Name: purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein expressed in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2014-05-10T15:00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Эта работа финансировалась американским Муковисцидоз Фонда (CFF) через свою CFTR 3D Consortium структуры. TR финансировалось за счет Великобритании CF Целевой студенчества и NC на студенчества Великобритании BBSRC. Мы признаем, наших коллег в структуре консорциума CFF CFTR 3D для их помощью и советом, и для конструкции курица последовательности CFTR и очистки тегов кодон-оптимизированный.

<ol>
	<li>Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+(ABCC7)+is+a+hydrolyzable-ligand-gated+channel.">CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel.</a> Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).</li><li>Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+and+survival+in+the+UK:+1947-2003.">Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003.</a> EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).</li><li>O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis.">Cystic fibrosis.</a> Lancet. 373, 1891-1904 (2009).</li><li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+chromosome+walking+and+jumping.">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245, 1059-1065 (1989).</li><li>Kariya, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+CFTR+in+the+elevation+of+glutathione+levels+in+the+lung+by+oral+glutathione+administration.">A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).</li><li>Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+is+the+primary+known+apical+glutathione+transporter+involved+in+cigarette+smoke-induced+adaptive+responses+in+the+lung.">CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung.</a> Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).</li><li>Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+cystic+fibrosis+pathology:+lack+of+transport+of+glutathione+and+its+thiocyanate+conjugates.">A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates.</a> Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).</li><li>Cole, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+a+transporter+gene+in+a+multidrug-resistant+human+lung+cancer+cell+line.">Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line.</a> Science. 258, 1650-1654 (1992).</li><li>Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphisms+of+MRP1+(ABCC1)+and+related+ATP-dependent+drug+transporters.">Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters.</a> Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).</li><li>Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adenosinetriphosphatase+and+transport+activities+of+purified+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).</li><li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).</li><li>O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Oldham, M. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshots+of+the+maltose+transporter+during+ATP+hydrolysis.">Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).</li><li>Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inward-facing+conformation+of+a+putative+metal-chelate-type+ABC+transporter.">An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter.</a> Science. 315, 373-377 (2007).</li><li>Dawson, R. J. P., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+bacterial+multidrug+ABC+transporter.">Structure of a bacterial multidrug ABC transporter.</a> Nature. 443, 180-185 (2006).</li><li>Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+trans-inhibition+in+a+molybdate/tungstate+ABC+transporter.">Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter.</a> Science. 321, 246-250 (2008).</li><li>Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+in+the+ABC+transporter+MsbA:+Alternating+access+with+a+twist.">Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).</li><li>Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high-affinity+E.+coli+methionine+ABC+transporter:+structure+and+allosteric+regulation.">The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation.</a> Science. 321, 250-253 (2008).</li><li>Aller, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+P-Glycoprotein+Reveals+a+Molecular+Basis+for+Poly-Specific+Drug+Binding.">Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding.</a> Science. 323, 1718-1722 (2009).</li><li>Koehler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophospholipid+micelles+sustain+the+stability+and+catalytic+activity+of+diacylglycerol+kinase+in+the+absence+of+lipids.">Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids.</a> Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+functional+characterization,+and+NMR+studies+of+human+KCNE1,+a+voltage-gated+potassium+channel+accessory+subunit+associated+with+deafness+and+long+QT+syndrome.">Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome.</a> Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+determination+of+inorganic+phosphate+in+the+presence+of+labile+organic+phosphate+and+high+concentrations+of+protein:+Application+to+lens+ATPases.">A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases.</a> Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).</li><li>Rothnie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+cholesterol+in+maintenance+of+P-glycoprotein+activity+and+its+membrane+perturbing+influence.">The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence.</a> Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).</li></ol>

Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы, ни других противоречивых интересов в отношении этой работы.

