Name: affinity-based isolation of tagged nuclei from drosophila tissues for gene expression analysis
Uploaded: 2014-03-25T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Vi tackar Janice Fischer för att tillhandahålla UAS-EGFP :: Msp-300 KASH plasmid. Den mAB24B10 antikropp erhölls från utvecklingsstudier Hybridoma Bank utvecklats under ledning av NICHDEN och underhålls av University of Iowa, Biologiska institutionen. Repo-GAL4 lager (BL7415) erhölls från Bloomington Stock Center vid Indiana University. Stöd från American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG # 58-006-53) till Purdue University Center for Cancer Research är tacksamma. Jingqun Ma stöds av en jordbruksforskning vid Purdue assistent i livsmedel och jordbruk från Purdue University.

1. Generation och karakterisering av EGFP :: KASH Drosophila <ol><li> Cross Gal4 förare flyger till UAS-EGFP :: Msp-300 KASH flugor. Alternativt kan rekombinanta flugor som bär både Gal4 förare och UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgen genereras med hjälp av vanliga genetiska tekniker. Det andra är en fördel om ett stort antal avkomma krävs. </li><li> Karaktärisera uttryck av EGFP :: KASH markör med användning av standard mikroskopi tekniker. OBS...

<ol>
	<li>Weake, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcription+initiation+function+of+the+ubiquitous+SAGA+complex+in+tissue-specific+gene+activation.">Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation.</a> Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).</li><li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+chromatin+immunoprecipitation+from+multicellular+complex+samples+using+BiTS-ChIP.">Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP.</a> Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).</li><li>Haenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+C.+elegans+intestinal+gene+expression+and+polyadenylation+by+fluorescence-activated+nuclei+sorting+and+3'-end-seq.">Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).</li><li>Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+contributions+of+the+nuclear+and+cytoplasmic+compartments+to+global+gene+expression+in+human+cells.">Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells.</a> BMC Genom. 8, 340 (2007).</li><li>Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+characterization+of+cell-specific+gene+expression+through+fluorescence-activated+sorting+of+nuclei.">Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei.</a> Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+gene+expression+and+chromatin+profiling+of+individual+cell+types+within+a+tissue.">A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue.</a> Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genom. Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+and+SUN+proteins.">KASH and SUN proteins.</a> Curr Biol. 21, 414-415 (2011).</li><li>Fischer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+klarsicht+has+distinct+subcellular+localization+domains+for+nuclear+envelope+and+microtubule+localization+in+the+eye.">Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye.</a> Genetics. 168, 1385-1393 (2004).</li><li>Patterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+Klarsicht+and+nuclear+lamin+in+developmentally+regulated+nuclear+migrations+of+photoreceptor+cells+in+the+Drosophila+eye.">The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+KASH+domain+protein+MSP-300+plays+an+essential+role+in+nuclear+anchoring+during+Drosophila+oogenesis.">The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis.</a> Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).</li><li>Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+klaroid+encodes+a+SUN+domain+protein+required+for+Klarsicht+localization+to+the+nuclear+envelope+and+nuclear+migration+in+the+eye.">Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye.</a> Fly. 1, 75-85 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).</li><li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS/PNS+transition+zone.">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).</li><li>Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+Drosophila+nervous+system.">Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).</li></ol>

Detta protokoll kan användas för att isolera eller mycket berika specifikt taggade kärnor från blandade cellpopulationer i Drosophila embryonala eller larver vävnader. Med hjälp av detta protokoll, kan kärnor isoleras från dissekerade vävnad i ca 1 timme. Renheten och utbytet av de isolerade kärnor skall bestämmas experimentellt för varje celltyp. Det kan vara svårt att kvantifiera de pärlbundna kärnor vid den post-isolering skede av protokoll med användning av en hemocytometer grund av pärlorn...

