Name: isolation of small noncoding rnas from human serum
Uploaded: 2014-06-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum at JoVE.com

Samantha Khoury og Pamela Ajuyah støttes av den australske Graduate Award. Vi ønsker også å erkjenne Translasjons Cancer Research Network, Lowy Cancer Research Centre, University of New South Wales og Nord-translasjonell kreftforskning Enhet for deres ekstra støtte av Samantha Khoury.

Merk: Human serumprøver fra friske pasienter eller pasienter med kreft ble oppnådd med informert samtykke under godkjente menneskelige etiske protokoller fra Royal Prince Alfred Hospital Sydney (Protokoll nummer X10-0016 og HREC/10/RPAH/24) og University of Technology, Sydney. Serumprøver ble samlet fra pasienter før kirurgi fra forskjellige Sydney sykehus og plassert i lagring ved -80 ° C. 1.. Small RNA Isolation from Serum Total RNA ble fremstilt fra humant ...

<ol>
	<li>Babu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+extraction+efficiency+of+small+RNAs+with+the+Agilent+2100+Bioanalyzer+and+the+Small+RNA+Kit.">Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit.</a> Agilent Application Note. , (2010).</li><li>Tran, N., Hutvagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+the+regulation+of+the+maturation+of+miRNAs.">Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs.</a> Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).</li><li>Chim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+placental+microRNAs+in+maternal+plasma.">Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma.</a> Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).</li><li>Lodes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cancer+with+serum+miRNAs+on+an+oligonucleotide+microarray.">Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>Burgos, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+extracellular+miRNA+in+human+cerebrospinal+fluid+by+next-generation+sequencing.">Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing.</a> RNA. 19, 712-722 (2013).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+miRNA+processing+and+expression+in+pleomorphic+adenomas+of+the+salivary+gland.">Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland.</a> Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction:+twenty-something+years+on.">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li><li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma.">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Murphy, N. R., Hellwig, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+nucleic+acid+organic+extraction+through+use+of+a+unique+gel+barrier+material.">Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material.</a> Biotechniques. 21, 934-936 (1996).</li><li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum.">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).</li><li>Ichikawa, M., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combination+of+Extraction+Reagent+and+DNA+Microarray+That+Allows+for+the+Detection+of+Global+MiRNA+Profiles+from+Serum/Plasma.">A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).</li><li>Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+preparations+from+individual+monogenean+Gyrodactylus+salaris-a+comparison+of+six+commercially+available+totalRNA+extraction+kits.">MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits.</a> BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).</li><li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).</li><li>McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Methods+for+miRNA+Extraction+from+Plasma+and+Quantitative+Recovery+of+RNA+from+Cerebrospinal+Fluid.">Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid.</a> Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).</li></ol>

Populasjonen av microRNAs utgjør omtrent 0,4 til 0,5% av det totale RNA som finnes i serum. Videre er det også et høyt proteininnhold som finnes i humant serum. For å forbedre RNA og redusere både protein-og fenol forurenser vi har modifisert den tradisjonelle Chomczynski tilnærmingen 9 med tillegg av flere trinn. Total RNA ble isolert fra serum ved hjelp av standard Tri-Reagent RT-LS (Molecular Research Centre) men når utført i vårt laboratorium, denne metoden ga RNA i s...

