Name: affinity-based isolation of tagged nuclei from drosophila tissues for gene expression analysis
Uploaded: 2014-03-25T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Vi takker Janice Fischer for å gi UAS-EGFP :: Msp-300 KASH plasmid. Den mAB24B10 antistoff ble innhentet fra Developmental Studies hvbridom Bank utviklet i regi av NICHD og vedlikeholdes av University of Iowa, Institutt for biologi. Repo-Gal4 lager (BL7415) ble hentet fra Bloomington Stock Center ved Indiana University. Støtte fra American Cancer Society Institutional Forskning Grant (IRG # 58-006-53) til Purdue University Center for Cancer Research er takknemlig erkjent. Jingqun Ma er støttet av en landbruksforskning ved Purdue assistant i Food and Agriculture fra Purdue University.

En. Generasjon og karakterisering av EGFP :: KASH Drosophila <ol><li> Cross Gal4 driver flyr til UAS-EGFP :: Msp-300 KASH flyr. Alternativt kan rekombinante fluer som bærer både Gal4 driver og UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgenet bli generert ved hjelp av standard genetiske teknikker. Denne andre fremgangsmåten er fordelaktig hvis et stort antall avkom er nødvendig. </li><li> Karakter uttrykk for EGFP :: KASH markør ved hjelp av standard mikroskopi ...

<ol>
	<li>Weake, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcription+initiation+function+of+the+ubiquitous+SAGA+complex+in+tissue-specific+gene+activation.">Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation.</a> Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).</li><li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+chromatin+immunoprecipitation+from+multicellular+complex+samples+using+BiTS-ChIP.">Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP.</a> Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).</li><li>Haenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+C.+elegans+intestinal+gene+expression+and+polyadenylation+by+fluorescence-activated+nuclei+sorting+and+3'-end-seq.">Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).</li><li>Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+contributions+of+the+nuclear+and+cytoplasmic+compartments+to+global+gene+expression+in+human+cells.">Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells.</a> BMC Genom. 8, 340 (2007).</li><li>Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+characterization+of+cell-specific+gene+expression+through+fluorescence-activated+sorting+of+nuclei.">Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei.</a> Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+gene+expression+and+chromatin+profiling+of+individual+cell+types+within+a+tissue.">A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue.</a> Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genom. Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+and+SUN+proteins.">KASH and SUN proteins.</a> Curr Biol. 21, 414-415 (2011).</li><li>Fischer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+klarsicht+has+distinct+subcellular+localization+domains+for+nuclear+envelope+and+microtubule+localization+in+the+eye.">Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye.</a> Genetics. 168, 1385-1393 (2004).</li><li>Patterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+Klarsicht+and+nuclear+lamin+in+developmentally+regulated+nuclear+migrations+of+photoreceptor+cells+in+the+Drosophila+eye.">The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+KASH+domain+protein+MSP-300+plays+an+essential+role+in+nuclear+anchoring+during+Drosophila+oogenesis.">The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis.</a> Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).</li><li>Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+klaroid+encodes+a+SUN+domain+protein+required+for+Klarsicht+localization+to+the+nuclear+envelope+and+nuclear+migration+in+the+eye.">Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye.</a> Fly. 1, 75-85 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).</li><li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS/PNS+transition+zone.">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).</li><li>Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+Drosophila+nervous+system.">Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).</li></ol>

Denne protokollen kan brukes til å isolere eller svært berike spesielt merket kjerner fra blandede cellepopulasjoner i Drosophila embryonale eller larve vev. Ved hjelp av denne protokollen, kan atomkjerner isoleres fra dissekert vev i ca 1 time. Den renhet og utbytte av de isolerte kjerner må være eksperimentelt bestemt for hver celletype. Det kan være vanskelig å kvantifisere bead bundne kjerner ved etterisoleringstrinn av protokollen ved bruk av et hemocytometer på grunn av vulstene som er tilstede i p...

