføre hver hindbrain ventral side opp på kulturinnsatsen (figur 2G). Hindbrain bør ligge helt flatt på innsatsen membran. </li><li> Løft forsiktig innsatsen kultur fra fatet og bearbeid det flere ganger på ren silkepapir for å fjerne overflødig væske. Denne prosessen sikrer at hindbrain fester seg til kulturinnsats i en flat, åpen bok forberedelse. Hvis hindbrain krøller seg, kan dens vev irreversibelt vokse sammen. </li><li> Fyll den opprinnelige 12-brønns plate med 500 mL forvarmet kultur media og plassere innsatsen tilbake i denne brønnen. Juster volumet forsiktig med en annen 400-600 mL av media å bare dekke hindbrain, slik at hindbrain ikke flyterav membranen. Hvis det flyter tilbake til trinn 4.4 og gjenta til hindbrain forblir festet til membranen. </li><li> På dette stadiet, er det mulig å legge til biologiske hemmere av interesse for media for å studere deres effekt på migrasjon av FBM nevroner. MERK: Hvis implantere perler eller administrere andre behandlinger, er det anbefalt å ha minst to kontroll eksplantater under normale vekstforhold per eksperiment for å sikre at forsøket har blitt satt opp med suksess. </li><li> Inkuber explants i 24-30 timer i en vevskultur-inkubator (37 ° C, 5% CO2). </li></ol> 5. Wholemount Immunofluorescent Farging av hindbrain explants <ol><li> Aspirer media fra hver brønn, skyll i PBS og fikse for to timer ved 4 ° C med forsiktig omrøring i iskaldt 4% formaldehyd (nylaget eller fersk tint 4% paraformaldehyde oppløst i PBS). Merk: Ikke prøv å fjerne hindbrain fra kulturinnsats før fikseringer fullført. </li><li> Skyll 3x med PBS. Nøye skrelle hindbrains fra kulturinnsatser ved hjelp Dumont tang. Noen eksplantater er vanskelig å skrelle av, men kan vanligvis løftes ved å bruke milde press gjennom gjentatte ganger å utvise PBS fra en pipette. </li><li> Overfør hindbrains til 2,0 ml rundbunnet rør for immunfluorescens merking. Permeabilize hindbrains i 30 minutter ved romtemperatur (RT) i PBS inneholdende 0,1% TritonX-100 (PBT) med forsiktig rulling. </li><li> Inkuber i 1 time ved RT i PBT inneholdende 10% varme-inaktivert normalt geiteserum med forsiktig rulling. </li><li> Inkuber explants med forsiktig rulling ved 4 ° C i 5 dager med primære antistoff som er spesifikt for ISL1, fortynnet 1:100 i PBT inneholdende 1% varme-inaktivert normalt geiteserum. </li><li> Vask explants ved RT 4x med PBT i 15 minutter hver. </li><li> Inkuber explants med forsiktig rulling ved RT i 3 timer med fluorofor-konjugert geite-anti-mus-antistoff (f.eks Alexa Fluor 488 geit antimus, fortynnet 1:200) i PBT inneholdende 1% varme-inaktivert normalt geiteserum. </li><li> Vask explants 4x på RT med PBT for 15 min hver med milde rullende. </li><li> Postfiks explants i 4% formaldehyd i 30 minutter ved RT. </li><li> Dekk en glass-slide med tre lag med svart elektrikertape og avgiftsdirektoratet med en skalpell en liten firkant av den lagdelte tape for å lage en lomme for explants, alternativt bruke en depresjon glass slide. </li><li> Monter hver hindbrain i SlowFade reagens i den ene lommen og dekk med et glass dekkglass, nøye unngå å felle luftbobler og bilde ved hjelp av en laserskanning konfokalmikroskop. MERK: Som et alternativ til farging, kan in situ hybridisering med riboprobes som gjenkjenner FBMS (dvs. Isl1 eller Phox2b) brukes til å visualisere FBM nevroner 16,21. </li></ol> Oppsummering av trinn og timing Tidsbestemt parring å skaffe E11.25 svangerskap: ~ 14 dager Valgfritt: Perle forberedelse (Protocol 1): ~ 2 timer, på dagen før embryoet isolering Forbered kultur inserts og media (Protokoll 2): ​​~ 30 min, før embryo isolasjon Embryo isolasjon og hindbrain disseksjon (trinn 03.01 til 03.04): ~ 10 min / embryo Hindbrain disseksjon (trinn 03.05 til 03.07): ~ 5-10 min / hindbrain Eksplantering prosedyre (trinn 03.08 til 03.09): ~ 5-10 min / hindbrain Valgfritt: perle implantasjon (trinn 3.10 til 3.11): ~ 5-10 min / hindbrain Eksplantering kultur (trinn 4,7): 24 timer Fiksering for antistoffarging (trinn 5.1): 2 timer Farging prosedyre og bildebehandling (Protokoll 5): 5 dager

