Name: high throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in e. coli
Uploaded: 2014-07-30T13:00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט VENOMICS, N פרויקט מענק האירופי ° 278,346 באמצעות תכנית המסגרת השביעית (FP7 בריאות 2011-2015). פרויקט VENOMICS הוא שיתוף פעולה בין מספר מוסדות מחקר וחברות באירופה: AFMB, Aix-Marseille האוניברסיטה (צרפת), CEA Saclay (צרפת), NZYTech (פורטוגל), SistemasGenomicos (ספרד), אוניברסיטת דה ליאז&#39; (בלגיה), VenomeTech (צרפת), Vitamib (צרפת), זילנד פארמה (דנמרק) עבודה זו נתמכה על ידי התשתיות צרפתיות לביולוגיה מבנית משולב (FRISBI) ANR-10-InSb-05-01. המחברים רוצים גם להודות למר ג&#39;רמי Turchetto לסיוע בהכנות לצילומי הווידאו.

<ol>
	<li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+and+solubility+screening+in+Escherichia+coli:+a+comparative+study.">Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).</li><li>Correa, A., Oppezzo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+different+expression+parameters+to+achieve+soluble+recombinant+proteins+in+E.+coli:+advantages+of+high-throughput+screening.">Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening.</a> Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5, 135-146 (2008).</li><li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures.">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+systematic+N-+and+C-terminal+deletions+to+promote+production+and+structural+studies+of+recombinant+proteins.">The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins.</a> Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).</li><li>Bird, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+construction+and+small+scale+expression+screening+of+multi-tag+vectors+in+Escherichia+coli.">High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 29-37 (2011).</li><li>Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fusion+protein+systems+designed+to+give+soluble+expression+in+Escherichia+coli.">New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli.</a> Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).</li><li>Kapust, R. B., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+maltose-binding+protein+is+uncommonly+effective+at+promoting+the+solubility+of+polypeptides+to+which+it+is+fused.">Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).</li><li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).</li><li>Marblestone, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SUMO+fusion+technology+with+traditional+gene+fusion+systems:+enhanced+expression+and+solubility+with+SUMO.">Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).</li><li>Nozach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+identifies+disulfide+isomerase+DsbC+as+a+very+efficient+partner+for+recombinant+expression+of+small+disulfide-rich+proteins+in+E.+coli.">High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli.</a> Microb Cell Fact. 12, 37 (2013).</li><li>Sachdev, D., Chirgwin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusions+to+maltose-binding+protein:+control+of+folding+and+solubility+in+protein+purification.">Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).</li><li>Smith, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+fusions+to+glutathione+S-transferase+for+protein+studies.">Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies.</a> Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).</li><li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli.">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).</li><li>Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+reducing+pathways+is+not+essential+for+efficient+disulfide+bond+formation+in+the+cytoplasm+of+E.