Name: mouse hindbrain ex vivo culture to study facial branchiomotor neuron migration
Uploaded: 2014-03-18T15:45:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration at JoVE.com

MT är uppburen av en doktorand [ref. 092839/Z/10/Z] och CR med en ny Investigator Award [ref. 095623/Z/11/Z] från Wellcome Trust.

1. Tillval: Förbered Affi-gel Heparin Pärlor (gelpärlor) för FBM analys sevärdhet OBS: Förbered gelpärlor minst 1 dag innan explantatet förfarandet. <ol><li> Tvätta 100 ^ gel heparin pärlsuspension med steril PBS i 20 minuter på en vals vid rumstemperatur (RT). </li><li> Pellet pärlor i en bordscentrifug under 5 min vid 13.000 X g. Lägg steril PBS och upprepa tvättproceduren 4x. </li><li> Efter den slutliga tvätten, ta bort PBS och blöt pärlorna i en liten volym av en steril lösning som innehåller det rekombinanta proteinet av val, var noga med att täcka pärlorna med lösningen. Detta protokoll använder 100 ng / l rekombinant humant VEGF165 i PBS för att reproducera en tidigare publicerad experiment 16. </li><li> Inkubera gelen heparin pärlor med den rekombinanta proteinlösningen i minst 12 timmar och högst 1 vecka på en vals vid 4 ° C. </li></ol> 2. Beläggning av kultur Inserter Hindbrain explantat odlas på Corning kulturen skär med en 8 ìm porstorlek, eller motsvarande insatser. Kultur insatser kan återanvändas efter slutförandet av protokollet, förutsatt att de tvättas med destillerat vatten, steriliseras med etanol, och lagras i 70% etanol tills det behövs. OBSERVERA: Följande steg bör utföras i ett flöde huva under sterila betingelser. <ol><li> Förbered explantatet odlingsmedia bestående av Neurobasal-medium kompletterat med B27 (20 ^ il / ml), glukos (6 mg / ml) och penicillin / streptomycin (5 | ig / | il). </li><li> Tvätta kultur skär med steril PBS under 5 min och torka i 5-10 min under flödeshuven. </li><li> Placera en odlingsinsatsen in i varje individuell brunn i en 12well platta. Obs: skär kan behöva en liten knuff för att passa tätt i brunnen. </li><li> Täck kulturinsatser med 10-20 mikrogram / ml muslaminin i Neurobasal medium och placera dem i en vävnadsodling inkubator (37 ° C, 5% CO <sub&gt; 2) under en timme. Anm: Beläggning bör utföras på dagen för explantation. </li></ol> 3. Dissektion av Hindbrains från E11.5 musembryon <ol><li> Slakta tidsinställda gravid kvinnlig mus med ett etiskt godkänd procedur på embryonala dag (E) 11.5 och placera livmodern innehåller embryona i en 100 mm plastskål med iskall L15 medium. OBS: Alla dissektion steg måste utföras i iskall L15. </li><li> Med hjälp av en dissekera mikroskop och Dumont urmakare pincett nummer 5, riva livmodermuskeln väggen för att exponera embryon, släpper varje embryo, kapa navelsträngen, och försiktigt bort gulesäcken. </li><li> Med hjälp av en plast pasteurpipett med en bred-borrning öppning, överföra varje embryo i en ren plastskål med iskall L15. </li><li> Använda Dumont pincett, halshugga embryot precis ovanför frambenen. Om försöket kräver genotypning av embryona, ta vävnadsprover för genomisk DNA-isolering (t.ex. en liten piece av gulesäcken eller svansspets 