<ol>
	<li>Lumsden, A., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+patterns+of+neuronal+development+in+the+chick+hindbrain.">Segmental patterns of neuronal development in the chick hindbrain.</a> Nature. 337 (6206), 424-428 (1989).</li><li>Chandrasekhar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+heads:+development+of+vertebrate+branchiomotor+neurons.">Turning heads: development of vertebrate branchiomotor neurons.</a> Dev. Dyn. 229 (1), 143-161 (2004).</li><li>Mapp, O. M., Wanner, S. J., Rohrschneider, M. R., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle1b+mediates+interpretation+of+migratory+cues+during+zebrafish+facial+branchiomotor+neuron+migration.">Prickle1b mediates interpretation of migratory cues during zebrafish facial branchiomotor neuron migration.</a> Dev. Dyn. 239 (6), 1596-1608 (2010).</li><li>Glasco, D. M., Sittaramane, V., Biol, D. e. v. .., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse Wnt/PCP protein Vangl2 is necessary for migration of facial branchiomotor neurons, and functions independently of Dishevelled. 369 (2), 211-222 (2012).</li><li>Marillat, V., Sabatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Slit+Receptor+Rig-1/Robo3+Controls+Midline+Crossing+by+Hindbrain+Precerebellar+Neurons+and+Axons.">The Slit Receptor Rig-1/Robo3 Controls Midline Crossing by Hindbrain Precerebellar Neurons and Axons.</a> Neuron. 43 (1), 69-79 (2004).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Vivancos, V., Chen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activity+guides+facial+branchiomotor+neuron+migration+and+involves+the+PCP+pathway+and+JNK+and+ROCK+kinases.">Wnt activity guides facial branchiomotor neuron migration and involves the PCP pathway and JNK and ROCK kinases.</a> Neural Dev. 4, 7 (2009).</li><li>Guan, K. -. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues.">Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 941-956 (2003).</li><li>Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+axon+guidance+of+cranial+motor+neurons.">Patterning and axon guidance of cranial motor neurons.</a> Nat. Rev. 8 (11), 859-871 (2007).</li><li>Garel, S., Garcia-Dominguez, M., Charnay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+migratory+pathway+of+facial+branchiomotor+neurones.">Control of the migratory pathway of facial branchiomotor neurones.</a> Development. 127 (24), 5297-5307 (2000).</li><li>Gavalas, A., Ruhrberg, C., Livet, J., Henderson, C. E., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+defects+in+the+hindbrain+of+Hoxa1,+Hoxb1+and+Hoxb2+mutants+reflect+regulatory+interactions+among+these+Hox+genes.">Neuronal defects in the hindbrain of Hoxa1, Hoxb1 and Hoxb2 mutants reflect regulatory interactions among these Hox genes.</a> Development. 130 (23), 5663-5679 (2003).</li><li>Grant, P. K., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroepithelial+basement+membrane+serves+as+a+boundary+and+a+substrate+for+neuron+migration+in+the+zebrafish+hindbrain.">The neuroepithelial basement membrane serves as a boundary and a substrate for neuron migration in the zebrafish hindbrain.