Drosophila vev slik som sentralnerve-systemet inneholder en kompleks blanding av celletyper. Således, for å analysere cellespesifikk genekspresjonsprofiler fra Drosophila vev, er det først nødvendig å isolere en homogen populasjon av bestemte celler i tilstrekkelige mengder til å muliggjøre nedstrøms applikasjoner. Metoder for å isolere celler fra intakt vev omfatter laser mikrodisseksjon, og fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) av hele celler. Mens FACS har blitt brukt for å isolere celler og kjerner fra Drosophila embryo og fra Caenorhabditis elegans for genekspresjon og kromatin profilering 1-3, kan FACS og laser mikrodisseksjon være vanskelig å utføre med hell i vev som inneholder svært blandede celletyper eller som inneholder celler med uregelmessig morfologi, slik som nerveceller. For å overvinne denne vanskelighet, kan kjerner i stedet for cellene blir isolert fra bestemte celletyper, og som brukes for etterfølgende gene uttrykk profilering. Viktigere, microarray-baserte mRNA uttrykk analyse ved hjelp av kjernefysiske RNA prøver viser generelt sammenlignbare resultater med det utføres ved hjelp av total RNA fire, fem. Videre har genekspresjonsanalyser bruker atom RNA blitt brukt til å studere genuttrykk i flere organismer inkludert C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila, og mennesker 4, 5 2, 3. En rekke angrepsmåter har nylig blitt beskrevet for isolering av spesifikke populasjoner av merkede kjerner fra Drosophila vev som er egnet genekspresjonsanalyse og / eller kromatin immunoutfelling for. Batchen isolering av vev-spesifikk kromatin for immunoutfelling (bits-chip)-metoden benytter FACS for å isolere faste kjerner på grunnlag av celletype spesifikk ekspresjon av atom lokalisert GFP 2. Denne tilnærmingen har vært successfully brukt for å analysere fordelingen av histon modifikasjoner og transkripsjonsfaktorer ved hjelp av kromatin immunoutfelling av isolerte kjerner fra mesoderm of Drosophila embryo 2. Imidlertid kan FACS-baserte metoder være mindre egnet til å isolere merkede kjerner som utgjør bare en liten andel av en blandet befolkning på grunn av økt sorterings tiden som er nødvendig for å oppnå passende tall for nedstrøms-anvendelser. For å overvinne disse begrensninger har flere grupper benyttet affinitets-baserte isolasjonsteknikker for å rense kjerner som er merket med en spesifikk epitop i et bestemt celletype. Isoleringen av atomkjerner merket i spesifikke celletyper (INTACT)-metoden som er utviklet for bruk i Arabidopsis thaliana 6, 7 har nylig blitt tilpasset for bruk i Drosophila 8.. I denne metode blir et atom konvolutt fusjonsprotein som et substrat for in vivo biotinylering er coexpressed med Escherichia coli biotin ligase Bira i bestemte celletyper. Biotin-merkede kjerner kan deretter renses fra blandede populasjoner ved hjelp av streptavidin-baserte affinitet isolasjon. Ved hjelp av denne metode, ble det atomkjerner med hell merket og isolert fra mesoderm of Drosophila embryo i hvilken en kjernefysisk konvolutt fusjonsprotein som ble uttrykt under kontroll av en mesoderm-spesifikk forsterknings 8.. Forfatterne har også generert atom konvolutt fusjonsproteiner som kan uttrykkes i en hvilken som helst celletype under kontroll av Gal4 regulatorisk sekvens, UAS 9.. Denne tilnærmingen er i stand til raskt å isolere undergrupper av merket kjerner fra blandede bestander, men krever tre separate transgene konstruksjoner og kan derfor være uegnet for spesielle genetiske programmer. Nylig har en tilnærming blitt beskrevet som SUN (S ad1 og FN-C-84) domene inneholder proteiner som lokalisere til den indre membran av kjernefysiske konvolutten ble merket medfluorescerende proteiner og uttrykkes under kontroll av Gal4/UAS systemet 10. Nuclei ble isolert i nærvær av ikke-ionisk tensid for å fjerne den ytre membran av atom konvolutten, og affinitets-renset ved anvendelse av magnetiske kuler koblet til anti-GFP antistoffer. Denne tilnærmingen ble brukt til å isolere små populasjoner av merket kjerner fra spesifikke nevronale undergrupper innenfor den voksne hjernen av Drosophila 10. Her er en protokoll for isolering av merkede kjerner fra en blandet populasjon av celler fra Drosophila larve vev er beskrevet. Denne metoden ble utviklet uavhengig av hverandre, men er lik den metode som er beskrevet av Henry et al. 10. Først ble kjerner som er merket med et fluorescent merke som er uttrykt i spesielle celletyper i Drosophila melanogaster for å lette den etterfølgende isolering av merkede kjerner fra blandede populasjoner