+coli.">Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli.</a> Microb Cell Fact. 9, 67 (2010).</li><li>de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+contributions+in+the+field+of+the+recombinant+expression+of+disulfide+bonded+proteins+in+bacteria.">Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria.</a> Microb Cell Fact. 11, 129 (2012).</li><li>Katzen, F., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+formation+in+periplasm+of+Escherichia+coli.">Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).</li><li>Klint, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+disulfide-rich+venom+peptides+for+structural+and+functional+analysis+via+expression+in+the+periplasm+of+E.+coli.">Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli.</a> PloS One. 8, e63865 (2013).</li><li>Braud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+expression+system+suitable+for+high-throughput+fluorescence-based+screening+and+production+of+soluble+proteins.">Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins.</a> Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).</li><li>Douzi, B. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+system+for+expressing+recombinant+animal+toxins+in+E.+coli.+(Collection+Rencontres+en+Toxicologie,+Publications+de+la+SFET,+Chatenay-Malabry).">A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry).</a> Advances and new technologies in toxinology. , 149-152 (2010).</li><li>Groisillier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MARINE-EXPRESS:+taking+advantage+of+high+throughput+cloning+and+expression+strategies+for+the+post-genomic+analysis+of+marine+organisms.">MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms.</a> Microb Cell Fact.. 9, 45 (2010).</li><li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli.">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 65-72 .</li><li>Xiao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high-throughput+protein+sample+production+platform+of+the+Northeast+Structural+Genomics+Consortium.">The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium.</a> Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).</li><li>Saez, N. J., Vincentelli, R., Chen, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch3+High-throughput+expression+screening+and+purification+of+recombinant+proteins+in+E.+coli.">Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli.</a> Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology. 1091, 33-53 (2014).</li><li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway+(R)+recombinational+cloning:+a+biological+operating+system.">Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).</li><li>Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+expression+and+solubility+screening+of+His-tagged+proteins+in+96-well+format.">Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format.</a> Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).</li><li>Spencer, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+pharmacology+under+flow:+automation+via+well-plate+microfluidics.">Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).</li><li>Sala, E., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+optimized+protein+purification+protocols+by+coupling+small-scale+expression+and+mini-size+exclusion+chromatography.">Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography.</a> Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).