16,20). </li><li> Vrid huvudet ryggsidan uppåt och identifiera 4: e ventrikeln, som är täckt av ett tunt vävnadsskikt (Figur 2B). Försiktigt tränga igenom roofplate och börja att skala bort det kaudalt längs mittlinjen över den bakre hindbrain och ryggmärgen, och rostrally över mitthjärnan. Bakhjäman bör nu exponerade (figur 2C). </li><li> Försiktigt retas bort resterande huvud mesenkym och eventuella hjärnhinnorna som är kopplade till pial sidan av hindbrain (figur 2D). </li><li> Ta bort mitthjärnan och ryggmärgen vävnad så att bakhjäman rullar ut och kan ligga plant i en öppen bok förberedelse (Figur 2E). </li><li> Med hjälp av en bred-borrning plast Pasteur pipett varje dissekeras bakhjäman till en 12-brunnar innehåller iskall L15 och lagra dem på is tills alla hindbrains har dissekeras. </li><li> Med hjälp av en bred-borrning plast Pasteur pipett överföra en syndgle bakhjäman till en tom skål, hålla den en öppen bok förberedelse, kammarsidan uppåt, i en droppe ungefär 100 ^ L15. </li><li> Överför några mikroliter av de inkuberade gel heparin pärlor till samma droppen. Obs! Eftersom storleken på pärlorna varierar, är det lämpligt att överföra cirka 10 kulor och sedan välja en optimal storlek för transplantation till bakhjäman. </li><li> Gör en liten reva i bakhjäman vävnad och försiktigt in 1-3 gelpärlor i bakhjäman vävnaden på nivån för r5 / 6, ungefär halvvägs mellan mittlinjen och den laterala kanten av hindbrain, sänka dem i vävnaden så att den vulst är placerad precis under bakhjäman yta. OBS: dissektion procedur kan ta mellan 5 till 20 min / bakhjäman, beroende på erfarenhet och kan sträcka sig över en längre period om kullar är stora, i varje fall bör hindbrains vara i kultur inte längre än 3 h post mortem för god resultat. </li></ol> 4. HindbrainExplantation Kultur <ol><li> Ta bort plattan som innehåller kulturinsatser från inkubatorn, aspirera laminin beläggningslösningen. </li><li> Placera en kulturinsats i ett separat odlingsskål fylld med iskallt L15 och, med hjälp av en bred-borrning plast Pasteur pipett varje bakhjäman ventrala sidan upp på kulturinsatsen (figur 2G). Bakhjäman ska ligga helt platt på insatsen membranet. </li><li> Lyft försiktigt av kulturinsatsen från skålen och badda den flera gånger om ren mjukpapper för att avlägsna överflödig vätska. Denna process säkerställer att bakhjäman vidhäftar till odlingsinsatsen i en plan, öppen bok förberedelse. Om bakhjäman lockar upp, kan dess vävnad irreversibelt växa tillsammans. </li><li> Fyll ursprungliga 12-brunnar med 500 l förvärmda odlingsmedier och placera insatsen tillbaka in detta väl. Justera noggrant volymen med ytterligare 400-600 l av media för att bara täcka bakhjäman, se till att bakhjäman inte flyterbort membranet. Om det flyter, tillbaka till steg 4.4 och upprepa tills bakhjäman förblir fäst vid membranet. </li><li> I detta skede är det möjligt att lägga till biologiska hämmare av intresse för medierna för att studera deras effekt på migration av FBM nervceller. OBS: Om implantera pärlor eller administrering av andra behandlingar, rekommenderas att ha minst 2 kontroll