Ранее мы описали метод сверхэкспрессией мышиного CFTR 14. С момента публикации этого протокола, мы выразили и очищенный несколько различных Ортологи CFTR используя ту же систему. Все испытанные ортологи так далеко очищают хорошо в LPG моющего средства, в то время как очистка DDM показали больший разброс между различными ортологи (данные не показаны). Эта гибкость иллюстрирует прочность подход дрожжей: можно экранировать много конструкций с относительной скоростью, чтобы выбрать один для определенной цели. Стиральная дрожжевых микросом с буфером, содержащим 1 М NaCl до солюбилизации с результатами DDM в более чистой подготовки микросомной и снижает загрязняющих веществ на более поздних стадиях. Этот шаг не является необходимым в протоколе СНГ как окончательная проба CFTR является&gt; 90% чистоты без микросомной стирки. Кроме того, очистка в DDM требует нескольких изменений в буферов для солюбилизации аочистка й, а именно добавление дополнительной глицерин и соли. Вместе эти добавки значительно увеличилось связывание DDM-солюбилизированного белка в колонку. Методика очистки DDM имеет возможности для совершенствования, в частности удаление 40 кДа основной примеси, которые, если судить по масс-спектрометрии, связано с дрожжи рибосомной субъединицы L3, который появляется иметь характеристическую сродство к смоле никеля. Там нет очевидного polyHis последовательность в белке L3, но экспертиза его 3D структуры при связывании с рибосомой (PDB = 1FFK) показывает, что сложил L3 субъединицы имеет потенциальную polyHis кластер. То, что это группа менее проблематично в СНГ очищенный материал может быть связано с более жесткой СНГ моющего средства. Хотя очистка в DDM-видимому, беднее, чем в СНГ, более мягкие детергенты, такие как DDM может быть более совместимым с функциональной и структурной анализов и уже используется в нескольких рентгеновских Кристаллographic исследования мембранных белков 15-21. Кроме того, наши результаты показывают, что использование сжиженного газа приводит к потере функции АТФазы в CFTR относительно очистки в DDM. Поэтому мы рекомендуем протокол очистки LPG основе для генерации CFTR, где чистота имеет решающее значение, например, в таких приложениях, как характеристике пост-трансляционных модификаций, или в генерации антител, протокол СНГ на основе будет выбран . С другой стороны в случаях, когда деятельность и полностью родное государство белка имеет важное значение, мы бы предложить протокол DDM основе в качестве лучшего варианта. В заключение, этот протокол описывает воспроизводимый метод для изоляции CFTR в цвиттерионного моющего средства LPG-14 или неионные моющего DDM. Как таковой, он указывает на более широкий спектр очистных условий для CFTR чем уже сообщалось ранее 10-13. В дополнение миллиграмм количеств очищенного CFTR может бытьполученные с использованием этих процедур в сочетании с высокой объемной системы рост дрожжей, таких как 20-литровом ферментере и системой сбора клеток с высокой пропускной способностью, такой как 6 л низкой скорости ротора центрифуги с. CFTR получены имеет отщепляемую GFP тег, который позволяет легко контролировать белка в различных биохимических и биофизических анализов. Реагента, описанного в этой рукописи (CFTR курица, содержащие плазмиды или замороженные дрожжевые клетки) могут быть получены путем кистозного фиброза Foundation (США).