</a> Neural Dev. 5, 9 (2010).</li><li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+compartition+in+the+early+avian+hindbrain.">Segmentation and compartition in the early avian hindbrain.</a> Mech. Dev. 121 (9), 1081-1088 (2004).</li><li>Tsuchida, T., Ensini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79 (6), 957-970 (1994).</li><li>Qu, Y., Glasco, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+cadherins+Celsr1-3+differentially+regulate+migration+of+facial+branchiomotor+neurons+in+mice.">Atypical cadherins Celsr1-3 differentially regulate migration of facial branchiomotor neurons in mice.</a> J. Neurosci. 30 (28), 9392-9401 (2010).</li><li>Schwarz, Q., Gu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+controls+neuronal+migration+and+cooperates+with+Sema3A+to+pattern+distinct+compartments+of+the+facial+nerve.">Vascular endothelial growth factor controls neuronal migration and cooperates with Sema3A to pattern distinct compartments of the facial nerve.</a> Genes Dev. 18 (22), 2822-2834 (2004).</li><li>Stockinger, P., Ma&#238;tre, J. -. L., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+neuroepithelial+cell+cohesion+affects+tangential+branchiomotor+neuron+migration+in+the+zebrafish+neural+tube.">Defective neuroepithelial cell cohesion affects tangential branchiomotor neuron migration in the zebrafish neural tube.</a> Development. 138 (21), 4673-4683 (2011).</li><li>Wanner, S. J., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+tracts+guide+zebrafish+facial+branchiomotor+neuron+migration+through+the+hindbrain.">Axon tracts guide zebrafish facial branchiomotor neuron migration through the hindbrain.</a> Development. , (2013).</li><li>Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cranial+motor+neurons+in+live+transgenic+zebrafish+expressing+green+fluorescent+protein+under+the+control+of+the+islet-1+promoter/enhancer.">Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer.</a> Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).</li><li>Laird, P. W., Zijderveld, A., Linders, K., Rudnicki, M. A., Jaenisch, R., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+mammalian+DNA+isolation+procedure.">Simplified mammalian DNA isolation procedure.</a> Nucleic Acids Res. 19 (15), 4293 (1991).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1 (1), 4 (2001).</li><li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants:+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development.">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J. Vis. Exp. (74), (2013).</li><li>Holland, P. J., George, A. M., Worrell, L. T. C., Landsberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electroporation+of+the+lower+rhombic+lip+of+midgestation+mouse+embryos.">In vitro electroporation of the lower rhombic lip of midgestation mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (66), (2012).</li></ol>