explants under normala tillväxtförhållanden per försök för att se till att experimentet har inrättats med framgång. </li><li> Inkubera explantat efter 24-30 h i en vävnadsodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2). </li></ol> 5. Wholemount immunofluorescensfärgning av bakhjäman Explantat <ol><li> Aspirera medium från varje brunn, skölj i PBS och fix under 2 h vid 4 ° C under försiktig omrörning i iskall 4% formaldehyd (nyframställd eller färskt tinade 4% paraformaldehyd löst i PBS). Anm: Försök inte ta bort bakhjäman från odlingsinsatsen före fixeringär klar. </li><li> Skölj 3x med PBS. Dra försiktigt de hindbrains från kulturinsatser med hjälp Dumont pincett. Vissa explants är svåra att lossna, men kan oftast lyftas genom ett lätt tryck genom upprepade utvisa PBS från en pipett. </li><li> Överför hindbrains till 2,0 ml rundbottnad rör för immunfluorescensmärkning. Permeabilize hindbrains för 30 min vid rumstemperatur (RT) i PBS innehållande 0,1% TritonX-100 (PBT) med försiktig rullning. </li><li> Inkubera under en timme vid RT i PBT innehållande 10% värmeinaktiverat normalt getserum under försiktig rullning. </li><li> Inkubera explantat med försiktig rullning vid 4 ° C under 5 dagar med primär antikropp specifik för ISL1, späddes 1:100 i PBT innehållande 1% värmeinaktiverat normalt getserum. </li><li> Tvätta explantaten vid RT 4x med PBT under 15 min vardera. </li><li> Inkubera explantat med försiktig rullning vid RT under 3 h med fluorofor-konjugerad get-anti-mus-antikropp (t.ex. Alexa Fluor 488 get antimus, utspädd 1:200) i PBT innehållande 1% värmeinaktiverat normalt getserum. </li><li> Tvätta explantaten 4x vid RT med PBT i 15 minuter vardera med mjuka böljande. </li><li> Postfix explantaten i 4% formaldehyd under 30 min vid rumstemperatur. </li><li> Täck en glasskiva med 3 lager av svart eltejp och punktskatter med en skalpell en liten fyrkant av det skiktade bandet för att skapa en ficka för explantaten, alternativt använda en depression glasskiva. </li><li> Montera varje bakhjäman i SlowFade reagens i en ficka och täck med ett täckglas, noga undviker att fånga luftbubblor och bild med hjälp av en laserskanning konfokalmikroskop. NOTERA: Som ett alternativ till immunfärgning, in situ hybridisering med riboprober som känner igen FBMS (dvs. Isl1 eller PHOX2B) kan användas för att visualisera FBM neuroner 16,21. </li></ol> Sammanfattning av åtgärder och tidpunkter Begränsad parning att få E11.25 graviditeter: ~ 14 dagar Tillval: Bead förberedelse (Protocol 1): ~ 2 timmar, på dagen före embryo isolering Förbered odlingsinsatser och media (protokoll 2): ​​~ 30 min, innan embryot isolering Embryo isolering och bakhjäman dissektion (stegen 3,1-3,4): ~ 10 min / embryo Bakhjäman dissektion (steg från 3,5 till 3,7): ~ 5-10 min / hindbrain Explantation förfarandet (steg från 3,8 till 3,9): ~ 5-10 min / hindbrain Tillval: bead implantation (steg från 3,10 till 3,11): ~ 5-10 min / bakhjäman Explantation kulturen (steg 4,7): 24 tim Fixering för antikroppsfärgning (steg 5.1): 2 tim Färgningsproceduren och bildbehandling (protokoll 5): 5 dagar