Муковисцидоз (МВ) является наиболее распространенным генетическим заболеванием, в Европе и Северной Америке с частотой около 1 в 2500 живорожденных. CF происходит, когда мутации в муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) привести к потере белка своей функции на плазматической мембране эпителиальных клеток 1. Наиболее серьезным последствием этого дефекта является необратимое повреждение легких, что сокращает продолжительность жизни больных до &lt;40 лет 2,3. CFTR является АТФ-связывающего кассетного (ABC) транспортер, что превратилась ионный канал 1,4. Несмотря на довольно измененной функции в плазматической мембране клеток, он все еще сохраняет значительную гомологию последовательностей с другими транспортеров АВС. Интересно, что специализированные части CFTR (т.е. его регуляторной области и его N-и С-концы) не поделиться значительного сходства последовательности с другой многоклеточных ABC транспортеров, следовательно, нет никаких улик, как в гое истоки этих последовательностей в CFTR. На основе его первичной структуры, CFTR классифицируется в качестве члена C-семьи транспортера семьи ABC, но нет никаких убедительных доказательств для остаточной функциональной привязки к этой суб-семьи. Там было несколько сообщений о глутатион транспортной деятельности для CFTR 5-7, который будет соответствовать роли других членов С-семейных 8,9, хотя другие источники предполагают, что восстановленный глутатион может ингибировать активность CFTR АТФазную, а не показывая субстрат-индуцированного стимуляции, которые характеризуют перевозчиков ABC 10. Измерение ионной проводимости является достаточно чувствительным, чтобы позволить канал активность одиночных молекул CFTR быть изучены 1 и свойства канала CFTR были регистрируют как функцию времени, температуры, концентрации АТФ, мембранного потенциала и состояния фосфорилирования, а также в Наличие множества низкомолекулярные ингибиторы, усилителей и модификаторами. Этиисследования также добавил значительно к нашему знанию о том, как функционируют ABC транспортеры. Тем не менее, выражение CFTR в значительных количествах и его последующей очистки оказалась особенно сложной и успех был ограничен несколькими лабораториями 10-13. Необходимость разработки более эффективных препаратов давит, но этот процесс был сдерживается отсутствием очищенного CFTR для скрининга малых молекул. Решение проблемы экспрессии CFTR и очистки позволит высокопроизводительного скрининга наркотиков, направленных на исправление основной дефект в CF, а также будет открыть маршрут для структурных исследований с высоким разрешением, чтобы сообщить рациональную конструкцию наркотиков. Более того, даже относительно основные биохимические характеристики белка, например, его функциональной олигомерного состояния, взаимодействующих белков и АТФазы остаются плохо охарактеризованы. Ранее мы уже сообщали протокол для крупномасштабной экспрессии GFP и его-меченых мышиных CFTRв S. CEREVISIAE 14 и теперь дополнительно описывают протоколы для очистки CFTR. Мы использовали эти методы, чтобы очистить пять ортологи CFTR и представления данных для очистки куриного CFTR в качестве примера. Выбор моющих средств для растворения и очистки является важным шагом в очистке любого мембранного белка. После скринингу на растворимости CFTR в нескольких моющих средств, мы выбрали два противоположных моющие средства для использования в очистке. Додецил-β-D-мальтозид (DDM) представляет собой неионный детергент, который широко используется как для структурных и функциональных исследований мембранных белков 15-21. Ионный детергент 1-тетрадеканоил-Sn-глицеро-3-фосфо-(1&#39;-рац-глицерин) (LPG-14) является высокоэффективным в солюбилизации CFTR и ранее был использован в очищении функциональных мембранных белков 10, 22,23, в том числе очистки CFTR от S. CEREVISIAE 24. &lt;/ Р&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:492px;" width="491">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:161px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2&#956;M syringe filter&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sartorius</td>
			<td style="width:161px;">FC121</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane)</td>
			<td style="width:115px;">Vivaspin</td>
			<td style="width:161px;">VS0641</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">72.695</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">40Ti rotor</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;"><a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50ml Sterile Falcon Tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">62.547.254</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A26209&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liquid chromatography system</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28-4062-64</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A8456</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass bead-beating cell disrupter</td>
			<td style="width:115px;">BioSpec</td>
			<td style="width:161px;">1107900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">HERMLE</td>
			<td style="width:161px;">Z300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5417R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop microfuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">13-100-511</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzamidine hydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">434760</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">114391</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">357000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel imaging system</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">170-808</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chymostatin&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C7268</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">D8418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">43815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">E.coli total lipid extract</td>
			<td style="width:115px;">Avanti lipids</td>
			<td style="width:161px;">100500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">E3132</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass beads, acid washed</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8772</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">65017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HisTrap HP columns (5 ml)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-5247-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapid Coomassie Stain</td>
			<td style="width:115px;">Novexin</td>
			<td style="width:161px;">ISB1L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge JA-17 rotor</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">369691</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:115px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">108975</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG)</td>
			<td style="width:115px;">Avanti lipids</td>
			<td style="width:161px;">858120</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO4</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel tank SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">165-8006</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">n-dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:115px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:161px;">D310S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S6191</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NaN3</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A9434</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">75351</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">392050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prestained protein standards</td>
			<td style="width:115px;">Fermentas</td>
			<td style="width:161px;">SM1811</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Desalting columns (Sephadex G-25)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-0851-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin A</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P4265</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P7626</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sch28080</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S4443</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">L37771</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium thiocyanate (NaSCN)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">251410&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel filtration 10/300 GL column</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-5172-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris-base</td>
			<td style="width:115px;">Formedium</td>
			<td style="width:161px;">TRIS01</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">355618</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:115px;">Star Labs</td>
			<td style="width:161px;">N2400-0001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:115px;">Ultrawave</td>
			<td>F0002202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multimode plate reader</td>
			<td style="width:115px;">BioTek</td>
			<td style="width:161px;">BTH1MF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein expressed in saccharomyces cerevisiae