</li><li>Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synergistic+approach+to+protein+crystallization:+combination+of+a+fixed-arm+carrier+with+surface+entropy+reduction.">A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).</li><li>Zanier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins. 339, 694-698 (2013).</li><li>Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P1'+specificity+of+tobacco+etch+virus+protease.">The P1' specificity of tobacco etch virus protease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).</li><li>Vincentelli, R., Romier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+in+Escherichia+coli:+becoming+faster+and+more+complex.">Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors.">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152, 327-339 (2013).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).</li><li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors.">Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li><li>van den Ent, F., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RF+cloning:+a+restriction-free+method+for+inserting+target+genes+into+plasmids.">RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).</li><li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+automated+refolding+screening+of+inclusion+bodies.">High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

אין פרוטוקול אוניברסלי יחיד לביטוי של חלבונים מסיסים, מקופלים, פונקציונליים. להיות עלות והזמן יעיל, רוב המעבדות או מתקני גרעין חלבון עבודה עם מטרות מרובות ולכן משתמשים בביטוי חלבון גבוה תפוקת הקרנה למצוא את השילוב הטוב ביותר &quot;הגנרית&quot; של משתנים כדי לקבל חלבון פעיל מסיס עבור רוב המטרות. אנו זיהינו DsbC כמו להיות שותף היתוך בדרך כלל ישים עבור הביטוי מסיס של פפטידים דיסולפיד עשיר בחלבונים ו11. באמצעות התכה DsbC ושיטות תפוקה גבוהה, תוך שבוע הביטוי מסיס של מטרות מרובות ניתן לצפות 11 ולאחר מכן משתנים נוספים, כגון אלה שנדונו בהקדמה, יכולים להיות מוקרנים בסיבובים שלאחר מכן על אותם היעדים שדורשים אופטימיזציה נוספת. הפרוטוקולים שתוארו במסמך זה מכוונים לביטוי של חלבוני דיסולפיד עשיר ופפטידים. עם זאת, עבור משתמשים המעוניינים expחלבונים שאינם מרושתים Ress באופן תפוקה גבוה, הפרוטוקולים המתאימים כבר פורסמו בעבר, וניתן למצוא במקומות אחרים 22,24. הגדרת התפוקה הגבוהה היא אידיאלית עבור מספר היישומים, כולל ההקרנה של מספר רב של חלבונים שונים לביטוי מסיס או ההקרנה של מספר רב של מבני ביטוי (כוללים תגי היתוך שונים) לכמה גנים המטרה באותו הזמן ( או ביטוי מרובה בונה למטרה אחת) על מנת לשפר את אחוזי ההצלחה. גם הפלטפורמה יכולה לשמש להשוואות ואימות של פרוטוקולים חדשים על מספר רב של מטרות. יישומים אחרים כוללים הקרנה של גרסאות ליעד קשה בודד, למשל, כל orthologs או בני אותה המשפחה, או כדי לבדוק את ההצלחה של ייצור פנל של מוטציות של מטרה אחת בניסוי אחד. פרוטוקול זה גם נעשה שימוש בשילוב עם וקטורי שיתוף ביטוי (שנינות<html> h אחד מתויג חלבון בלבד) כדי לאפשר המשיכה למטה ואפיון ראשוני של קומפלקסי חלבונים ואחרי ניתוח biophysical מעמיק יותר כדי לאשר את היווצרות מורכבת הנכונה והרכב 33. כמות החלבון מטוהרת היא לפעמים מתאימה למייקרו מבחני (בדיקות פונקציונליות, חלבון-DNA 34 או מבחני אינטראקציה בין חלבונים). ישנם מספר יתרונות לאסטרטגית הקרנת ביטוי תפוקה הגבוהה: (i) את היכולת לבחון מספר רב של מטרות, או מספר רב של משתנים בניסוי אחד, (ii) וריאציה אצווה כדי אצווה מוגבלת, (iii) פשטות וקלות לעבוד בקנה מידה קטנה יותר באמצעות בארות עמוקות, (iv) מדרגיות ושחזור בקנה מידה גדולה יותר, (v) את הפוטנציאל לאוטומציה, ופשטות (vi) של מעקב וטיפול (אין תיוג של צינורות בודדים, פחות טעויות הציגו בעת שימוש בתבנית הצלחת מאשר עם הטיפול בצינורות בודדים בערבוב או החלפה של שיבוטים). class = &quot;jove_content&quot;&gt; למרות שלא דנו בסעיף בפרוטוקול, יש כמה שיקולים חשובים להכנת הניסוי שיידון בקצרה להלן. לדיון מעמיק יותר אנא ראה