Name: isolation of small noncoding rnas from human serum
Uploaded: 2014-06-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum at JoVE.com

Саманта Хури и Памела Ajuyah поддерживаются Австралийской последипломного премии. Мы также хотели бы выразить признательность за трансляционных исследований рака Сеть, Лоуи исследования рака центр, Университет Нового Южного Уэльса и исследования рака Unit Северная Поступательное для их дополнительной поддержки Саманта Хури.

Примечание: образцы сыворотки крови человека от здоровых пациентов или пациентов с раком были получены с информированного согласия при утвержденных этических протоколов человека от Королевского больница Принца Альфреда Сиднее (протокол номер X10-0016 и HREC/10/RPAH/24) и Технологическом униве...

<ol>
	<li>Babu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+extraction+efficiency+of+small+RNAs+with+the+Agilent+2100+Bioanalyzer+and+the+Small+RNA+Kit.">Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit.</a> Agilent Application Note. , (2010).</li><li>Tran, N., Hutvagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+the+regulation+of+the+maturation+of+miRNAs.">Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs.</a> Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).</li><li>Chim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+placental+microRNAs+in+maternal+plasma.">Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma.</a> Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).</li><li>Lodes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cancer+with+serum+miRNAs+on+an+oligonucleotide+microarray.">Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>Burgos, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+extracellular+miRNA+in+human+cerebrospinal+fluid+by+next-generation+sequencing.">Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing.</a> RNA. 19, 712-722 (2013).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+miRNA+processing+and+expression+in+pleomorphic+adenomas+of+the+salivary+gland.">Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland.</a> Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction:+twenty-something+years+on.">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li><li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma.">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Murphy, N. R., Hellwig, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+nucleic+acid+organic+extraction+through+use+of+a+unique+gel+barrier+material.">Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material.</a> Biotechniques. 21, 934-936 (1996).</li><li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum.">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).</li><li>Ichikawa, M., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combination+of+Extraction+Reagent+and+DNA+Microarray+That+Allows+for+the+Detection+of+Global+MiRNA+Profiles+from+Serum/Plasma.">A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).</li><li>Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+preparations+from+individual+monogenean+Gyrodactylus+salaris-a+comparison+of+six+commercially+available+totalRNA+extraction+kits.">MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits.</a> BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).</li><li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).</li><li>McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Methods+for+miRNA+Extraction+from+Plasma+and+Quantitative+Recovery+of+RNA+from+Cerebrospinal+Fluid.">Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid.</a> Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).</li></ol>

Популяция микроРНК составляет примерно 0,4-0,5% от общей РНК, найденного в сыворотке крови. Кроме того есть также высокое содержание белка, обнаруженного в сыворотке крови человека. Для улучшения РНК и снизить как белок и фенола загрязняет мы изменили традиционный подход Chomczynski 9 с д?...

В последние годы наблюдается растущий нажим для того чтобы обнаружить новые биомаркеры для раннего выявления заболеваний человека. Большое внимание было сосредоточено на использовании малых РНК, такие как микроРНК 2 (микроРНК или Мирс) в качестве потенциальных маркеров. Эти малые РНК находятся в жидкостях организма, таких как сыворотка и исследования показали, что они устойчивы к деградации и стабильны в широком диапазоне различных условий окружающей среды 3. Учитывая эти особенности, сыворотки или циркулирующие микроРНК являются идеальным биомаркеров 4, 5. В настоящее время существует два основных подхода к выделению малых РНК из биологических жидкостей. Первый подход использует технологию столбца на основе связывать и вымывания малые РНК 6, в то время как второй подход использует давние протокол с фенолом и гуанидиния тиоцианатных реагентов 7. Мы разработали простой и эффективный, колонка без протокола, чтобы изолировать малые РНК из сыворотки крови человека. Выделенный РНК немедленноленно использовать в последующих применений, в том числе олигонуклеотидных ДНК массивов и РНК последовательности. Этот протокол был разработан, потому что мы столкнулись с несколькими вопросами при использовании на основе фенола методы, чтобы изолировать РНК из сыворотки. Традиционный подход Chomczynski часто используется в большинстве лабораторий с диапазоном реагентов, доступных на большинстве коммерческих поставщиков. Однако, учитывая их широкое применение, строгие правила не были разработаны, чтобы постоянно производить высококачественный РНК из жидкостей организма, в частности, крови или сыворотке. Общие проблемы, связанные с выделения РНК из сыворотки включают низкие урожаи РНК и загрязнения с реагентов, используемых в процессе выделения, в частности фенола. Наш подход устраняет эти фенольные загрязнений обеспечить высокое качество РНК для последующей анализа, таких как количественной ПЦР (КПЦР) и РНК последовательности. Далее мы тестировалась РНК на массивах микроРНК.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Name of the Material/Equipment&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Catalog Number&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Comments/ Description (optional)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Tri-Reagent RT LS</td>
			<td style="width:223px;">Molecular Research Centre, USA</td>
			<td style="width:123px;">TR 118</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:259px;">RNase free H20</td>
			<td style="width:223px;">GIBCO Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10977-023</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Proteinase K&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Finnzymes, Finland</td>
			<td style="width:123px;">EO0491</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Heavy Phaselock Tube</td>
			<td style="width:223px;">5PRIME</td>
			<td>2302830</td>
			<td style="width:248px;">2ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">DNA Lobind tube</td>
			<td style="width:223px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030 108.078</td>
			<td style="width:248px;">1.5ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Glycogen&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:123px;">10814-010</td>
			<td style="width:248px;">5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">RNA grade Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich, USA</td>
			<td style="width:123px;">I9516</td>
			<td style="width:248px;">100%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:223px;">John Morris</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Nanodrop UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">RNA grade Ethanol</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich, USA</td>
			<td style="width:123px;">E7023</td>
			<td style="width:248px;">70%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Agilent 2100 Bioanalyser</td>
			<td style="width:223px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of small noncoding rnas from human serum