Ingen av forfatterne har konkurrerende interesser eller motstridende interesser.

Denne protokollen beskriver wholemount kultur E11.5 mus hindbrains i en Transwell system for å studere migrasjon av FBM nevroner. Denne protokollen tillater mus hindbrain motorneurons å holdes i live og migrerer i en periode på 24 timer, slik at ex vivo manipulering. Denne metoden har mange eksperimentelle fordeler for etterforskerne som søker å identifisere de molekylære og cellulære mekanismer for neuronal migrasjon. Mens tradisjonelle migrasjons analyser eksplanterer små nevrale vev brikker i matrise på kultur retter og muliggjøre observasjon av enkelte nerveceller som de reagerer på eksogene stimuli, er en stor fordel med den Transwell analysen sin egnethet til å manipulere trekkende nevroner i verten orgelmiljøet og dermed en mer fysiologisk sammenheng. Viktigere, kan stoffene være lett brukes på ex vivo hindbrain eksplantater å teste deres virkning på neuronal migrasjon, omgå mulige bivirkninger forbundet med administeringe disse stoffene til en gravid mus. Til slutt, den ex vivo modellen gjør også testing av stoffer som ikke krysser placenta, slik som funksjons-blokkerende antistoffer. På grunn av disse fordeler, gir den ex vivo hindbrain kultur en alternativ og komplementær fremgangsmåte til ved hjelp av sebrafisk embryoer, som kan behandles med vannoppløselige små molekyler i akvarievannet, eller in utero elektroporering av embryonale hjernen, noe som krever bruk av spesialisert maskiner og er mer vanskelig å mestre enn den dyrkningsteknikk som er beskrevet her. En annen fordel med den protokoll som er beskrevet her er dens amenability å implantere perler fuktet i rekombinant protein eller andre reagenser, derfor tillater bruk av en standard embryologisk metode som er utviklet for å manipulere kyllingembryo til en musemodell for nevronal migrasjon. Spesielt kan den ex vivo kulturmodell anvendes på hindbrains av genetisk modifiserte mus defektetive i spesifikke molekyler involvert i neuronal migrasjon, for eksempel vekst eller veiledning faktor reseptorer, og kombinert med perle implantater for å teste om respons til ligander er tapt. I tillegg til farmakologisk manipulasjon, kan den ex vivo kultur protokoll også tilpasses electroporate ekspresjonsvektorer som kan manipulere ekspresjon av gener som er av interesse, og passende metoder for elektroporering har tidligere blitt beskrevet 22,23. Denne protokollen kan også tilpasses til å visualisere nevron migrasjon av time-lapse mikros i hindbrain eksplantater fra transgene mus som inneholder fluorescensmerkede FBM nevroner, f.eks Isl1-Cre; Rosa26Yfp 21. Endelig kan denne protokoll også brukes til å studere andre typer av trekk nevroner i hindbrain, slik som de som danner den nedre oliven, selv om dette ville kreve bruken av hindbrains ved eldre embryonic stadier, og kan kreve kultur i opp til 48 timer, avhengig av nevronale levedyktighet <em&gt; Ex vivo. Kritiske trinn og feilsøking For å lykkes med denne protokollen, er det avgjørende at embryoer samles tidlig på dagen E11.5, nærmere E11.25, når FBM nevron migrasjon har nettopp begynt. Imidlertid er det ikke alltid mulig å fange embryoer på dette utviklingstrinn på grunn av naturlig parring variasjon av mus, og følgelig kan det være en viss variasjon i den strekker seg over FBM flytting mellom forskjellige eksperimenter. Variasjon i FBM migrasjon kan også observeres dersom eksperimentet ikke er fullført innen tidsrammen tilordnet, omtrent 3 timer, som kan sees i figur 3E. Hindbrain vev fra E11.25 mus embryoer er delikat. Når dissekere og gjennom eksplantering prosedyren, er det viktig å ikke rive hindbrain vev i områdene fra r4-r6 hvor FBM neuroner er plassert. På grunn av den skjøre natur av dissection prosess, og fordi hastigheten som hindbrains er plassert i kultur påvirker utfallet, kan prosedyren ta et par praksis går å mestre, særlig før edle prøver eller reagenser brukes. Til slutt er det viktig at hindbrain vevet anbringes i en åpen bok-konfigurasjon på innsatsen kulturen, for folding av hindbrain vevet under kultur vil hindre normal FBM migrering (figur 3F).