I de senere årene har det vært en økende trykk for å oppdage nye biomarkører for tidlig deteksjon av menneskelige sykdommer. Mye oppmerksomhet har vært fokusert på å bruke små RNA som microRNAs 2 (mirnas eller Mirs) som potensielle markører. Disse små RNA er funnet i kroppsvæsker som serum, og studier har vist at de er motstandsdyktige mot nedbrytning, og er stabile over et område av varierende miljøforhold 3. Gitt disse funksjonene, serum eller sirkulerende mirnas er den ideelle biomarkør fire, fem. Foreløpig er det to hovedtilnærminger for isolering av små RNA fra biologiske væsker. Den første metode anvender en kolonne basert teknologi for å binde og eluere de små RNA 6, mens den andre fremgangsmåten anvender den langvarige protokoll med fenol-og guanidinium thiocyanate reagenser 7. Vi har utviklet en enkel, effektiv, kolonne frie protokollen til å isolere små RNA fra humant serum. Den isolerte RNA er umiddelbart brukbare i nedstrøms applikasjoner, inkludert DNA oligonukleotid arrays og RNA sekvensering. Denne protokollen ble utviklet fordi vi ble konfrontert med flere problemer ved bruk av fenol-baserte metoder for å isolere RNA fra serum. Den tradisjonelle Chomczynski tilnærmingen er hyppig brukt i de fleste laboratorier med et utvalg av reagenser tilgjengelige fra de fleste kommersielle leverandørene. Men vurderer sin utbredt bruk, strenge retningslinjer har ikke blitt utviklet for å produsere konsekvent høy kvalitet RNA fra kroppsvæsker, spesielt blod eller serum. Vanlige problemer forbundet med å isolere RNA fra serum inkluderer lav RNA avkastning og forurensning med reagenser brukt under isolasjon, spesielt fenol. Vår tilnærming eliminerer disse fenol forurensninger for å gi høy kvalitet RNA for nedstrøms analyse som kvantitativ PCR (qPCR) og RNA sekvensering. Vi har videre testet dette RNA på miRNA arrays.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Name of the Material/Equipment&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Catalog Number&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Comments/ Description (optional)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Tri-Reagent RT LS</td>
			<td style="width:223px;">Molecular Research Centre, USA</td>
			<td style="width:123px;">TR 118</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:259px;">RNase free H20</td>
			<td style="width:223px;">GIBCO Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10977-023</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Proteinase K&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Finnzymes, Finland</td>
			<td style="width:123px;">EO0491</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Heavy Phaselock Tube</td>
			<td style="width:223px;">5PRIME</td>
			<td>2302830</td>
			<td style="width:248px;">2ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">DNA Lobind tube</td>
			<td style="width:223px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030 108.078</td>
			<td style="width:248px;">1.5ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Glycogen&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:123px;">10814-010</td>
			<td style="width:248px;">5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">RNA grade Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich, USA</td>
			<td style="width:123px;">I9516</td>
			<td style="width:248px;">100%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:223px;">John Morris</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Nanodrop UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">RNA grade Ethanol</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich, USA</td>
			<td style="width:123px;">E7023</td>
			<td style="width:248px;">70%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Agilent 2100 Bioanalyser</td>
			<td style="width:223px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of small noncoding rnas from human serum

Analyse av RNA og dets ekspresjon er et vanlig trekk i mange laboratorier. Av betydning er fremveksten av små RNA som microRNAs, som finnes i pattedyrceller. Disse små RNA er potente genet regulatorer styrer vitale trasé som vekst, utvikling og død, og mye interesse har vært rettet mot deres uttrykk i kroppsvæsker. Dette er på grunn av deres feilregulering i humane sykdommer så som kreft, og deres potensielle anvendelse som serum biomarkører. Imidlertid kan analysen av miRNA ekspresjon i serum være problematisk. I de fleste tilfeller er mengden av serum er begrensende og serum inneholder lave mengder av total RNA, hvorav små RNA utgjør bare 0,4 til 0,5% 1. Således isolering av tilstrekkelige mengder av kvalitet RNA fra serum er en stor utfordring for forskere i dag. I dette teknisk papir, vi demonstrere en metode som bruker bare 400 mL av humant serum for å innhente tilstrekkelig RNA for enten DNA-matriser eller qPCR analyser. Den endvantages ved denne metoden er dens enkelhet og evne til å gi høy kvalitet RNA. Det krever ingen spesielle kolonner for rensing av små RNA og benytter generelle reagenser og maskinvare som finnes i vanlige laboratorier. Vår metode anvender en faselåst gel for å fjerne fenol forurensning mens den på samme tid gir høy kvalitet RNA. Vi introduserer også et ekstra trinn for ytterligere å fjerne alle forurensninger under isolasjonstrinnet. Denne protokollen er svært effektiv i å isolere utbytter av totale RNA på opptil 100 ng / mL av serum, men kan også tilpasses for andre biologiske vev.

Fig. 1 representerer en typisk UV / Vis spekteret av RNA isolert fra serum. Fra denne profilen vi bemerket protein forurensning på 280 nm med fenol og organiske miljøgifter både på 270 nm og 230 nm, henholdsvis. Rester guanidiniumtiocyanat ble også bemerket ved 260 nm. For å redusere forurensninger, ble en serie av optimaliseringsfremgangsmåten vises til standard Tri-Reagent RT-LS prosedyre. Vi tilsatt 5 mg / ml glykogen å øke både den totale RNA-utbyttet og redusere forurensning (sort linje, ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum at JoVE.com

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for ekstraksjon av små RNA fra humant serum. Vi har brukt denne metoden for å isolere microRNAs fra kreft serum til bruk i DNA-arrays og også singleplex kvantitativ PCR. Protokollen benytter fenol og guanidiniumtiocyanat reagenser med modifikasjoner å vike høy kvalitet RNA.

Isolering av Small kodende RNA fra Menneskelig Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Utledning av Human Cardiac Forstadier og cardiomyocytes fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manuell Isolering av adipose-avledet stamceller fra menneske Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolering av primær myofibroblasts fra Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolering av myofibroblasts fra Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolering av humane ventrikulære kardiomyocytter fra vibratom-cut myokardskiver

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Isolering av humane nøytrofiler fra fullblod og buffyfrakker

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

Isolering av epitelceller fra human tannsekk

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...