Name: isolation of small noncoding rnas from human serum
Uploaded: 2014-06-19T13:00:00
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サマンサKhouryさんとパメラAjuyahはオーストラリアの大学院賞でサポートされています。また、サマンサKhouryさんの彼らの追加サポートのためにトランスレーショナルがん研究ネットワーク、ホリボシルトランスフェラーゼがん研究センター、ニューサウスウェールズ大学と北トランスレーショナルがん研究ユニットを認識したいと思います。

注意：健康な患者や癌患者からのヒト血清サンプルを、ロイヤルプリンスアルフレッド病院シドニー（プロトコル番号X10-0016およびHREC/10/RPAH/24）技術大学から認可された人間の倫理的なプロトコルの下でインフォームドコンセントが得られたシドニー。血清試料は、種々のシドニーの病院から手術前に患者から採取し、-80℃で貯蔵中に入れた血清から1。スモールRNAの単離</...

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	<li>Babu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+extraction+efficiency+of+small+RNAs+with+the+Agilent+2100+Bioanalyzer+and+the+Small+RNA+Kit.">Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit.</a> Agilent Application Note. , (2010).</li><li>Tran, N., Hutvagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+the+regulation+of+the+maturation+of+miRNAs.">Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs.</a> Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).</li><li>Chim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+placental+microRNAs+in+maternal+plasma.">Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma.</a> Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).</li><li>Lodes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cancer+with+serum+miRNAs+on+an+oligonucleotide+microarray.">Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>Burgos, K. 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Biochem. 162, 156-159 (1987).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+miRNA+processing+and+expression+in+pleomorphic+adenomas+of+the+salivary+gland.">Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland.</a> Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction:+twenty-something+years+on.">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li><li>Kirschner, M. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum.">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).</li><li>Ichikawa, M., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combination+of+Extraction+Reagent+and+DNA+Microarray+That+Allows+for+the+Detection+of+Global+MiRNA+Profiles+from+Serum/Plasma.">A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).</li><li>Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+preparations+from+individual+monogenean+Gyrodactylus+salaris-a+comparison+of+six+commercially+available+totalRNA+extraction+kits.">MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits.</a> BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).</li><li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).</li><li>McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Methods+for+miRNA+Extraction+from+Plasma+and+Quantitative+Recovery+of+RNA+from+Cerebrospinal+Fluid.">Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid.</a> Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).</li></ol>

マイクロRNAの集団は、血清中に見出される総RNAの約0.4から0.5パーセントを構成する。さらに、ヒト血清中に見出される高タンパク質含量もある。 RNAを改善し、タンパク質とフェノールの両方を低減するために、我々はいくつかのステップを追加して、伝統的なアプローチをChomczynski 9を変更した汚染する。 全RNAを、標準的なトライ試薬RT-LS（モレキュラー·リサー...

近年、ヒト疾患の早期発見のための新規なバイオマーカーを発見するためのプッシュ成長があった。注目は、潜在的なマーカーのようなマイクロRNA 2（miRNAまたはのmiR）などの小さなRNAを使用して注目されている。これらの小さなRNAは、血清や研究などの体液で発見され、彼らが劣化し弾力性であり、様々な環境条件3の範囲に渡って安定しているが示されている。これらの機能は、血清中のmiRNAもしくは循環所与の理想的なバイオマーカー4,5である。現在、生物学的液体から小さなRNAの単離には主に2つのアプローチがあります。第二のアプローチは、フェノールとグアニジンチオシアネート試薬7との長年のプロトコルを使用しながら、最初のアプローチは、小さなRNA 6と結合し 、溶出するために、列ベースの技術を使用しています。我々は、ヒト血清からの低分子RNAを単離するための、シンプルで効果的な、列のないプロトコルを開発した。単離されたRNAは、直ちにですDNAオリゴヌクレオチド配列とRNAの塩基配列決定を含む下流の用途でately使用可能。 血清からRNAを単離するために、フェノールベースの​​方法を使用するときに我々はいくつかの問題に直面していたため、このプロトコルが開発されました。伝統をChomczynskiアプローチは頻繁にほとんどの商用ベンダーから入手可能な試薬の範囲で最も研究室で使用されています。しかしながら、それらの普及を考慮し、ストリンジェントなガイドラインは、一貫して、特定の血液または血清中に、体液からの高品質のRNAを産生するために開発されていない。 血清からRNAを単離に関連する一般的な問題は、低RNAの収量と分離、特にフェノールの際に使用する試薬の混入が含まれています。我々のアプローチは、例えば、定量的PCR（qPCR）およびRNA配列決定などの下流の分析のための高品質のRNAを提供するために、これらのフェノールの汚染物質を除去する。我々はさらに、miRNAアレイ上で、このRNAをテストしている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Name of the Material/Equipment&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Catalog Number&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Comments/ Description (optional)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Tri-Reagent RT LS</td>
			<td style="width:223px;">Molecular Research Centre, USA</td>
			<td style="width:123px;">TR 118</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:259px;">RNase free H20</td>
			<td style="width:223px;">GIBCO Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10977-023</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Proteinase K&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Finnzymes, Finland</td>
			<td style="width:123px;">EO0491</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Heavy Phaselock Tube</td>
			<td style="width:223px;">5PRIME</td>
			<td>2302830</td>
			<td style="width:248px;">2ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">DNA Lobind tube</td>
			<td style="width:223px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030 108.078</td>
			<td style="width:248px;">1.5ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Glycogen&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:123px;">10814-010</td>
			<td style="width:248px;">5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">RNA grade Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich, USA</td>
			<td style="width:123px;">I9516</td>
			<td style="width:248px;">100%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:223px;">John Morris</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Nanodrop UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">RNA grade Ethanol</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich, USA</td>
			<td style="width:123px;">E7023</td>
			<td style="width:248px;">70%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Agilent 2100 Bioanalyser</td>
			<td style="width:223px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of small noncoding rnas from human serum