הפרסום הקודם שלנו 24. ליעילות מקסימלית, זה מועיל יש מערכת מתאימה לשיבוט תפוקה גבוהה, כדי לפשט משנה השיבוט של מספר רב של מטרות. בשלב הראשוני של פרויקט VENOMICS, אנו מנצלים את מערכת תכליתי Gateway רקומבינציה 25 המאפשרת subcloning בכל וקטור יעד בקצב של מאות שיבוטים בשבוע. ניתן למצוא בפרוטוקולים לשיבוט רקומבינציה Gateway באתר Invitrogen. חלופות אחרות לשיבוט תפוקה גבוהה כוללות שיבוט קשירה עצמאית (LIC) 35,36 וללא הגבלה (RF) שיבוט 37. ישנן דרכים רבות כדי להשיג את גנים המטרה לביטוי, ובכלל זה על ידי PCR מהתבנית ה-DNA, מאוספי שיבוט כניסה או כמוגנים סינטטיים, המהווה את האסטרטגיה שנבחרה לפרויקט VENOMICS. ניתן להזמין בגנים סינטטיים עם אתרי רקומבינציה בכל קצה של סינתזת הגן והגן מאפשרת אופטימיזציה של קודון קל של רצף גן המטרה (להוציא קודונים החיידק נדירים). זו מומלצת אך לא הכרחי. למטרות ללא קודון אופטימיזציה המכילות מספר גבוה של קודונים נדירים, רוזטה 2 (DE3) pLysS (אשר נושא tRNAs לקודונים נדירים שלא באים לידי ביטוי מאוד בE. coli) עשויים להיות מתאים יותר מBL21 (DE3) pLysS. אמנם יש זנים זמינים המגבילות את ההפחתה של אגרות חוב דיסולפיד בסביבה בדרך כלל הפחתה של ציטופלסמה, בידיים שלנו הם לא היו מוצלחים כמו ה הרגילה coli זני 11. טיהור זיקת קנה מידה אנליטית מבוצעת מתרבויות ביטוי מבחן על מנת לשחזר את חלבוני היתוך המסיסים ולכמת תשואות. ניתן לקבל נתונים כמותיים על הדואר תשואות מסיסים של חלבוני היתוך הביעו בטווח של 0.1-100 מ&quot;ג / ליטר של התרבות. אם יעד הוא לא מסיס, טמפרטורות חלופיות ביטוי ואינדוקציה, זנים או תקשורת יכולות להיבדק לפני שותפי היתוך שונים רדפו. לביטוי מסיס של חלבוני דיסולפיד עשיר, אנחנו מדורגים בעבר את ההשפעה של שותפי היתוך כ&gt;&gt; GST DsbC&gt; DsbA MBP&gt; TRX&gt; התג שלו לביטוי cytoplasmic 11. ביטוי periplasmic אפשרות נוספת שעשויות לסייע לקיפול המוצלח של מטרות דיסולפיד עשיר. Periplasm היא סביבת הפחתה פחות מ ציטופלסמה ומכיל מלווים חיזור שימושיים כדי לסייע דיסולפיד מליטה. חלבוני DsbC, DsbA, וMBP בדרך כלל מקומיים לperiplasm ידי רצפי אות periplasmic שלהם. זה מספק ההזדמנות לנצל תגים אלו לכוון את מטרות דיסולפיד עשיר למרחב periplasmic על מנת לסייע מתקפל. למטרות סוררות, הצעד הבא יהיה purify היעד מתויג-HIS מסיס מגופי הכללה, solubilize ולקפל (זה מחוץ להיקף של פרוטוקול זה ולא יידון כאן 3 9). זה יכול להיות פשוט למדי למטרות עם רק אחד או שניים אג&quot;ח דיסולפיד, אבל הופך להיות קשה יותר ויותר ככל שמספר עליות איגרות חוב דיסולפיד. לחלופין, ובמיוחד לחלבונים ופפטידים עם ארבעה או יותר קשרי דיסולפיד, זה עשוי להיות מועיל כדי לנסות מערכות ייצור מורכבות יותר כמו שמרים, חרק או ביטוי של יונקים. עם התקדמות במזעור ואוטומציה, טכנולוגיות אלקטרופיזיולוגיה HTP מעבדה על שבב 28 תהיינה ללא ספק הדרך של העתיד לניתוחים פונקציונליים. אנו חוזים כי לרוב מטרות (אולי הפרט למחקרים מבניים) זה יהיה לשלול את הצורך בתרבויות בקנה מידה גדולה. תרבויות בקנה מידה קטנות לא רק להיות שימושיות עבור הקרנת תנאי ביטוי, אלא גם להיות מסוגל לספק סוףficient הסכומים של מדגם עבור מבחני פונקציונליים מוקטנים אלה. היכולת לייצר מטרות מרובות במקביל בכמויות מספיקות לאפיון פונקציונלי תפחית את העלויות של culturing ושימוש בסוג של פלטפורמות אלה, ביטוי ואפיון של חלבונים רקומביננטי יהיה יותר עלות וזמן יעיל. הפרוטוקולים במסמך יושמו לביטוי של פפטידים דיסולפיד עשיר וחלבונים בשלב הראשוני של פרויקט FP7 האירופי VENOMICS. ארס הוא מקור מצוין של פפטידים ביו, כי לעתים קרובות יש להם פוטנציאל תרופתי מעניין. עם זאת, הייצור שלהם הוא מאתגר בשל הדפוסים המורכבים שלהם דיסולפיד-המליטה וגודל קטן. שימוש בפלטפורמות תפוקה גבוהה כמו זו שתוארה במסמך זה, פרויקט VENOMICS שואף לייצר ספרייה של 10,000 פפטידים ארס רומן לשחזר את הגיוון שנצפה בטבע. ספרייה זו תנוצל לאפיון של דיסולפיד-rפפטידים ich עם תרופתי פוטנציאלי או יישומים טיפוליים במטרה לפתח תרופות חדשות. הפלטפורמה נמצאת בשימוש בהשוואות ולאימות של פרוטוקולים חדשים לשימוש בפרויקט VENOMICS.