Drosophila vävnader såsom det centrala nervsystemet innehåller en komplex blandning av celltyper. Således, för att analysera cellspecifika genuttrycksprofilerna från Drosophila vävnader, är det först nödvändigt att isolera en homogen population av specifika celler i tillräcklig mängd för att möjliggöra tillämpningar i efterföljande led. Metoder för att isolera celler från intakta vävnader inkluderar laser mikrodissektion, och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) av hela celler. Medan FACS har använts för att isolera celler och kärnor från Drosophila embryon och från Caenorhabditis elegans för genexpression och kromatin profilering 1-3 kan FACS och laser mikrodissektion vara svår att utföra framgångsrikt i vävnader som innehåller starkt blandade celltyper eller som innehåller celler med oregelbunden morfologi, såsom neuroner. För att övervinna denna svårighet kan kärnor hellre än celler isoleras från specifika celltyper och användes för efterföljande allme uttrycksprofilering. Viktigt är microarray-baserad mRNA-expressionsanalys med hjälp av nukleära RNA-prover visar generellt jämförbara resultat som har den utförs med hjälp av total RNA 4, 5. Dessutom har genuttryck analys med användning av nukleära RNA med framgång använts för att studera genuttryck i flera organismer, inklusive C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila och människa 4, 5 2, 3. Flera metoder har nyligen beskrivits för isolering av specifika populationer av märkta kärnor från Drosophila vävnader som är lämpliga för genuttryck analys och / eller kromatin immunoprecipitation. Sats isolera vävnadsspecifika kromatin för immunoprecipitation (BITS-chip) metod utnyttjar FACS för att isolera fasta kärnor på basis av celltyp specifika uttryck av kärn-lokaliserad GFP 2. Denna strategi har varit successfully användas för att analysera fördelningen av histon modifieringar och transkriptionsfaktorer som använder kromatin immunoprecipitation av isolerade kärnor från mesoderm av Drosophila embryon 2. Dock kan FACS-baserade metoder vara mindre lämpad för isolering märkta kärnor som utgör endast en liten del av en blandad befolkning på grund av den ökade sorterings tid som behövs för att få lämpliga siffror för tillämpningar i senare led. För att övervinna dessa begränsningar har flera grupper utnyttjade affinitetsbaserade isoleringstekniker för att rena cellkärnor som är märkta med en specifik epitop i en speciell celltyp. Isoleringen av kärnor etikette i specifika celltyper metoden (intakt) utvecklats för användning i Arabidopsis thaliana 6, 7 har nyligen anpassats för användning i Drosophila 8. I denna metod är en kärnhöljet fusionsprotein som är ett substrat för in vivo-biotinylering coexpresSED med Escherichia coli biotin ligas BirA i specifika celltyper. Biotin-märkta kärnor kan därefter renas från blandade populationer med hjälp av streptavidin-baserade affinitet isolering. Med användning av detta tillvägagångssätt har kärnor framgångsrikt märkta och isoleras från mesoderm av Drosophila embryon, i vilken en kärnhöljet fusionsprotein som uttrycks under kontroll av en mesoderm-specifik enhancer 8. Författarna genereras också kärnhöljet fusionsproteiner som kan uttryckas i vilken celltyp som helst under kontroll av den Gal4-regulatorisk sekvens, UAS 9. Detta tillvägagångssätt är i stånd att snabbt isolera delmängder av märkta kärnor från blandade populationer, men kräver tre separata transgena konstrukt och kan därför vara olämplig för vissa genetiska tillämpningar. Nyligen har en metod beskrivits i vilken sön (S AD1-och FN-C-84)-domän-innehållande proteiner som lokaliseras till det inre membranet i kärnhöljet var märkta medfluorescerande proteiner och uttrycktes under kontroll av den Gal4/UAS systemet 10. Kärnor isolerades i närvaro av icke-jonisk detergent för avlägsnande av det yttre membranet av kärnhöljet, och affinitetsrenades med användning av magnetiska pärlor kopplade till anti-GFP-antikroppar. Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt använts för att isolera små populationer av märkta kärnor från specifika neuronala subtyper i den vuxna hjärnan i Drosophila 10. Här används ett protokoll för isolering av märkta kärnor från en blandad population av celler från Drosophila larv vävnad beskrivas. Denna metod har utvecklats oberoende av varandra, men liknar den metod som beskrivs av Henry et al. 10 Först var kärnor märkta med en fluorescerande etikett som uttrycks endast i specifika celltyper i Drosophila melanogaster för att underlätta efterföljande isolering av taggade kärnor från blandade populationer med hjälp av en affinitetsbaserad metod. För att märka kärnor,den KASH (K larsicht / A nc-1 / S yn h omology) domän utnyttjades. Den KASH domän är en transmembrandomän som lokaliserar till det yttre membranet av kärnhöljet, dels genom interaktioner med SUN domän som innehåller proteiner inom det perinukleära utrymmet 11. Den C-terminala KASH domänen av proteiner såsom Drosophila Msp-300 och Klarsicht förankrar dessa proteiner till den yttre nukleära membranet, medan deras N-terminala domäner interagerar med cytoskelettet proteiner såsom aktin eller mikrotubuli i cytoplasman 12-14. Konstruktioner som genererades i vilka KASH domänen av Drosophila Msp-300 fuserades till C-terminalen av EGFP, under styrning av Gal4-regulatorisk sekvens, UAS i pUAST-attB-vektor 15, 16. Använda phiC31 sätesspecifik integration, var transgena flugor genereras där UAS-EGFP :: Mspl-300 KASH transgen infördes i attP2 loci på kromosom3L 17. Yrkeshögskolan-EGFP :: Msp-300 KASH flugor kan korsas med flugor som uttrycker Gal4 föraren i en viss celltyp, vilket resulterar i den riktade uttrycket av EGFP på den yttre nukleära membranet i celltypen av intresse. Märkta kärnor kan sedan renas från blandade cellpopulationer med användning av antikroppar mot GFP kopplade till magnetiska pärlor. I detta tillvägagångssätt är användningen av nonjonisk detergent inte krävs eftersom EGFP taggen är lokaliserad till den cytoplasmiska sidan av det yttre kärnmembranet, och är därför tillgängliga för antikroppar. Protokollet som beskrivs nedan kan användas för att isolera / berika EGFP-märkta kärnor från specifika celltyper i Drosophila larver vävnader, för att kvantifiera renhet och utbyte av isolerade kärnor, och att utvinna kärn RNA lämplig för kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (QRT -PCR) genuttrycksanalys. Isoleringen och affinitetsrening av kärnor (exklusive tissue dissektion) kan utföras på mindre än en timme. Resultaten presenteras som visar att glial kärnor kan framgångsrikt isoleras från larvoptiska globen och ögon imaginal skiva, och användes för efterföljande analys av genuttryck. Man räknar med att denna strategi kommer att vara användbart för isolering / anrikning av märkta kärnor från embryonala och larv vävnader i vilka målceller utgör mindre än 5% av den totala befolkningen. Alla Drosophila lager och plasmider från denna studie finns tillgängliga från författarna på begäran.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1884">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td style="width:263px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:195px;">mAB24B10</td>
			<td style="width:828px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BEQPCR-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dounce Homogenizer (1 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62400-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Tweezers, 11 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td>This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EpiScript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>ERT12910K</td>
			<td><a href="http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon cell strainers, 40 &#956;m pore size</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-949</td>
			<td>Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LSKMAGS08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Mini tube rotator</td>
			<td style="width:263px;">Genemate</td>
			<td style="width:195px;">H-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:599px;">Qubit starter kit</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">Q32871</td>
			<td style="width:828px;">Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RNAsecure (Ambion)</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">AM7010</td>
			<td style="width:828px;">The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RT-PCR machine Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">CFX Connect Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Siliconized 9 well glass plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 - 460nm) excitation + yellow barrier</td>
			<td style="width:263px;">Nightsea</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td>This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:195px;">SMZ 745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf" >http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity-based isolation of tagged nuclei from drosophila tissues for gene expression analysis

