Name: isolation of small noncoding rnas from human serum
Uploaded: 2014-06-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum at JoVE.com

معتمدة سامانثا خوري وباميلا Ajuyah من قبل جائزة الدراسات العليا الاسترالية. نود أيضا أن نعترف شبكة بالحركة أبحاث السرطان، لوي مركز أبحاث السرطان في جامعة نيو ساوث ويلز وحدة أبحاث السرطان الشمالية بالحركة لدعمهم إضافية من سامانثا خوري.

ملاحظة: عينات مصل الإنسان من المرضى الأصحاء أو المرضى الذين يعانون من السرطان تم الحصول عليها مع الموافقة المسبقة بموجب البروتوكولات المعتمدة الأخلاقية الإنسان من الأمير ألفريد الملكي مستشفى سيدني (عدد بروتوكول X10-0016 وHREC/10/RPAH/24) وجامعة للتكنولوجيا، سيدني. تم جمع عين?...

<ol>
	<li>Babu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+extraction+efficiency+of+small+RNAs+with+the+Agilent+2100+Bioanalyzer+and+the+Small+RNA+Kit.">Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit.</a> Agilent Application Note. , (2010).</li><li>Tran, N., Hutvagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+the+regulation+of+the+maturation+of+miRNAs.">Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs.</a> Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).</li><li>Chim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+placental+microRNAs+in+maternal+plasma.">Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma.</a> Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).</li><li>Lodes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cancer+with+serum+miRNAs+on+an+oligonucleotide+microarray.">Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>Burgos, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+extracellular+miRNA+in+human+cerebrospinal+fluid+by+next-generation+sequencing.">Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing.</a> RNA. 19, 712-722 (2013).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+miRNA+processing+and+expression+in+pleomorphic+adenomas+of+the+salivary+gland.">Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland.</a> Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction:+twenty-something+years+on.">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li><li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma.">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Murphy, N. R., Hellwig, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+nucleic+acid+organic+extraction+through+use+of+a+unique+gel+barrier+material.">Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material.</a> Biotechniques. 21, 934-936 (1996).</li><li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum.">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).</li><li>Ichikawa, M., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combination+of+Extraction+Reagent+and+DNA+Microarray+That+Allows+for+the+Detection+of+Global+MiRNA+Profiles+from+Serum/Plasma.">A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).</li><li>Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+preparations+from+individual+monogenean+Gyrodactylus+salaris-a+comparison+of+six+commercially+available+totalRNA+extraction+kits.">MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits.</a> BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).</li><li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).</li><li>McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Methods+for+miRNA+Extraction+from+Plasma+and+Quantitative+Recovery+of+RNA+from+Cerebrospinal+Fluid.">Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid.</a> Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).</li></ol>

سكان microRNAs يشكل حوالي 0.4-0.5٪ من الحمض النووي الريبي مجموع جدت في مصل الدم. مزيد من هناك أيضا ارتفاع محتوى البروتين وجدت في مصل الدم البشري. لتحسين RNA والبروتين والحد من كل الفينول يلوث قمنا بتعديل النهج Chomczynski التقليدية 9 مع إضافة العديد من الخطوات. <p class="jove_content" s...

في السنوات الأخيرة، كان هناك دفع المتزايد لاكتشاف مؤشرات حيوية جديدة للكشف المبكر عن الأمراض التي تصيب الإنسان. وقد تركز الكثير من الاهتمام على استخدام الرنا الصغيرة مثل microRNAs 2 (miRNAs أو ميرس) كعلامات محتملة. تم العثور على هذه الرناوات الصغيرة في سوائل الجسم مثل الدم والدراسات أظهرت أنها مقاومة للتدهور ومستقرة على مجموعة من الظروف البيئية المتباينة 3. ونظرا لهذه الميزات miRNAs، المصل أو المتداولة هي العلامات البيولوجية مثالية 4، 5. حاليا هناك نوعان من الأساليب الرئيسية لعزل الحمض النووي الريبي الصغيرة من السوائل البيولوجية. يستخدم النهج الأول التكنولوجيا القائمة على عمود لربط وأزل الرنا صغيرة 6، بينما يستخدم الأسلوب الثاني البروتوكول طويلة الأمد مع الفينول وثيوسيانات guanidinium الكواشف 7. وقد وضعنا بسيطة وفعالة وخالية من الأعمدة بروتوكول لعزل الرنا صغيرة من مصل الإنسان. الحمض النووي الريبي معزولة هو immediately صالحة للاستعمال في التطبيقات المصب، بما في ذلك صفائف قليل النوكليوتيد الحمض النووي RNA والتسلسل. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لأننا كنا نواجه العديد من القضايا عند استخدام الأساليب القائمة على الفينول لعزل الحمض النووي الريبي من المصل. وكثيرا ما يستخدم النهج Chomczynski التقليدية في معظم المختبرات مع مجموعة من الكواشف المتوفرة من معظم البائعين التجارية. ولكن النظر في استخدامها على نطاق واسع، لم يتم وضع مبادئ توجيهية صارمة لتنتج باستمرار جودة عالية من الحمض النووي الريبي سوائل الجسم، في الدم أو المصل معينة. المشاكل الشائعة المرتبطة عزل الحمض النووي الريبي من المصل تشمل عوائد منخفضة الحمض النووي الريبي والتلوث مع الكواشف المستخدمة خلال العزلة، ولا سيما الفينول. نهجنا نتخلص من هذه الملوثات الفينول لتوفير الحمض النووي الريبي جودة عالية لتحليل المصب مثل PCR الكمي (QPCR) والحمض النووي الريبي التسلسل. لدينا المزيد من اختبار هذا الحمض النووي الريبي على صفائف ميرنا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Name of the Material/Equipment&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Catalog Number&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Comments/ Description (optional)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Tri-Reagent RT LS</td>
			<td style="width:223px;">Molecular Research Centre, USA</td>
			<td style="width:123px;">TR 118</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:259px;">RNase free H20</td>
			<td style="width:223px;">GIBCO Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10977-023</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Proteinase K&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Finnzymes, Finland</td>
			<td style="width:123px;">EO0491</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Heavy Phaselock Tube</td>
			<td style="width:223px;">5PRIME</td>
			<td>2302830</td>
			<td style="width:248px;">2ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">DNA Lobind tube</td>
			<td style="width:223px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030 108.078</td>
			<td style="width:248px;">1.5ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Glycogen&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:123px;">10814-010</td>
			<td style="width:248px;">5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">RNA grade Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich, USA</td>
			<td style="width:123px;">I9516</td>
			<td style="width:248px;">100%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:223px;">John Morris</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Nanodrop UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">RNA grade Ethanol</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich, USA</td>
			<td style="width:123px;">E7023</td>
			<td style="width:248px;">70%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Agilent 2100 Bioanalyser</td>
			<td style="width:223px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of small noncoding rnas from human serum