מונע על ידי הקידום של גנומיקה וקצב מואץ של גילוי של חלבונים חדשים, צינורות תפוקה גבוהים פותחו למקבל גישות מסורתיות להקרנה וזיהוי של אסטרטגיות ייצור חלבון אופטימליות. משתני פוטנציאל להיות מותאמים כוללים, אך לא מוגבלים לביטוי שונה זני 1,2, הטמפרטורה 3,4, מדיה 2,3, יעד גרסאות 5 שותפים, היתוך 6-13, שיתוף ביטוי עם מלווי 14,15, cytoplasmic או רכיבי ביטוי 16-18, וחיץ טיהור periplasmic 3. על ידי יישום גישות תפוקה גבוהות, משתנה רבים או מטרות רבות ניתן לבדוק במקביל עם רמה גבוהה של יעילות, תוך הגבלת וריאציה אצווה כדי אצווה. מניסיוננו, את האסטרטגיה גם נותנת שחזור טוב על סולם למעלה תוך שימוש באותה התרבות (טמפרטורה, תקשורת, אוורור, וכו &#39;) ותנאי טיהור (אותו רזיn, מאגרים, וכו &#39;). פלטפורמות תפוקה גבוהה כמה היו בשימוש בעשור האחרון לזהות תנאים לביטוי חלבון מסיס, כלומר באמצעות פרמטרים שונים כגון שותפי היתוך, זני ביטוי או טמפרטורה 19-23. לאחרונה השתמשנו בגישת הקרנת התפוקה הגבוהה שלנו לביטוי של חלבוני דיסולפיד עשיר מסיסים 11. החלבונים שנבחרו היו לא רק ממקורות ארסיים, אך כללו גם מעכבי אנזים דיסולפיד עשיר ממגוון רחב של מינים, כולל צמחים, חזירים, פרות ובני אדם. הניסוי השווה את ההשפעות של 12 שותפי היתוך שונים ושלושה זני ביטוי שונים על המסיסות והקיפול של חלבוני 28 מרושת דיסולפיד. אנחנו הוכיחו כי באמצעות DsbC כשותף היתוך לייצור בBL21 המתח (DE3) pLysS outproduced בהרבה (בשתי תשואה ומספר החלבונים מסיסים שהושגו) בכל שילוב אחר של מתח והיתוך נבדק 11.תוצאות של ניסוי זה היווה את הבסיס להתאמת הצינור המקורי שלנו בכלל תפוקה גבוהה (אשר שימש להקרנת הביטוי למגוון רחב של חלבונים) 22,24 לאחד מתאים יותר לביטוי של מטרות דיסולפיד עשיר. חלבוני דיסולפיד עשיר מהארס של בעלי החיים הם בעלי עניין מיוחד. ארס הוא תערובת מורכבת של פפטידים וחלבונים ביו, עם ערך פוטנציאלי פרמקולוגית וטיפולי. עם זאת, ביטוי של דיסולפיד חלבונים המכיל אג&quot;ח הוא לא טריוויאלי. חלבונים אלה מכילים בדרך כלל בין 6:59 אג&quot;ח דיסולפיד, והוא חייב להיות מחומצן עם דפוסי דיסולפיד-המליטה הנכונות על מנת להיות פעיל. נכון לעכשיו, הפלטפורמה נמצאת בשימוש להקרנת הביטוי של מספר גדול של חלבונים מן החי ארס דיסולפיד עשיר כחלק מFP7 האירופי VENOMICS הפרויקט (www.venomics.eu) והשוואות פרוטוקולים חדשים לביטוי תפוקה הגבוהה של אלפי מטרות . הנה, שיטה אוטומטיתמסופק להקרנת תפוקה גבוהה בקנה מידה קטנה ביטוי וטיהור (ראה איור 1) יחול על דיסולפיד עשיר בחלבוני ארס בבעלי חיים. האסטרטגיה לדיסולפיד פפטידים וחלבונים עשירים מנצלת התג שלו לטיהור ושותף היתוך חיזור פעיל, DsbC, יצירת שילובי HIS-DsbC cleavable לחלבוני היעד (ראה איור 2). למרות ההתמקדות של הפרוטוקולים במסמך זה אוטומציה באמצעות אלקטרופורזה רובוט וHTP טיפול נוזלית, שיטות אלה הן גם מתאימות לגישה ידנית תפוקה גבוהה, כלומר, גם במעבדות עם התקנה בסיסית יכולות לנצל את הפרוטוקולים ללא תנאי כלשהו לציוד יקר . פרוטוקולים ידניים לשינוי לטיהור וניתוח (לא ספציפי לחלבוני דיסולפיד עשיר) כבר פורסמו במקומות אחרים 24 ולא יחזרו על עצמו כאן. התפוקה של ההליך הידני (משיבוט ביטוי, המיוצרת על ידי recombiשיבוט לאומי 25, לניתוח של רמות חלבון המסיסים) הוא 96 (באמצעות זיהוי-SDS) או 384 (4 x 96; באמצעות כתם נקודה ו- SDS 26) תרבויות בשבוע (ראה איור 1). זה יכול להיות מוגבר אם מבוצע באופן חצי אוטומטי (באמצעות רובוט טיפול נוזלי וכתם נקודת 26 או אלקטרופורזה HTP, כמו עם מערכת Caliper GXII LabChip 22 לניתוח תוצאות) של עד 1,152 x 12 96) תרבויות (במקביל בשבוע אחד, כפי שתואר במסמך זה. Culturing מתבצע בבאר עמוקה 24 פורמט (DW24), כך שחממות רועדות רגילות יכולות לשמש בניגוד לתרבויות גדלו בבאר עמוקה 96 פורמט (DW96), שמצריך השימוש בחממות מסלולית קצרות רועדות במהירות גבוהה לאוורור מספיק (רועד ב 800 סל&quot;ד). השימוש במדיה אוטומטי אינדוקציה 27 גם מפשט את הביטוי, ומבטל את צעד האינדוקציה הידני. גם כאשר מעבדות כבר להשתמש בביטוי ופורה מוגדרים מראשתנאי fication, אלה יכולים להיות מועברים ישירות למערכת HTP זה פשוט כדי לשפר את היעילות. סכמטית מפורטת של צינור הקרנת תפוקה הגבוה עבור חלבוני דיסולפיד עשיר מסופקת באיור 3. הפרמטרים בצנרת נבחרו מבוססים על ניסויים נרחבים הקרנת 11, 22, אשר אפשרו לנו לבחור את התנאים השימושיים ביותר לייצור חלבון. אפיון יכול להתבצע על חלבונים מתויגים המטוהרים ישירות מביטויים בקנה מידה קטנה במחקרי פיילוט שבו עשרות מיקרוגרם של מדגם הוא, או למספיק מבחני פונקציונליים רגישים ומבחנים מחייבים (לדוגמא, מערכות מהדק תיקון HTP נפח נמוך 28). אותו הדבר יכול גם להתבצע על המטרות לא מתויגות לאחר מחשוף, סיפק את התג ופרוטאז יוסרו (למשל, על ידי HPLC שלב ההפוך). בקרת איכות גם יכולה להתבצע על ידי ספקטרומטריית מסה (כדי לאשר את הגודל הצפוי וחמצון stאכלתי) או שיטות chromatographic (כדי לאשר את טוהר או הטרוגניות) 29. לפעמים לתייג מחשוף הוא מיותר או אפילו לא רצוי (במיוחד לחלבונים מסיסים היטב 30,31), ולכן במחשוף פרוטוקול זה הוא אופציונלי. בכל מקרה, בכל המבנים יש אתר TEV פרוטאז מחשוף (ENLYFQ / [G] 32) ישירות קדמו לגן המטרה לייצר חלבון מקורי לאחר המחשוף (ראה איור 2 ודיון). אם מחשוף של תג ההיתוך הוא רצוי, מחשוף, ניתן לבדוק (בשבריר elution או &#39;בעמודה&#39;) בקנה המידה הקטנה לניתוח יעילות, לייעל את התנאים במידת צורך ולקבל אומדנים אמינים של תשואות לניסויים בקנה מידה-up שלאחר מכן. ישנן שתי אפשרויות לנפח של חרוזים המשמשים במהלך טיהור הזיקה, בהתאם למטרות ולציפיות של הניסוי. כדי להיות מסוגל ללכוד כמה שיותר חלבון ככל האפשר (כדי לטהר למבחני טייס או טרשת נפוצה, או לextrapolאכלתי לתשואות סולם למעלה) יש להשתמש בנפח סופי של μl 200 של שרף, המאפשר זיהוי של חלבון מסיס בטווח של 1-100 תרבות מ&quot;ג / ליטר לפני הרוויה של המערכת (ראה פרוטוקול (א) בסעיף 8.1) . עם זאת, אם המטרה של הניסוי היא זיהוי של כמויות נמוכות של חלבונים מסיסים