ved hjelp av en affinitets-baserte metode. Slik merker kjerner,den KASH (K larsicht / A nc-1 / S yn h omology) domenet ble benyttet. Den KASH domenet er en transmembrane domene som lokaliserer til den ytre membran av kjernefysiske konvolutten, blant annet gjennom samhandling med søn domene inneholder proteiner innenfor oppklaring rundt kjernen plass 11. Den C-terminale domene KASH av proteiner slik som Drosophila MSP-300 og Klarsicht forankrer disse proteinene i den ytre kjernemembranen, mens de N-terminale domener samhandle med cytoskjelett proteiner som aktin eller mikrotubuli i cytoplasma 12-14. Konstrukter ble samlet hvori KASH domenet til Drosophila MSP-300 ble fusjonert til C-terminalen av EGFP, under kontroll av Gal4 regulatorisk sekvens, UAS i pUAST-attB vektor 15, 16. Bruke phiC31 stedsspesifikke integrasjon, ble transgene fluer generert der UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgenet ble satt inn i attP2 loci på kromosom3L 17. Den UAS-EGFP :: MSP-300 KASH fluer kan krysses med fluer som uttrykker Gal4 driver i en bestemt celletype, noe som resulterer i målrettet ekspresjon av EGFP på den ytre kjernemembranen i celletype av interesse. Merkede kjerner kan deretter bli renset fra blandede cellepopulasjoner ved å bruke antistoffer mot GFP koplet til magnetiske kuler. I denne fremgangsmåten, er bruken av ikke-ionisk tensid er ikke nødvendig fordi EGFP-koden er lokalisert til den cytoplasmatiske side av den ytre kjernemembranen, og er derfor tilgjengelig for antistoffer. Den protokoll som er beskrevet nedenfor, kan brukes til å isolere / berike EGFP-merkede kjerner fra spesifikke celletyper i Drosophila larve vev, for å kvantifisere renhet og utbytte av isolerte kjerner, og for å trekke ut kjerne RNA egnet for kvantitativ revers-transkripsjon polymerasekjedereaksjon (QRT genekspresjonsanalyser-PCR). Isoleringen og affinitets-rensing av kjerner (unntatt tissue disseksjon) kan utføres i mindre enn én time. Resultatene er presentert som viser at glial kjerner kan med hell isolert fra larveoptiske lobe og øye imaginal plate, og som brukes for etterfølgende genekspresjon analyse. Det er forventet at denne tilnærmingen er nyttig for isolering / anrikning av merkede kjerner fra embryoniske-og larve vev hvori målcellene utgjør mindre enn 5% av den totale populasjonen. Alle Drosophila aksjer og plasmider som genereres i denne studien er tilgjengelige fra forfatterne på forespørsel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1884">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td style="width:263px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:195px;">mAB24B10</td>
			<td style="width:828px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BEQPCR-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dounce Homogenizer (1 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62400-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Tweezers, 11 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td>This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EpiScript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>ERT12910K</td>
			<td><a href="http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon cell strainers, 40 &#956;m pore size</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-949</td>
			<td>Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LSKMAGS08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Mini tube rotator</td>
			<td style="width:263px;">Genemate</td>
			<td style="width:195px;">H-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:599px;">Qubit starter kit</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">Q32871</td>
			<td style="width:828px;">Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RNAsecure (Ambion)</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">AM7010</td>
			<td style="width:828px;">The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RT-PCR machine Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">CFX Connect Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Siliconized 9 well glass plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 - 460nm) excitation + yellow barrier</td>
			<td style="width:263px;">Nightsea</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td>This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:195px;">SMZ 745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf" >http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity-based isolation of tagged nuclei from drosophila tissues for gene expression analysis