Drosophila melanogaster embryon och larver vävnader innehåller ofta en mycket heterogen blandning av celltyper, som kan komplicera analysen av genuttryck i dessa vävnader. Således, för att analysera cellspecifika genuttrycksprofilerna från Drosophila vävnader, kan det vara nödvändigt att isolera specifika celltyper med hög renhet och i tillräckliga halter för tillämpningar i senare led, t.ex. transkriptionsprofilering och kromatin immunoprecipitation. Däremot kan den oregelbundna cellulär morfologi i vävnader såsom det centrala nervsystemet, i kombination med den sällsynta populationen av specifika celltyper i dessa vävnader, utgöra utmaningar för traditionella metoder för cellisolering såsom laser microdissection och fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) . Här visas ett alternativt tillvägagångssätt för att karakterisera cellspecifika genuttrycksprofilerna använder affinitetsbaserad isolering av märkta kärnor, snarare än hela celler, beskrivs. Kärnor i den specifika c.ell typ av intresse är genetiskt märkta med en kärnhöljet-lokaliserad EGFP tag hjälp av Gal4/UAS binära expressionssystem. Dessa EGFP-märkta kärnorna kan isoleras med användning av antikroppar mot GFP som är kopplade till magnetiska pärlor. Det tillvägagångssätt som beskrivs i detta protokoll möjliggör konsekvent isolering av kärnor från specifika celltyper i Drosophila larver centrala nervsystemet vid hög renhet och kan i tillräckliga nivåer för expressionsanalys, även när dessa celltyper omfattar mindre än 2% av den totala cellpopulationen i vävnad. Kan användas för detta tillvägagångssätt för att isolera kärnor från ett brett utbud av Drosophila embryonala och larvcelltyper med specifika Gal4 drivrutiner, och kan vara användbara för att isolera kärnor från celltyper som inte är lämpliga för FACS eller laser mikrodissektion.

Repo-GAL4 drivrutin (Bloomington lager nummer 7415) är specifikt uttrycks i gliaceller i Drosophila nervsystemet på flera utvecklingsstadier 18. Flugor genererades som stabilt uttrycker UAS-EGFP :: Msp-300 KASH under kontroll av repo-GAL4 förare med vanliga genetiska tekniker. Att karaktärisera expressionsmönstret av EGFP :: KASH transgenen i dessa flugor var mönstret av GFP-uttryck i den dissekerade optiska globen och ögon imaginal skivan från tredje ins...

Watch this Scientific Journal Video about Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila vävnader innehåller ofta en heterogen blandning av celltyper. För att undersöka genuttryck i specifika celltyper från en viss vävnad, kan kärnan vara genetiskt taggade och därefter isoleras med hjälp av en affinitetsbaserad metod. Enstaka kärnor kan användas för tillämpningar efter exempelvis genuttryck analys och kromatin immunoprecipitation.

Affinitetsbaserade Isolering av Tagged Kärnor från<em&gt; Drosophila</em&gt; Vävnader för Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Genetics

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriell Gene Expression Analysis Använda Microarrays

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

RNA Isolering från embryonala Zebrafish och cDNA syntes för Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Robotics och Dynamic bildanalys för studier av genuttryck i plantvävnader

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffininbäddade och frysta snitt av Drosophila Vuxen Muskler

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analys av global RNA syntes vid den inre cellnivå efter Hypoxi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...