<ol>
	<li>Lumsden, A., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+patterns+of+neuronal+development+in+the+chick+hindbrain.">Segmental patterns of neuronal development in the chick hindbrain.</a> Nature. 337 (6206), 424-428 (1989).</li><li>Chandrasekhar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+heads:+development+of+vertebrate+branchiomotor+neurons.">Turning heads: development of vertebrate branchiomotor neurons.</a> Dev. Dyn. 229 (1), 143-161 (2004).</li><li>Mapp, O. M., Wanner, S. J., Rohrschneider, M. R., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle1b+mediates+interpretation+of+migratory+cues+during+zebrafish+facial+branchiomotor+neuron+migration.">Prickle1b mediates interpretation of migratory cues during zebrafish facial branchiomotor neuron migration.</a> Dev. Dyn. 239 (6), 1596-1608 (2010).</li><li>Glasco, D. M., Sittaramane, V., Biol, D. e. v. .., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse Wnt/PCP protein Vangl2 is necessary for migration of facial branchiomotor neurons, and functions independently of Dishevelled. 369 (2), 211-222 (2012).</li><li>Marillat, V., Sabatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Slit+Receptor+Rig-1/Robo3+Controls+Midline+Crossing+by+Hindbrain+Precerebellar+Neurons+and+Axons.">The Slit Receptor Rig-1/Robo3 Controls Midline Crossing by Hindbrain Precerebellar Neurons and Axons.</a> Neuron. 43 (1), 69-79 (2004).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Vivancos, V., Chen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activity+guides+facial+branchiomotor+neuron+migration+and+involves+the+PCP+pathway+and+JNK+and+ROCK+kinases.">Wnt activity guides facial branchiomotor neuron migration and involves the PCP pathway and JNK and ROCK kinases.</a> Neural Dev. 4, 7 (2009).</li><li>Guan, K. -. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues.">Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 941-956 (2003).</li><li>Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+axon+guidance+of+cranial+motor+neurons.">Patterning and axon guidance of cranial motor neurons.</a> Nat. Rev. 8 (11), 859-871 (2007).</li><li>Garel, S., Garcia-Dominguez, M., Charnay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+migratory+pathway+of+facial+branchiomotor+neurones.">Control of the migratory pathway of facial branchiomotor neurones.</a> Development. 127 (24), 5297-5307 (2000).</li><li>Gavalas, A., Ruhrberg, C., Livet, J., Henderson, C. E., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+defects+in+the+hindbrain+of+Hoxa1,+Hoxb1+and+Hoxb2+mutants+reflect+regulatory+interactions+among+these+Hox+genes.">Neuronal defects in the hindbrain of Hoxa1, Hoxb1 and Hoxb2 mutants reflect regulatory interactions among these Hox genes.</a> Development. 130 (23), 5663-5679 (2003).</li><li>Grant, P. K., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroepithelial+basement+membrane+serves+as+a+boundary+and+a+substrate+for+neuron+migration+in+the+zebrafish+hindbrain.">The neuroepithelial basement membrane serves as a boundary and a substrate for neuron migration in the zebrafish hindbrain.</a> Neural Dev. 5, 9 (2010).</li><li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+compartition+in+the+early+avian+hindbrain.">Segmentation and compartition in the early avian hindbrain.</a> Mech. Dev. 121 (9), 1081-1088 (2004).</li><li>Tsuchida, T., Ensini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79 (6), 957-970 (1994).</li><li>Qu, Y., Glasco, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+cadherins+Celsr1-3+differentially+regulate+migration+of+facial+branchiomotor+neurons+in+mice.">Atypical cadherins Celsr1-3 differentially regulate migration of facial branchiomotor neurons in mice.</a> J. Neurosci. 30 (28), 9392-9401 (2010).</li><li>Schwarz, Q., Gu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+controls+neuronal+migration+and+cooperates+with+Sema3A+to+pattern+distinct+compartments+of+the+facial+nerve.">Vascular endothelial growth factor controls neuronal migration and cooperates with Sema3A to pattern distinct compartments of the facial nerve.</a> Genes Dev. 18 (22), 2822-2834 (2004).</li><li>Stockinger, P., Ma&#238;tre, J. -. L., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+neuroepithelial+cell+cohesion+affects+tangential+branchiomotor+neuron+migration+in+the+zebrafish+neural+tube.">Defective neuroepithelial cell cohesion affects tangential branchiomotor neuron migration in the zebrafish neural tube.</a> Development. 138 (21), 4673-4683 (2011).</li><li>Wanner, S. J., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+tracts+guide+zebrafish+facial+branchiomotor+neuron+migration+through+the+hindbrain.">Axon tracts guide zebrafish facial branchiomotor neuron migration through the hindbrain.</a> Development. , (2013).</li><li>Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cranial+motor+neurons+in+live+transgenic+zebrafish+expressing+green+fluorescent+protein+under+the+control+of+the+islet-1+promoter/enhancer.">Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer.</a> Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).</li><li>Laird, P. W., Zijderveld, A., Linders, K., Rudnicki, M. A., Jaenisch, R., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+mammalian+DNA+isolation+procedure.">Simplified mammalian DNA isolation procedure.</a> Nucleic Acids Res. 19 (15), 4293 (1991).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1 (1), 4 (2001).</li><li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants:+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development.">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J. Vis. Exp. (74), (2013).</li><li>Holland, P. J., George, A. M., Worrell, L. T. C., Landsberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electroporation+of+the+lower+rhombic+lip+of+midgestation+mouse+embryos.">In vitro electroporation of the lower rhombic lip of midgestation mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (66), (2012).</li></ol>