אז נפח סופי של μl 50 של השרף מתאים, המאפשר זיהוי של חלבון מסיס בטווח של 0.1-25 תרבות מ&quot;ג / ליטר (ראה פרוטוקול (B ) בסעיף 8.2). ייצור ניתן לשנותם עד, אם נדרש, כדי להשיג כמויות מיליגרם של יעדים מטוהרים למחקרים מבניים ותפקודיים נוספים באמצעות התנאים שזוהו לביטוי מסיס. הפרטים של פרוטוקולי סולם למעלה משמשים בAFMB כבר דנו במקום אחר 22,24. פרטים נוספים רלוונטיים להגדרת הניסוי, השלבים קריטיים בפרוטוקול, שינויים ובעיות ירי ומגבלות של הטכניקה מסופקים בדיסקussion. אנא קרא את הדיון לפני תחילת הניסויים. לאורך הפרוטוקולים אנו מצפים שיעור הצלחה של 90% בכל שלב (לדוגמא, לפחות 90% מהתרבויות חייבים לגדול בכל שלב נתון). אם שיעור ההצלחה של כל צעד בניסוי יורד מתחת 90% הדגימות מבוטלות והניסוי חוזר על עצמו לאוסף המלא של מבנים. עם זאת, שיעור הצלחה זו אינו חל על מספר המבנים המבטאים את החלבונים מסיסים כאו את חלקם של מבנים שדבק ביעילות 100%, כפי שזה יהיה תלוי מאוד בחלבונים שנבדקו. הפרטים הספציפיים להגדרה של שולחן העבודה הרובוט ניתנים לכל פרוטוקול (ראו גם איור 4), אולם הם יכולים להיות מותאמים כנדרש ללהגדיר קופצים שולחן עבודה חלופית. חומרת הרובוט (טקאן) מורכבת מזרוע 96 רבת ערוצים (MCA96), מניפולטור רובוטית (רומא) וראש טיפול נוזל 8 ערוצים (LiHa). ניתן גם לבצע את כל צעדי ניצול MCA96 באמצעות LiHa אם MCA96 אינו זמין, אך הם ייקחו עוד כי LiHa יצטרך להישטף בין שלבים. בזמן שהרובוט הוא מבחינה טכנית אינו סביבת סטרילית, ההכללה של אנטיביוטיקה בדרך כלל מבטיחה שאין בעיות עם זיהום או עקרות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&#38;ID=5270&#38;Menu=1&#38;Item=21.1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR (PCR96) plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>652270</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 &#176;C. Use a 1 in 1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>780270</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the expression of target constructs. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) pLysS competent cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or alternative E. coli expression strain of the user&#39;s choice. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathseal breathable adhesive film</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine with 96-well plate block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well sterile tissue culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662165</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l sterile disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 617</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw</td>
			<td>Infors</td>
			<td>AJ103</td>
			<td>Not essential, a regular shaking incubator can also be used. 