Embryonale nevroner er født i ventrikkel sonen av hjernen, men deretter migrere til nye destinasjoner for å nå nødvendige mål regioner som er plassert på en stor avstand. Korrekt plassering av nevronale celler organer på egnede steder langs dorso-ventral og anterior-posterior aksene i utviklingen av hjernen er avgjørende for riktig kabling, overlevelse og funksjon av disse nevronene etter den vandrende stadium 1-4. I likhet med de molekylære mekanismer som styrer axon veiledning 5-7, er kombinatoriske sett med attraktive og frastøtende signaler tenkt å veilede trekkende nevroner 1,8. Imidlertid, på grunn av interaksjoner av mange celletyper, vil signalene som kontrollerer nevronal migrasjon er mindre grundig studert enn de som er involvert i axon veiledning, som kan studeres celle autonomt. Den utvikler hindbrain av virveldyr har vært brukt i flere nyere studier for å forstå de molekylære og cellulære mekanismerav neuronal migrasjon, for eksempel i chick, mus og sebrafisk 1-4,9. Dette organet inneholder flere forskjellige typer nevroner, deriblant flere undergrupper av precerebellar og motoriske nevroner 5,7,10,11. Hindbrain motorneuron er født i ventrikkel sone nær gulvplate, og de ​​differensieres til bestemte undergrupper i henhold til deres rhombomere utstedt på 1,12. Ansikts branchiomotor (FBM) nevroner er generert i rhombomere (r) 4 i hindbrain og utvide sine axoner dorsally gjennom en R4 exit punkt i den andre branchial buen til innerverer ansiktsmusklene 2,9,13. FBM nevroner av sebrafisk og mus gir gode modeller for å studere de molekylære og cellulære mekanismer for neuronal migrasjon i en prosess som er lett visualiseres, fordi disse nevronene reproduserbart translocate deres somata i en spatiotemporally veldefinert prosess. Hos mus, FBM nevroner først migrere cauDally gjennom r5 og deretter både caudally og ventrally å nå sin endelige posisjon på pial siden av hindbrain på territoriet til R6, hvor de danner de sammenkoblede kjerner av VIIth hjernenerven (VIIn) 10,11,14. I sebrafisk, FBM nevroner i utgangspunktet migrere ventralt og deretter endre retning på R4-R5 grensen til å fortsette å migrere mot pial overflaten i en laminin avhengig måte 4,12,15,16. Denne migrering forløper over en periode på flere dager i utvikling og kan deles inn i faser for tangential og radial migrasjon, slik at identifisering av molekyler som formidler disse to adskilte prosesser. I kontrast til FBM nevroner av embryonale chick hindbrain forbli i R4 3,13,17-19. Under deres migrasjon, kan FBM nevroner bli identifisert, i likhet med andre typer eller motoriske nevroner, gjennom deres uttrykk for homoeodomain transkripsjonsfaktor holme 1 (ISL1) 14. Dermed engremount immunfluorescens flekker eller in situ hybridisering for denne markøren på ulike utviklingsstadier avslører tydelig vandrende strøm av FBM somata strekker seg fra R4 til R6 i sebrafisk eller mus 4,15,16. Videre har fluorescerende transgene journalister som ISL1-GFP blitt brukt som egnede verktøy for å visual migrere FBM nevroner i sebrafisk 3,17-19. I tillegg til deres egnethet for bildebehandling, har mange etterforskere undersøkt migrering av FBM nevroner i å utvikle sebrafisk, fordi deres frittlevende embryoer kan manipuleres lett med celle transplantasjon teknikker og farmakologiske stoffer som brukes direkte til akvariet vann. I kontrast, utvikler musen embryo vedlagt i livmoren, utelukker implantasjon av perler bærer veiledning pekepinner eller administrasjon av funksjons-blokkerende antistoffer som ikke krysser placenta. Videre kan farmakologiske forbindelser administreres til gravide moren har unønskede bivirkninger som indirekte kan svekke embryogenesis. Omgå denne begrensningen, har vi utviklet en ex vivo kultur metode for hele mus hindbrain som er kompatibel med FBM neuron migrasjon og overlevelse for 24 timer etter eksplantere 7,16. Denne metoden gir enkel farmakologisk manipulasjon, implantasjon av perler bærer veiledning pekepinner eller administrasjon av funksjons-blokkerende antistoffer og kan også tilpasses for å studere migrasjon av andre nevrale subtyper i hindbrain på ulike utviklingsstadier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="575">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">211-2120</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Cell culture plates, 12 well</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150628</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Plastic cell culture dish, 100 mm</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150288</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:104px;">3477</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:111px;">Dumont</td>
			<td style="width:104px;">91150-20</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P4417</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Laminin mouse protein</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">23017-015</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Primary antibody, Isl1</td>
			<td style="width:111px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:104px;">39.4D5</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">A11029</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21103</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">B27 supplement (50x)&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">17504-044</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Leibovitz&#8217;s L-15</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21083-027</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Penicillin/ streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15070</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Glucose</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">101174Y</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">G9023</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">T8787</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Slowfade Antifade Kit</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">S-2828</td>
			<td style="width:147px;">Alternative mounting solutions may be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0912</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Cover glass</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Affi-Gel Heparin Beads</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td style="width:104px;">153-6173</td>
			<td style="width:147px;">Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:215px;">Recombinant human VEGF165</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:104px;">293-VE</td>
			<td style="width:147px;">Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse hindbrain ex vivo culture to study facial branchiomotor neuron migration