Ingen av författarna har konkurrerande intressen eller motstridiga intressen.

Detta protokoll beskriver wholemount kultur E11.5 mus hindbrains i ett transwell system för att studera migration av FBM nervceller. Detta protokoll möjliggör mus bakhjäman motorneurons att hållas vid liv och att migrera under en period av 24 timmar, vilket möjliggör ex vivo manipulation. Denna metod har många experimentella fördelar för utredare som söker att identifiera de molekylära och cellulära mekanismer för neuronal migration. Medan traditionella migrationsanalyser explantera små neurala vävnadsbitar i matrisen på kultur rätter och möjliggör observation av enskilda nervceller när de reagerar på yttre stimuli, är en stor fördel med transwell analysen dess lämplighet att manipulera migrerar nervceller i värdorganmiljön och därmed en mer fysiologiskt sammanhang. Viktigt kan ämnen med lätthet appliceras på ex vivo bakhjäman explants att testa deras effekt på neuronala migration, kringgå eventuella biverkningar som förknippas med administering dessa ämnen till en gravid mus. Slutligen, den ex vivo-modell gör också testning av ämnen som inte korsar placentabarriären, såsom funktionsblockerande antikroppar. På grund av dessa fördelar, ger ex vivo bakhjäman kultur en alternativ och kompletterande metod för att med hjälp av zebrafisk embryon, som kan behandlas med vattenlösliga små molekyler i akvariet vatten, eller i livmodern elektroporering av embryonala hjärnor, som kräver användning av specialiserade utrustning och är svårare att behärska än odlingstekniken beskriven här. En annan fördel med det protokoll som beskrivs här är dess mottaglighet för implantation pärlor indränkt i rekombinant protein eller andra reagens, därför tillåter tillämpningen av en standard embryo metod som utvecklats för att manipulera kycklingembryon till en musmodell av neuronala migration. I synnerhet kan den ex vivo odlingsmodell appliceras hindbrains av genetiskt manipulerade möss defektativ i specifika molekyler inblandade i neuronala migration, till exempel tillväxt eller vägledning receptorer, och i kombination med pärla implantat för att testa om lyhördhet för ligander är förlorad. Förutom farmakologisk manipulation kan den ex vivo kultur protokoll också anpassas för att elektroporera expressionsvektorer som kan manipulera uttryck av gener av intresse, lämpliga metoder för elektroporation har tidigare beskrivits 22,23. Detta protokoll kan också anpassas för att visualisera neuron migration av tidsförlopp mikroskopi i hindbrain explantat från transgena möss som innehåller fluorescerande FBM nervceller, t.ex. Isl1-Cre, Rosa26Yfp 21. Slutligen kan detta protokoll också användas för att studera andra typer av flytt neuroner i bakhjäman, såsom de som bildar den underlägsna olivolja, även om detta skulle kräva användning av hindbrains vid äldre embryonala stadier och kan kräva odling under upp till 48 timmar, beroende på neuronal viabilitet <em&gt; Ex vivo. Kritiska steg och felsökning För att lyckas med detta protokoll är det viktigt att embryon samlas tidigt på dagen E11.5, närmare E11.25, när FBM neuron migration just har börjat. Emellertid är det inte alltid möjligt att fånga embryon på detta utvecklingsstadium på grund av naturlig parning variabilitet av möss, och följaktligen kan det finnas vissa variationer i omfattningen av FBM migration mellan olika experiment. Variationen i FBM migration kan också observeras om experimentet inte slutförs inom den tidsram som tilldelats, ca 3 timmar, vilket kan ses i figur 3E. Bakhjäman vävnad från E11.25 musembryon är känslig. När dissekera och hela explantatet förfarandet är det viktigt att inte slita bakhjäman vävnad i områden från r4-r6 där FBM neuroner är lokaliserade. På grund av den känsliga naturen av dissektion process, och eftersom den hastighet med vilken hindbrains placeras i kultur påverkar resultatet, kan proceduren ta några praktiken går att bemästra, särskilt innan dyrbara prover eller reagenser används. Slutligen är det viktigt att den bakhjäman vävnaden placeras i en bok konfigurationen öppen på odlingsinsatsen, eftersom vikningen av hindbrain vävnad under odling kommer att förhindra normal FBM migration (se figur 3F).