Дефекты в муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) белок вызывает кистозный фиброз (CF), аутосомно-рецессивные заболевания, что в настоящее время ограничивает среднюю продолжительность жизни больных до &lt;40 лет. Разработка новых лекарственных молекул восстановить активность CFTR является важной целью в CF лечения, а также изоляция функционально активной CFTR является полезным шагом на пути к достижению этой цели. Опишем два способа очистки CFTR от эукариотической гетерологического системы экспрессии, S. CEREVISIAE. Как прокариотических системах, С. CEREVISIAE можно быстро растет в лаборатории при низких затратах, но может также трафик и посттрансляционно изменить большие мембранные белки. Выбор моющих средств для растворения и очистки является важным шагом в очистке любого мембранного белка. После скринингу на растворимости CFTR в нескольких моющих средств, мы выбрали двух соntrasting моющие средства для использования в очистке, которые позволяют заключительная подготовка CFTR, чтобы быть адаптированы к впоследствии запланированных экспериментов. В этом методе, мы предлагаем сравнение очистки CFTR в додецил-β-D-мальтозид (DDM) и 1-тетрадеканоил-Sn-глицеро-3-фосфо-(1&#39;-рац-глицерин) (LPG-14). Белок очищали в DDM этим методом показывает АТФазы в функциональных анализах. Белок очищают LPG-14 показывает высокую чистоту и выход, может быть использован для изучения посттрансляционных модификаций, и может быть использован для структурных методов, таких как малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и электронной микроскопии. Однако он отображает значительно ниже АТФазы.