Embryonale nevroner er født i ventrikkel sonen av hjernen, men deretter migrere til nye destinasjoner for å nå nødvendige mål. Forklaring på de molekylære signaler som i fellesskap styrer neuronal migrasjon i embryonale hjernen er derfor viktig å forstå hvordan de komplekse nevrale nettverk danner som senere støtte postnatal liv. Facial branchiomotor (FBM) nerveceller i mus embryo hindbrain migrere fra rhombomere (r) 4 caudally å danne de sammenkoblede ansikts kjerner i R6-avledet regionen hindbrain. Her gir vi en detaljert protokoll for wholemount ex vivo kultur av muse embryo hindbrains egnet til å undersøke signalveier som regulerer FBM migrasjon. I denne metoden, er hindbrains av E11.5 mus embryoer dissekert og dyrket i en åpen bok forberedelse på cellekultur innsatser for 24 hr. I løpet av denne tiden, FBM nevroner migrere caudally mot R6 og kan bli utsatt for funksjons-blokkerende antistoffer og små molecules i kulturmediet eller heparin perler lastet med rekombinante proteiner for å undersøke roller for signalveier involvert i guiding neuronal migrasjon.

Dette avsnittet illustrerer eksempler på resultater som kan oppnås ved å studere FBM nevron migrasjon i musen hindbrain gjennom ex vivo kultur. Vi viser at FBM nevroner i eksplanterte hindbrains fra dag 11 mus embryoer først gjennomgå en tangential migrasjon (figur 3A) og deretter begynne å montere den ansikts motor kjerner (Figur 3B), i likhet med sin oppførsel i utero (se figur 1). Vi viser videre at implantering av en VEGF165-fuktet vulsten tilt FBM neuroner (figurene 3C og 3D), som tidligere er vist 16. Viktigere, kan denne protokollen studere FBM migrasjon i fravær av blodårer eller fartøy-avledet faktorer som kan påvirke FBM migrasjon in utero, fordi nonperfused blodkar utarter i kultur 16. Dermed observerte uspesifikk blodceller merking ved bruk av ISL1 mus antistoff på fersktisolerte mus hindbrains (figur 1) er ikke lenger til stede i hindbrain vev etter 24 timer i kultur (Figurene 3A-F). Til slutt viser vi to eksempler på hindbrains som ikke ble eksplanterte fullstendig og derfor inneholder FBM nevroner i en unormal fordeling, enten fordi hindbrain ikke ble eksplantert snart nok etter embryo isolasjon (figur 3E), eller fordi hindbrain vevet foldes opp i Transwell ( Figur 3F). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1.jpg" /> Figur 1. FBM nevron migrasjon Confocal z-stack villtype mus hindbrains etter ISL1 wholemount immunolabeling og flatmounting;.. Hindbrain midtlinjen er merket med en stjerne i alle panelene (A) Ventrikulær overflaten av en E11.5 hindbrain i<html> Området inneholdende ISL1-positive FBM nevroner (pil), noe som viser deres tangential overgang fra R4-R6,. stillingen av R4, R5 og R6 er indikert (A &#39;) pial overflaten av en halvpart av den samme hindbrain i det området som inneholder anlage . av en av de sammenkoblede FBM kjerner (indikert med VIIn), samt andre ISL1-positive nevroner populasjoner (B) Ventrikulær overflaten av en E12.5 hindbrain inneholder FBM nevroner som migrerer tangentielt (pil); pilspissen indikerer et eksempel av et blodkar som inneholder sirkulerende celler som er uspesifikt merket med kryss-reaksjon av anti-mus sekundært antistoff som brukes til å detektere ISL1 muse-IgG-antistoff. (B &#39;) pial overflaten av en halvpart av den samme E12.5 hindbrain, som inneholder en av de sammenkoblede FBM kjerner. Midtlinjen er merket med en stjerne i hvert panel. Scale bar (alle paneler): 200 mikrometer. V, ventral, P, pial./ 51397fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klikk her for å se større bilde. <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2.jpg" /> Figur 2. E11.5 mus hindbrain disseksjon og ex vivo kultur. (AE) Nøkkel trinnene i E11.5 hindbrain disseksjon protokollen; skala bar:. 