Embryonala nervceller föds i den ventrikulära zonen i hjärnan, men därefter migrera till nya destinationer för att nå lämpliga mål regioner som är belägna på stort avstånd. Rätt placering av neuronala cellkroppar i lämpliga platser längs de dorso-ventrala och främre-bakre axlarna för den växande hjärnan är avgörande för korrekt kabeldragning, överlevnad och funktion av dessa nervceller efter flyttande etapp 1-4. I likhet med de molekylära mekanismer som styr axon vägledning 5-7, är kombinatoriska uppsättningar av attraktiva och frånstötande ledtrådar tänkt att vägleda migrerar nervceller 1,8. Men på grund av samspelet mellan flera olika celltyper, de signaler som styr neuronal migration har mindre omfattande studier än dem som deltar i axonet vägledning, som kan studeras cell autonomt. Utvecklings bakhjäman av ryggradsdjur har använts i flera nya studier för att förstå de molekylära och cellulära mekanismerav neuronala migration, till exempel i chick, mus, och zebrafisk 1-4,9. Detta organ innehåller flera olika typer av nervceller, däribland flera subtyper av precerebellar och motoriska nervceller 5,7,10,11. Bakhjäman motorneuron är födda i den ventrikulära zonen nära golvplatta, och de differentieras till specifika undergrupper enligt deras rhombomere ursprungs 1,12. Ansikts branchiomotor (FBM) nervceller genereras i rhombomere (r) 4 i bakhjäman och utvidga sina axoner dorsalt genom en R4 utgång i den andra brankiala valv till innerverar ansiktsmusklerna 2,9,13. FBM nervceller i zebrafisk och möss ger utmärkta modeller för att studera de molekylära och cellulära mekanismer för neuronal migration i en process som lätt visualiseras, eftersom dessa nervceller reproducerbart translocate sin somata i ett spatiotemporally väldefinierad process. Hos möss FBM neuroner först migrera Causöla genom R5 och sedan både kaudalt och ventralt nå sin slutliga ståndpunkt om pial sidan av hindbrain på territoriet i r6, där de bildar de parade kärnor av det sjunde hjärnnerven (Viin) 10,11,14. I zebrafisk, FBM nervceller först migrera ventralt och sedan ändra riktning på R4-r5 gränsen för att fortsätta att migrera mot pial ytan i ett laminin beroende sätt 4,12,15,16. Denna migration fortsätter under en period av flera dagar i utveckling och kan delas in i faser av tangentiell och radiell migration, vilket gör att identifieringen av molekyler som medierar dessa två skilda processer. I motsats härtill FBM neuroner i embryonal chick bakhjäman förbli i r4 3,13,17-19. Under sin vandring, kan FBM nervceller identifieras, liksom andra typer eller motoriska nervceller, genom deras uttryck för homoeodomain transkriptionsfaktor holme 1 (ISL1) 14. Sålunda groemount immunofluorescensfärgning eller in situ hybridisering för denna markör vid olika utvecklingsstadier avslöjar distinkta vandrande ström av FBM somata sträcker sig från R4 till R6 i zebrafisk eller mus 4,15,16. Dessutom har fluorescerande transgena reportrar såsom ISL1-GFP använts som lämpliga verktyg för att visualisera migrera FBM nervceller i zebrafisk 3,17-19. Förutom att de är lämpliga för avbildning, har många forskare studerat migration av FBM neuroner i utveckla zebrafisk, eftersom deras fritt levande embryon kan manipuleras enkelt med celltransplantationstekniker och farmakologiska föreningar appliceras direkt på akvarievatten. Däremot utvecklar musen embryot inneslutna i livmodern, utgör hinder implantation av pärlor som bär vägledning ledtrådar eller administration av funktionsblockerande antikroppar som inte korsar placentabarriären. Dessutom kan farmakologiska föreningar administreras till den gravida modern har unönskvärda biverkningar som indirekt kan försämra embryogenes. Kringgå denna begränsning, har vi utvecklat en ex vivo odlingsmetod för hela mus bakhjäman som är kompatibel med FBM neuron migration och överlevnad för 24 timmar efter explantation 7,16. Denna metod gör det lätt farmakologisk manipulation, implantation av pärlor som bär vägledning ledtrådar eller administration av funktionsblockerande antikroppar och kan även anpassas för att studera migration av andra neuronala subtyper i bakhjäman vid olika utvecklingsstadier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="575">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">211-2120</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Cell culture plates, 12 well</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150628</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Plastic cell culture dish, 100 mm</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150288</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:104px;">3477</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:111px;">Dumont</td>
			<td style="width:104px;">91150-20</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P4417</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Laminin mouse protein</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">23017-015</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Primary antibody, Isl1</td>
			<td style="width:111px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:104px;">39.4D5</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">A11029</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21103</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">B27 supplement (50x)&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">17504-044</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Leibovitz&#8217;s L-15</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21083-027</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Penicillin/ streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15070</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Glucose</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">101174Y</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">G9023</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">T8787</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Slowfade Antifade Kit</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">S-2828</td>
			<td style="width:147px;">Alternative mounting solutions may be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0912</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Cover glass</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Affi-Gel Heparin Beads</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td style="width:104px;">153-6173</td>
			<td style="width:147px;">Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:215px;">Recombinant human VEGF165</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:104px;">293-VE</td>
			<td style="width:147px;">Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse hindbrain ex vivo culture to study facial branchiomotor neuron migration

