Name: isolation of small noncoding rnas from human serum
Uploaded: 2014-06-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum at JoVE.com

סמנתה חורי ופמלה Ajuyah נתמכים לאחר התואר הראשון בפרס האוסטרלי על ידי. אנחנו רוצים גם להכיר ברשת Translational חקר הסרטן, לואי מרכז לחקר הסרטן, אוניברסיטת ניו סאות&#39; ויילס והצפון Translational היחידה לחקר הסרטן לקבלת תמיכה הנוספת של סמנתה חורי.

שים לב: דגימות סרום אדם מחולים או חולים עם הסרטן בריאים התקבלו עם הסכמה מדעת לפי פרוטוקולים אתיים אדם שאושרו מהנסיך המלכותי אלפרד החולים סידני (מספר פרוטוקול X10-0016 וHREC/10/RPAH/24) והאוניברסיטה טכנולוגי, סידני. דגימות סרום שנאספו ממטופלים לפני הניתוח מבתי חולים שונים בסידנ...

<ol>
	<li>Babu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+extraction+efficiency+of+small+RNAs+with+the+Agilent+2100+Bioanalyzer+and+the+Small+RNA+Kit.">Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit.</a> Agilent Application Note. , (2010).</li><li>Tran, N., Hutvagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+the+regulation+of+the+maturation+of+miRNAs.">Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs.</a> Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).</li><li>Chim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+placental+microRNAs+in+maternal+plasma.">Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma.</a> Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).</li><li>Lodes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cancer+with+serum+miRNAs+on+an+oligonucleotide+microarray.">Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>Burgos, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+extracellular+miRNA+in+human+cerebrospinal+fluid+by+next-generation+sequencing.">Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing.</a> RNA. 19, 712-722 (2013).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+miRNA+processing+and+expression+in+pleomorphic+adenomas+of+the+salivary+gland.">Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland.</a> Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction:+twenty-something+years+on.">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li><li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma.">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Murphy, N. R., Hellwig, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+nucleic+acid+organic+extraction+through+use+of+a+unique+gel+barrier+material.">Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material.</a> Biotechniques. 21, 934-936 (1996).</li><li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum.">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).</li><li>Ichikawa, M., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combination+of+Extraction+Reagent+and+DNA+Microarray+That+Allows+for+the+Detection+of+Global+MiRNA+Profiles+from+Serum/Plasma.">A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).</li><li>Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+preparations+from+individual+monogenean+Gyrodactylus+salaris-a+comparison+of+six+commercially+available+totalRNA+extraction+kits.">MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits.</a> BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).</li><li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).</li><li>McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Methods+for+miRNA+Extraction+from+Plasma+and+Quantitative+Recovery+of+RNA+from+Cerebrospinal+Fluid.">Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid.</a> Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).</li></ol>

האוכלוסייה של מיקרו RNA מהווה כ 0.4-0.5% מרנ&quot;א הכל נמצא בסרום. בהמשך יש גם תכולת חלבון גבוהה שנמצאה בסרום אדם. כדי לשפר את RNA ולהפחית חלבון וגם פנול מזהם יש לנו שונה בגישה המסורתית Chomczynski 9 עם התוספת של כמה צעדים. RNA סה&quot;כ היה מבו?...