Протокол, описанный выше, является эффективным средством изолировать CFTR обогащенный микросом, с почти полного восстановления CFTR во время клеточного повреждения и подготовки сырой микросомах (рис. 1). Другие методы клеток поломки также могут быть использованы эффективно. Мы использовали французскую ячейку давления, и другие high-pressure/cavitation устройств (также в сочетании с влияя против цели рубинового) с одинаковой эффективностью. Для удобства и низкой начальной стоимости оборудования, мы находим методом шарик избиение лучших. Использование сжиженного газа для растворения и очистки CFTR дали 80 мкг белка / л культуры на&gt; 90% чистоты (рис. 2). Высокий выход было связано с эффективной солюбилизации CFTR на LPG (ср. фиг.2В, дорожки 2 и 4). Кроме того, эффективным и сильной связи в колонну привело к минимальной потерей CFTR в несвязанной фракции и отсутствие CFTR в промывной фракции (рис. 2, дорожки 3, 5, и6). Элюированный белок имел чистоту&gt; 90%, по оценкам Кумасси окрашенных ПААГ с ДСН и с помощью денситометрии в CFTR и загрязняющих групп. Гель-проникающей хроматографии (ГПХ), разделенных СНГ очищенный CFTR от загрязнений низкомолекулярных (рис. 4, нижняя панель). Протокол для очистки CFTR с помощью DDM дает чистоту примерно 60% и выходом около 50 мкг / л (рис. 3). Электронной микроскопии (ЭМ) из отрицательно окрашенных фракций из ГПХ, элюирующихся при примерно 10 мл (рис. 4) показали, что очищенный DDM-CFTR содержит агрегаты диаметром 20-30 нм, а также более мелкие частицы диаметром 10 нм (данные не показаны). Вполне возможно, что небольшие агрегаты могут обратимо связывать и отделить как ультрафильтрации с 1 МДа отсечения фильтра не удалось удалить ЭМ-обнаруживаемые агрегатов. LPG-очищенный материал не адсорбировать на тлеющем разряжен сетки, следовательно, был изучен крио-ЭМ неокрашенных фракций. Это показало,очень однородной популяции частиц из относительно малого размера (6-8 нм в диаметре, данные не показаны). Наконец, АТФазы из очищенных белков измеряли (рис. 5). Как член семейства белков ABC, CFTR имеет два нуклеотидных-связывающие домены (NBDs) способны связывать и / или гидролиза АТФ. Данные показывают, что очищенный белок был не в состоянии для гидролиза АТФ в LPG-солюбилизированного состоянии и показали слабую АТФ-азной активностью в присутствии DDM (рис. 5, незаполненные столбики). После добавления липидов и удаления детергента, АТФазы была в 4 раза выше для образцов, очищенный в DDM (13 нмоль ATP / мин / мг белка). Добавление липидов и удаления LPG аналогично восстановленной активности в CFTR, которые были изолированы с помощью LPG, но с меньшей скоростью окончательного (1,5 нмоль ATP / мин / мг белка), чем DDM-очищенного и восстановленного материала. <img alt="Рисунок 1"FO: содержание-шир = &quot;5 дюймов&quot; FO: Пребывание &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1highres.jpg&quot; Первоначально &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1.jpg&quot; /&gt; Рисунок 1. Уровни мониторинга куриного CFTR в лизата клеток (CL), супернатанты (S) и гранулы (P) во время различных стадиях центрифугирования, используемых для изоляции микросомной и промывки. ПААГ с ДСН были визуализированы с помощью в-гель флуоресценции GFP тег. Супернатант после клеточной поломки и центрифугирования при 14000 х г содержит практически все CFTR (в том числе продуктов распада). Ультрацентрифугирование 200000 XG отложений все полнометражный CFTR, оставляя некоторые фрагменты в супернатанте. Ультрацентрифугирование при 100000 х г соленых промывают микросомах гранул почти все CFTR с удалением некоторых дополнительных фрагментов. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2.jpg" /> Рисунок 2. Очистка куриного CFTR в СНГ по иммобилизованным ионом металла аффинной хроматографии. Фракции анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием кумасси (верхняя панель) и обнаружения флуоресценции GFP тега (нижняя панель). Количество треков: (1) микросом. (2) LPG-солюбилизированы Микросомы. (3) Несвязанный материал. (4) Нерастворимый материал. (5) и (6) 40 и 100 мМ имидазола моет. (7) Материал элюировали 400 мМ имидазола. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3.jpg" /> Рисунок 3. Очистка куриного CFTR в DDM по иммобилизованным ионом металла аффинной хроматографии. Фракции анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси. Левой панели показывает фракций до элюирования. Несколько последовательных фракции элюции приведены в правой панели с CFTR вdicated стрелкой. Более поздние фракции обогащены в 40 кДа примеси, который был определен методом масс-спектрометрии, как рибосомного белка L3. <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4.jpg" /> Рисунок 4. Очистка куриного CFTR с помощью гель-проникающей хроматографии. CFTR очищают Ni-афинной хроматографии концентрировали и наносили на колонку ГПХ. Профиль элюции для CFTR (верхняя панель), очищенный буфере, содержащем LPG-14 (сплошная линия) или DDM (пунктирная линия) накладываются. SDS-PAGE (нижняя панель) показал, что CFTR элюируют между 8 и 11 мл. <img alt="Рисунок 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5.jpg" /> Рисунок 5. АТФазы Activitу очищенных курица CFTR фракций. Белок очищенный DDM или СНГ анализировали с помощью модифицированного Chifflet анализа 26 в присутствии коктейля ингибиторов АТФазы, чтобы устранить любые фона АТФазы от F-, P-и АТФаз V-типа (незаполненные баров ). Скорость гидролиза АТФ была также измерена после удаления детергента и липида того (закрашенные столбцы). Сюжет показывает среднее и стандартное отклонение (п = 3). Различия между средними значениями для АТФазы в присутствии и в отсутствие липида и разницы между активностью в DDM и сжиженного нефтяного газа являются существенными для р &lt;0,05.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Гетерологичная экспрессия и очистка муковисцидозный трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) значительные проблемы и ограничивающие факторы в развитии лекарственной терапии для муковисцидоза. Этот протокол описывает два способа выделения миллиграмм количества CFTR, пригодных для функциональных и структурных исследований.

Очистка муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости белка выражается в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Препарирование Saccharomyces CEREVISIAE Сумки

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Очистка М. magneticum Штамм AMB-1 Magnetosome белка, связанного MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray анализа для Saccharomyces CEREVISIAE</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Флуоресценция Пробирной микроскопии для мониторинга Mitophagy в Дрожжи Saccharomyces CEREVISIAE

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Выражение и очистка муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости белка в Saccharomyces CEREVISIAE

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

В сочетании Анализы для мониторинга рефолдинг Белок в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

ЭПР Контролируемый окислительно-восстановительного титрования из кофакторами<em&gt; Saccharomyces Cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...