Embryonala nervceller föds i den ventrikulära zonen i hjärnan, men därefter migrera till nya destinationer för att uppnå lämpliga mål. Dechiffrera molekylära signaler som kooperativt styr neuronal migration i den embryonala hjärnan är därför viktigt att förstå hur de komplexa neurala nätverk bildas som senare stöder postnatal liv. Ansikts branchiomotor (FBM) neuroner i musembryo bakhjäman migrera från rhombomere (R) 4 kaudalt att bilda de parade ansiktskärnorna i r6-härledda regionen av hindbrain. Här ger vi ett detaljerat protokoll för wholemount ex vivo kultur av mus embryo hindbrains lämpliga för att undersöka de signalvägar som reglerar FBM migration. I denna metod är hindbrains av embryon E11.5 mus dissekeras och odlas i en öppen bok förberedelse på cellodlings skär för 24 tim. Under denna tid, FBM nervceller vandrar kaudalt mot r6 och kan utsättas för funktionsblockerande antikroppar och små molecules i odlingsmedier eller heparin kulor laddade med rekombinanta proteiner för att undersöka roller för signalvägar som är inblandade i att vägleda neuronal migration.

Det här avsnittet visar exempel på resultat som kan erhållas genom att studera FBM neuron migration i musen bakhjäman genom ex vivo kultur. Vi visar att FBM nervceller i explanterade hindbrains från dag 11 musembryon genomgår först en tangentiell migration (Figur 3A) och sedan börja sätta ihop ansiktsmotorkärnor (Figur 3B), liknar deras beteende i livmodern (se figur 1). Vi visar vidare att implantation av en VEGF165-dränkts vulst attraherar FBM neuroner (fig. 3c och 3d), såsom tidigare visats 16. Viktigt tillåter detta protokoll studerar FBM migration i frånvaro av blodkärl eller kärl-härledda faktorer som kan påverka FBM migration i livmodern, eftersom nonperfused kärl urartar i kultur 16. Sålunda den ospecifika blodkroppar märkning iakttas vid användning av den ISL1 musantikropp på nyligenisolerade mus hindbrains (figur 1) inte längre finns i bakhjäman vävnad efter 24 timmar i kultur (fig. 3A-F). Slutligen visar vi två exempel på hindbrains som inte explanterade korrekt och därför innehåller FBM nervceller i en onormal fördelning, antingen därför att bakhjäman inte explanterad snart nog efter embryo isolering (figur 3E) eller för att den bakhjäman vävnad hopvikt i transwell ( Fig. 3F). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1.jpg" /> Figur 1. FBM neuron migration Confocal z-stack av vildtyp mus hindbrains efter ISL1 wholemount immunomärkning och flatmounting,.. Bakhjäman mittlinjen är markerade med en asterisk i alla paneler (A) ventrikulär ytan av en E11.5 bakhjäman i<html> område som innehåller ISL1-positiva FBM neuroner (pil), vilket visar deras tangentiella migrering från R4 till R6,. ställning R4, R5 och R6 visas (A &#39;) Pial yta på ena halvan av samma bakhjäman i området innehåller anlage . av en av de parade FBM kärnor (indikerade med Viin), såväl som andra ISL1-positiva neuronpopulationer (B) Ventrikulär ytan av en E12.5 bakhjäman innehållande FBM nervceller som migrerar tangentiellt (pil); pilspetsen visar ett exempel av ett blodkärl innehållande cirkulerande celler som ospecifikt märkta genom tvärreaktion av anti-mus sekundär antikropp användes för att detektera ISL1 mus-IgG-antikropp. (B &#39;) Pial ytan av en halv av samma E12.5 bakhjäman, som innehåller en av de parade FBM kärnor. Den mittlinjen indikeras med en asterisk i varje panel. Skala bar (alla paneler): 200 nm. V, ventral, P, pial./ 51397fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicka här för att visa en större bild. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2.jpg" /> Figur 2. E11.5 mus bakhjäman dissekering och ex vivo kultur. (AE) Viktiga steg i E11.5 bakhjäman dissektion protokoll, skal:. 