Drosophila melanogaster embryonale og larve vev inneholder ofte en svært heterogen blanding av celletyper, noe som kan vanskeliggjøre analyse av genekspresjon i disse vev. Således, for å analysere cellespesifikk genekspresjonsprofiler fra Drosophila vev, kan det være nødvendig å isolere spesifikke celletyper med høy renhet og i tilstrekkelige utbytter for nedstrøms applikasjoner som transcriptional profilering og kromatin immunoutfelling. Imidlertid kan de irregulært cellulær morfologi i vev som det sentrale nervesystemet, kombinert med den sjeldne populasjon av spesifikke celletyper i disse vev, by på utfordringer for tradisjonelle metoder for celleisolasjon som laser mikrodisseksjon og fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) . Her er en alternativ tilnærming for å karakterisere celle-spesifikk genekspresjon profiler ved hjelp av affinitets-baserte isolering av merkede kjerner, i stedet for hele celler, er beskrevet. Kjerner i den spesifikke cell type interesse er genetisk merket med et kjernefysisk konvolutt-lokaliserte EGFP tag bruker Gal4/UAS binære uttrykk system. Disse EGFP-merkede kjerner kan bli isolert ved hjelp av antistoffer mot GFP som er koplet til magnetiske kuler. Fremgangsmåten som beskrives i denne protokollen muliggjør jevn isolering av kjerner fra spesifikke celletyper i Drosophila larvesentralnervesystemet ved høy renhet og i tilstrekkelige nivåer for ekspresjon analyse, selv når disse celletypene utgjør mindre enn 2% av den totale cellepopulasjon i vev. Denne tilnærmingen kan brukes for å isolere kjernen fra et bredt utvalg av Drosophila embryo-og larvecelletyper ved å bruke spesifikke Gal4-drivere, og kan være nyttig for å isolere kjernen av celletyper som ikke er egnet for FACS eller laser mikrodisseksjon.

Repo-Gal4 driver (Bloomington lager nummer 7415) er spesielt uttrykt i gliacellene i Drosophila nervesystemet på flere stadier av utviklingen 18. Fluer ble generert som stabilt uttrykke UAS-EGFP :: Msp-300 KASH under kontroll av repo-Gal4 driveren ved hjelp av standard genetiske teknikker. Å karakterisere uttrykket mønster av EGFP :: KASH transgenet i disse fluene, ble mønsteret av GFP uttrykk i dissekert optisk lapp og øyet imaginal plate fra tredje stadium...

Watch this Scientific Journal Video about Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila vev inneholder ofte en heterogen blanding av celletyper. For å undersøke genekspresjon i spesifikke celletyper fra et bestemt vev, kan kjerner bli genetisk kodet og deretter isolert ved hjelp av en affinitets-baserte metode. Isolerte cellekjerner kan brukes til nedstrøms applikasjoner som genekspresjonsanalyse og kromatin immunoutfelling.

Affinity basert Isolering av Tagged Nuclei fra<em&gt; Drosophila</em&gt; Vev for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Genetics

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse av global RNA syntese på celle-nivå etter Hypoksi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...