בשנים האחרונות, חלה דחיפה גוברת לגלות סמנים ביולוגיים חדשניים לגילוי המוקדם של מחלות בבני אדם. תשומת לב רבה התמקדה באמצעות RNA קטן כגון מיקרו RNA 2 (miRNAs או מירס) כסמנים פוטנציאליים. RNAs הקטן אלה נמצאים בנוזלי גוף כגון סרום ומחקרים הראו שהם עמידים לפירוק ויציבים על פני טווח של תנאים סביבתיים משתנים 3. בהתחשב miRNAs תכונות, הסרום או במחזור אלה הם הסמן הביולוגי האידיאלי 4, 5. נכון לעכשיו יש שתי גישות עיקריות לבידוד של RNA הקטן מנוזלים ביולוגיים. הגישה הראשונה משתמשת בטכנולוגיה מבוססת עמודה להיקשר וelute RNA הקטן 6, ואילו הגישה השנייה משתמשת בפרוטוקול ארוכת השנים עם חומרים כימיים פנול וthiocyanate guanidinium 7. פיתחנו פרוטוקול פשוט, יעיל, ללא עמודה כדי לבודד RNAs הקטן מסרום אדם. RNA הבודד הוא היא מידately שמיש ביישומים במורד הזרם, כוללים מערכי oligonucleotide DNA ורצף RNA. פרוטוקול זה פותח בגלל שאנחנו מתמודדים עם כמה בעיות בעת השימוש בשיטות המבוסס על פנול לבודד RNA מסרום. גישת Chomczynski המסורתית משמשת לעתים קרובות ברוב המעבדות עם מגוון של חומרים כימיים זמינים מרוב הספקים מסחריים. עם זאת שוקל השימוש הנרחב שלהם, הנחיות מחמירות שלא פותחו באופן עקבי לייצר RNA איכות גבוהה מנוזלי גוף, בדם או בסרום מסוים. בעיות נפוצות הקשורות לבידוד RNA מן הסרום כוללות תשואות RNA נמוכות וזיהום עם חומרים כימיים המשמשים בבידוד, במיוחד פנול. הגישה שלנו מבטלת מזהמים פנול אלה כדי לספק RNA באיכות גבוהה לניתוח במורד כגון PCR כמוני (qPCR) ורצף RNA. בדקנו עוד RNA זה על מערכי מירנה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Name of the Material/Equipment&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Catalog Number&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Comments/ Description (optional)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Tri-Reagent RT LS</td>
			<td style="width:223px;">Molecular Research Centre, USA</td>
			<td style="width:123px;">TR 118</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:259px;">RNase free H20</td>
			<td style="width:223px;">GIBCO Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10977-023</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Proteinase K&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Finnzymes, Finland</td>
			<td style="width:123px;">EO0491</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Heavy Phaselock Tube</td>
			<td style="width:223px;">5PRIME</td>
			<td>2302830</td>
			<td style="width:248px;">2ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">DNA Lobind tube</td>
			<td style="width:223px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030 108.078</td>
			<td style="width:248px;">1.5ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Glycogen&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:123px;">10814-010</td>
			<td style="width:248px;">5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">RNA grade Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich, USA</td>
			<td style="width:123px;">I9516</td>
			<td style="width:248px;">100%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:223px;">John Morris</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Nanodrop UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">RNA grade Ethanol</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich, USA</td>
			<td style="width:123px;">E7023</td>
			<td style="width:248px;">70%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Agilent 2100 Bioanalyser</td>
			<td style="width:223px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of small noncoding rnas from human serum

הניתוח של RNA והביטוי שלה הוא תכונה נפוצה במעבדות רבות. משמעות היא הופעתה של RNA קטן כמו מיקרו RNA, אשר נמצאים בתאי יונקים. RNAs הקטן אלה הם רגולטורים גן עוצמה שליטה מסלולים חיוניים כגון צמיחה, פיתוח ומוות ועניין רב כבר מופנים כלפי הביטוי שלהם בנוזלי גוף. זאת בשל חוסר הוויסות שלהם במחלות בבני אדם כגון סרטן ויישום הפוטנציאל שלהם כסמנים ביולוגיים בסרום. עם זאת, הניתוח של ביטוי מירנה בסרום עשוי להיות בעייתי. ברוב המקרים הסכום של סרום הוא להגביל וסרום מכיל כמויות נמוכות של רנ&quot;א הכל, מתוכם RNAs הקטן מהווים 0.4-0.5 1% בלבד. לכן הבידוד של כמויות מספיקות של RNA האיכותי מסרום הוא אתגר גדול לחוקרים כיום. במאמר זה טכני, אנחנו מדגימים שיטה שבה משתמשת רק 400 μl של סרום אנושי להשיג RNA מספיק לאף אחד ממערכי ה-DNA או ניתוח qPCR.dvantages של שיטה זו הוא הפשטות והיכולת להניב RNA באיכות הגבוהה שלה. זה לא דורש עמודות מיוחדות עבור טיהור של RNA הקטן ומנצל חומרים כימיים בכלל וחומרה שנמצאו במעבדות משותפות. השיטה שלנו מנצלת שלב נעילת ג&#39;ל כדי למנוע זיהום פנול ואילו באותו הזמן מניב RNA באיכות גבוהה. גם אנחנו מציגים את צעד נוסף כדי להסיר את כל המזהמים נוספים במהלך שלב הבידוד. פרוטוקול זה הוא יעיל מאוד בבידוד תשואות של RNA הכולל של עד 100 ng / μl מסרום, אבל יכול גם להיות מותאם לרקמות ביולוגיות אחרות.

איור 1 מייצג ספקטרום UV / Vis טיפוסי של רנ&quot;א מבודד מסרום. מפרופיל זה שציינו זיהום חלבון בננומטר 280 עם פנול ומזהמים אורגניים הן ב270 ננומטר ו230 ננומטר, בהתאמה. thiocyanate guanidinium שאריות היה גם ציין ב260 ננומטר. כדי להפחית את המזהמים, בשורה של צעדי אופטימיזציה נעשו הליך RT-LS...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum at JoVE.com

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת RNA קטן מסרום אדם. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי לבודד מיקרו RNA בסרום מהסרטן לשימוש במערכי ה-DNA וגם PCR כמו singleplex. הפרוטוקול מנצל ריאגנטים פנול וthiocyanate guanidinium עם שינויים להניב RNA באיכות גבוהה.

בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

בידוד של נויטרופילים אנושיים מדמם שלם ומעילי באפי

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

בידוד תאי אפיתל מזקיקי השיניים האנושיים

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...