1 mm (A) Leder av embryo etter at det ble kuttet bort fra resten av embryoet på forbena nivå (B) Den rostral del av. hodet ble fjernet, og resten av hodet vev plassert slik at den 4. ventrikkel (pil) er orientert oppover. (C) Taket på 4. ventrikkel ble skrelt bort, og hindbrain ble eksponert ved å skrelle vevet under hindbrain vekk rostrally og caudally. (D) Den pial membran ble fjernet (merk at det i denne exrikelig, noen cervical ryggmargen (SC) vev har forblitt festet til hindbrain). (E) Skytende midthjernen (MB) og ryggmargen (SC) vev er fjernet for å beholde bare den hindbrain. (F) Kultur inserts ble belagt med laminin og plassert i en 12 godt vev kultur plate. (G) Hver hindbrain ble plassert på ett innsats og dekket med media. (H) Skjematisk fremstilling av banen tatt av trekkende FBM nevroner (blå) under 24 hr av kultur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" target="_blank">Klikk her å se større bilde.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3.jpg" /> Figur 3. Mus hindbrain ex vivo kultur. (A, B) En E11.5 hindbrain ble dyrket i 24 timer og immunofluoresc<html> ently merket for ISL1 å illustrere FBM nevron migrasjonen i en eksplantering; både ventrikkel (A) og (B) pial sider av hindbrain er vist (C, D) E11.5 kullsøster hindbrains ble dyrket i nærvær av implanterte heparin bead gjennomvåt. i PBS (C) eller VEGF165 (D); merke til at FBM nevroner migrerte mot og bort på VEGF165 vulsten, og det trekkende strømmen derfor forlenges ytterligere kaudalt sammenlignet med den ubehandlede side av samme hindbrain eller hindbrain inneholdende kontroll vulsten (E. , F) Eksempler på utilfredsstillende E11.5 hindbrain eksplantater, der FBMS ikke har emigrert fra R4 (E), eller der hindbrain vev foldet under kultur (F). Midtlinjen er merket med en stjerne i hvert panel. Scale bar (for alle paneler): 200 mikrometer. V, ventral, P, pial.&quot;&gt; Klikk her for å se større bilde.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration at JoVE.com

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mus hindbrain<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur å studere Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonale nevroner er født i ventrikkel sonen av nevralrøret, men migrere for å nå nødvendige mål. Facial branchiomotor (FBM) nevroner er en nyttig modell for å studere nevronale migrasjon. Denne protokollen beskriver wholemount ex vivo kultur av muse embryo hindbrains å undersøke mekanismene som regulerer FBM migrasjon.

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Levende Imaging av single celledelinger i mus neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection av Rodent neuroblasts å studere neuroblast Migration<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetisk manipulering av Lillehjernen Granule Neuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; I Vivo</em&gt; Å studere nevrale morfologi og migrasjon

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex vivo avbildning av Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Bruke Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Low-Density Primær Hippocampus Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Mus-Hindbrain som modell for å studere embryonale Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

En alternativ tilnærming til studere primære hendelser i Neurodegeneration bruker Ex Vivo rotte hjernen skiver

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

Ansikts nerve kirurgi i rottemodellen for å studere aksonal hemming og regenerering

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Ex vivo trykk hippocampus kapillær-Parenkymatøs Arteriole forberedelse for funksjonell studie

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo kalsiumavbildning av mus Geniculate Ganglion Neuron Responser på smak stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...