تحليل الحمض النووي الريبي والتعبير هو سمة مشتركة في العديد من المختبرات. أهمية هو ظهور الرنا الصغيرة مثل microRNAs، والتي توجد في خلايا الثدييات. هذه الرناوات الصغيرة هي المنظمين الجينات القوية السيطرة على الممرات الحيوية مثل النمو والتنمية والموت والكثير من الاهتمام وقد وجهت في التعبير عنها في سوائل الجسم. ويرجع ذلك إلى التقلبات في الأمراض التي تصيب الإنسان مثل السرطان وإمكانية تطبيقها والمؤشرات الحيوية مصل هذا. ومع ذلك، فإن تحليل ميرنا التعبير في المصل قد يكون مشكلة. في معظم الحالات من كمية المصل يحد ويحتوي على كميات قليلة من المصل الحمض النووي الريبي مجموع، والتي تشكل الرنا صغيرة فقط 0.4-0.5٪ 1. وبالتالي عزل كميات كافية من نوعية الحمض النووي الريبي من المصل يشكل تحديا كبيرا للباحثين اليوم. في هذه الورقة التقنية، ونحن لشرح الطريقة التي يستخدم فقط 400 ميكرولتر من مصل الإنسان للحصول على الحمض النووي الريبي كافية لصفائف إما DNA أو تحليل QPCR. وعلىdvantages هذه الطريقة هي بساطتها والقدرة على انتاج الحمض النووي الريبي جودة عالية. لا يتطلب أي أعمدة متخصصة لتنقية الرنا صغيرة وتستخدم الكواشف العامة والأجهزة الموجودة في المختبرات المشتركة. يستخدم أسلوب لدينا قفل جل المرحلة للقضاء على التلوث الفينول بينما في نفس الوقت جودة عالية الغلة الحمض النووي الريبي. ونحن نقدم أيضا خطوة إضافية لمواصلة إزالة جميع الملوثات خلال الخطوة العزلة. هذا البروتوكول هو فعالة جدا في عزل الحمض النووي الريبي غلة إجمالية تصل إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر من المصل ولكن يمكن أيضا أن تتكيف لالأنسجة البيولوجية الأخرى.

يمثل الشكل 1 طيف الأشعة فوق البنفسجية / فيس نموذجية من الحمض النووي الريبي معزولة عن المصل. من هذا الملف لاحظنا التلوث البروتين في 280 نانومتر مع الفينول والملوثات العضوية على حد سواء في 270 نانومتر و 230 نانومتر، على التوالي. ولوحظ بقايا guanidinium ثيوسيانات أيضا في 2...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum at JoVE.com

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

يصف هذا البروتوكول وسيلة لاستخراج الرنا صغيرة من مصل الإنسان. وقد استخدمنا هذا الأسلوب لعزل microRNAs من مصل السرطان للاستخدام في صفائف الحمض النووي وأيضا singleplex PCR الكمي. بروتوكول يستخدم الفينول وثيوسيانات guanidinium الكواشف مع بعض التعديلات لانتاج الحمض النووي الريبي جودة عالية.

عزل الرنا غير المكودة الصغيرة من مصل الإنسان

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

عزل النواة من الخلايا العصبية البشرية تشريح أنسجة المخ

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

عزل الخلايا الجذعية من الإنسان Xenografts سرطان البنكرياس

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية الظهارية من الجلد البشري

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

عزل الخلايا الجذعية من دليل الدهنية المشتقة من Lipoaspirates الإنسان

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

عزل Myofibroblasts من الفأر والمرئ الإنسان

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

عزل القلب البطيني البشري من شرائح عضلة القلب المقطّع بالهزاز

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

عزل العدلات البشرية من الدم الكامل والمعاطف بافي

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

عزل الخلايا الظهارية من بصيلات الأسنان البشرية

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...