RNAおよびその発現の分析は多くの研究室では一般的な機能です。重要なのは、哺乳動物細胞で発見されたマイクロRNAのような低分子RNAの登場です。これらの小さなRNAは、強力な遺伝子調節因子は、成長、開発、死などの重要な経路を制御し、大きな関心される体液中のそれらの発現に向けられてきた。これは、がんや血清バイオマーカーとしての可能性アプリケーションとしてのヒトの疾患での調節不全が原因です。しかしながら、血清中のmiRNA発現の分析は問題となり得る。ほとんどの場合、血清の量が制限され、血清は、小さなRNAが唯一の0.4から0.5パーセント1を構成する総RNAを少量含まれています。このように血清から品質のRNAの十分な量の単離は、今日の研究者にとって大きな課題となっています。この技術的な研究では、DNAアレイまたはqPCR分析のどちらかのために十分なRNAを得るために、ヒト血清のわずか400μLを使用する方法を示しています。 Aこの方法のdvantagesは、その単純さと高品質のRNAを得る能力である。それは、小さなRNAの精製のための特殊な列を必要とせず、一般的な研究室で見つかった一般的な試薬およびハードウェアを利用しています。我々の方法は、同時に、高品質のRNAを得ながら、フェノールの混入を排除するために、フェーズロックゲルを利用する。また、さらに、分離工程の間に、すべての汚染物質を除去するために追加のステップをご紹介します。このプロトコルは、血清から最大100 ngの/μlの総RNAの収量を単離するのに非常に有効であるだけでなく、他の生体組織に適合させることができる。

図1は、血清から単離されたRNAの典型的なUV /可視スペクトルを示している。このプロファイルから、我々はそれぞれ、両方の270 nmおよび230 nmにおけるフェノール及び有機汚染物質との280 nmでタンパク質の混入を指摘した。残留グアニジンチオシアネートも260 nmで注目された。汚染物質を減らすために、最適化の一連の工程は、標準的なトライ試薬RT-LSプロシージャに作製した。我...

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Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

このプロトコルは、ヒト血清から低分子RNAを抽出するための方法が記載されている。私たちは、DNAアレイで使用するために、がん血清からマイクロRNAを分離してもシングルプレックス定量PCRするために、このメソッドを使用している。プロトコルは、高品質のRNAを得るために変更を加えてフェノール及びグアニジニウムチオシアネート試薬を利用する。

ヒト血清から小非コードRNAの分離

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

人間の死後の脳組織から神経細胞核の単離

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

ヒト膵臓癌異種移植片由来の幹細胞の分離

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

人間の脂肪吸引物からの脂肪由来幹細胞を手動で隔離

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

マウスおよびヒト結腸組織からの一次筋線維芽細胞の分離

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

マウスおよびヒト食道から筋線維芽細胞の単離

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

ビブラートムカット心筋切れ切り切れからヒト心室心筋細胞を分離

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

全血とバフィーコートからのヒト好中球の分離

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

ヒト歯包からの上皮細胞の分離

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...