Анализ РНК и ее выражения является общей чертой во многих лабораториях. Важное значение имеет появление малых РНК, как микроРНК, которые находятся в клетках млекопитающих. Эти малые РНК являются мощными регуляторами ген, контролирующий жизненные пути, такие как рост, развитие и смерть и большим интересом была направлена ​​на их выражения в жидкостях организма. Это связано с их регуляции в человеческих заболеваний, таких как рак и их потенциального применения в качестве сыворотки биомаркеров. Тем не менее, анализ микроРНК выражения в сыворотке может быть проблематичным. В большинстве случаев количество сыворотки ограничения и сыворотка содержит небольшое количество общей РНК, из которых малые РНК составляют лишь 0,4-0,5% 1. Таким образом, изоляция достаточного количества качественного РНК из сыворотки является основной проблемой для исследователей сегодня. В этом техническом документе, мы демонстрируем метод, который использует только 400 мкл сыворотки крови человека, чтобы получить достаточную РНК или для массивов ДНК или анализа КПЦР.dvantages этого метода являются его простота и способность приносить высокое качество РНК. Она не требует специализированных колонки для очистки малых РНК и использует общие реагенты и оборудование, найденные в общих лабораториях. Наша методика использует блокировки гель фазу для устранения загрязнения фенола в то же время получают высокое качество РНК. Мы также ввести дополнительный шаг для дальнейшего удаления все загрязнения во время стадии выделения. Этот протокол является очень эффективным при выделении выходы общей РНК до 100 нг / мкл из сыворотки, но также могут быть адаптированы для других биологических тканей.

Рисунок 1 представляет собой типичный UV / VIS спектр РНК, выделенной из сыворотки. Из этого профиля уже отмечалось загрязнения белка при 280 нм с фенолом и органических загрязнений и при 270 нм и 230 нм, соответственно. Остаток гуанидиния Тиоцианат Было также отмечено, при 260 нм. Для ум?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum at JoVE.com

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Этот протокол описан способ извлечения малые РНК из сыворотки крови человека. Мы использовали этот метод, чтобы изолировать микроРНК от рака сыворотки для использования в массивах ДНК, а также однокомпонентных количественной ПЦР. Протокол использует фенола и гуанидиния тиоцианат реагенты с изменениями, и получают высокое качество РНК.

Выделение малых некодирующих РНК из сыворотки крови человека

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Изоляция нейронов ядра из человеческих тканей мозга Посмертные

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Выделение стволовых клеток из прав ксенотрансплантаты рака поджелудочной железы

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Выделение и культуры взрослых Эпителиальные стволовые клетки из человеческой кожи

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Эффективное Вывод прав Сердечная Прекурсоры и кардиомиоциты из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Руководство Выделение полученные из жировой ткани стволовые клетки из человека Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Выделение первичных Миофибробласты из мышиных и человеческих ткань толстой кишки

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Выделение Миофибробласты из мышиных и человеческих пищевода

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Изоляция желудочковых кардиомиоцитов человека от ломтиков миокарда вибромы

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Выделение нейтрофилов человека из цельной крови и пальто Баффи

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

Выделение эпителиальных клеток из зубного фолликула человека

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...