1 mm (A) Chef embryot efter det skars bort från resten av embryot på forelimb nivå (B) Den rostrala delen av. huvud avlägsnades och återstoden av huvudet vävnad placeras så att 4: e ventrikeln (pil) var orienterad uppåt. (C) Taket på 4: e ventrikeln skalades bort, och bakhjäman exponerades genom avskalning vävnaden under bakhjäman bort rostrally och kaudalt. (D) Den pial membranet togs bort (notera att i detta exriklig, vissa cervikal ryggmärg (SC) vävnad har varit fäst till hindbrain). (E) Överskott av mitthjärnan (MB) och ryggmärgen (SC) vävnad har avlägsnats för att behålla bara hindbrain. (F) Kultur Skären belades med laminin och placerades i en 12 brunnars vävnadsodlingsplatta. (G) Varje bakhjäman placerades på en insats och täckta med media. (H) Schematisk representation av den väg som migrerar FBM neuroner (blå) under 24 h av odling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" target="_blank">klicka här för att visa en större bild.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3.jpg" /> Figur 3. Mus bakhjäman ex vivo-kultur. (A, B) En E11.5 bakhjäman odlades under 24 h och immunofluoresc<html> ently märkt för ISL1 att illustrera FBM neuron migration i ett explantat, både ventrikulär (A) och pial (B) sidorna av hindbrain visas (C, D) E11.5 kull hindbrains odlades i närvaro av implanterade heparin vulst bomullstrasa. i PBS (C) eller VEGF165 (D); notera att FBM neuroner migrerade mot och upp på VEGF165 vulsten, och migreringsströmmen utvidgas därför vidare kaudalt jämfört med den obehandlade sidan av samma bakhjäman eller hindbrain innehållande kontroll vulst (E. , F) Exempel på otillfredsställande E11.5 bakhjäman explants, där FBMS inte har emigrerat från R4 (E), eller i vilka bakhjäman vävnaden viks under kultur (F). Den mittlinjen indikeras med en asterisk i varje panel. Skala bar (för alla paneler): 200 nm. V, ventral, P, pial.&quot;&gt; Klicka här för att visa en större bild.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration at JoVE.com

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mus bakhjäman<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur att studera Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonala nervceller föds i den ventrikulära zonen av neuralrörsdefekter, men flytta för att nå lämpliga mål. Facial branchiomotor (FBM) nervceller är en användbar modell för att studera neuronala migration. Detta protokoll beskriver wholemount ex vivo kultur av mus embryo hindbrains att undersöka mekanismer som reglerar FBM migration.

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live avbildning av Single celldelningar i Mouse neuroepitel

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection av Gnagare neuroblaster att studera neuroblast migration<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation av Cerebellar granulneuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em&gt; Att studera neuronal morfologi och migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex vivo Imaging av Födsel Cerebellar Granule Cell Migration Använda Confocal makroskopi

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Low-density Primary hippocampus Neuron kultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Mus bakhjärnan som modell för att studera embryonala neurogenes

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

En alternativ metod att studera primära händelser i Neurodegeneration använder Ex Vivo råtta hjärnan skivor

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

Facial nervkirurgi i råtta modell för att studera axonal hämning och regenerering

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Ex vivo trycksatt Hippocampus kapillär-parenkymal arteriole förberedelse för funktionell studie

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo kalciumavbildning av mus geniculate ganglion neuron svar på smak stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...