			http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For glycerol stocks and elution using purification protocol B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the preparation of glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 616</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape pads&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td> 
			http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactinyl</td>
			<td>Orapi Group</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent microbial disinfectant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYP-5052 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for recipes of components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7701-5102</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed, clear microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance readings. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reading spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional. For measuring OD600nm of cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with rotor for deep well plates&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suitable for 3800 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mg/ml in water. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole ACS grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IX0005-1</td>
			<td>A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates)</td>
			<td>Misonix Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2M stock in water, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE or Caliper sample buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Receiver/Filter Plate 20 &#181;m, 1.8 ml capacity</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740686.4</td>
			<td> 
			http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable wide bore tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 050 348</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose 6 Fast Flow resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5318-02</td>
			<td>For purification of target fusion proteins. Store at 4 &#176;C. Wash and equilibrate before use. 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well 0.22 &#181;m filter plate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSGV N22 10</td>
			<td>Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. 
			http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user&#8217;s discretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer and cuvettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip pipette tips</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Optional. The type of ZipTip is at the user&#39;s discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. 
			http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author&#8217;s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in e. coli

Escherichia coli (E. coli) הוא מערכת הביטוי הנפוצה ביותר לייצור חלבונים רקומביננטיים למחקרים מבניים ותפקודיים. עם זאת, לטיהור חלבונים היא לפעמים מאתגרת מאז חלבונים רבים באים לידי ביטוי בצורה בלתי מסיס. כאשר עובד עם מטרות קשות או מרובות לכן מומלץ לשימוש תפוקה גבוהה (HTP) הקרנת ביטוי חלבון בקנה מידה קטנה (1-4 מיליליטר תרבויות) כדי לזהות במהירות תנאים לביטוי מסיס. כדי להתמודד עם התוכניות השונות מבניות הגנומיקה של המעבדה, כמוני (בטווח של .1-100 תרבות מ&quot;ג / ליטר של חלבון רקומביננטי) ופרוטוקול הקרנת ביטוי חלבון HTP יושם ומאומתים על אלפי חלבונים. הפרוטוקולים היו אוטומטיים עם השימוש ברובוט טיפול נוזלי אבל יכולים גם להתבצע באופן ידני, ללא ציוד מיוחד. חלבוני ארס דיסולפיד עשיר צובריםהגדלת הכרה בפוטנציאל שלהם כמוביל תרופה טיפולי. הם יכולים להיות חזקים מאוד סלקטיבית, אבל רשתות אג&quot;ח דיסולפיד המורכבת שלהם להפוך אותם מאתגרות לייצר. כחבר בפרויקט FP7 האירופי Venomics <a href="http://www.venomics.eu">(www.venomics.eu),</a> האתגר שלנו הוא לפתח אסטרטגיות ייצור מוצלחות במטרה לייצר אלפי חלבוני ארס רומן לאפיון פונקציונלי. בעזרת מאפייני חיזור של קשר דיסולפיד isomerase DsbC, התאמנו ייצור צנרת HTP שלנו לביטוי של חמצון, פפטידים ארס תפקודיים בE. ציטופלסמה coli. הפרוטוקולים חלים גם על הייצור של חלבוני דיסולפיד עשיר מגוונים. כאן אנו מדגימים הצינור שלנו מוחל על הייצור של חלבוני ארס בבעלי החיים. עם הפרוטוקולים מתוארים כאן סביר להניח כי יתקבלו חלבוני דיסולפיד עשיר מסיסים קטנים כמו שבוע. אפילו בקנה מידה קטנה, יש את הפוטנציאל להשתמש בהדואר מטוהר חלבונים לאימות מצב החמצון על ידי ספקטרומטריית מסה, לאפיון בלימודי טייס, או למייקרו מבחני רגישים.

נציג תוצאות מוצגות באיור 6 להקרנת הביטוי של חלבוני 96 דיסולפיד עשיר מצינור VENOMICS. החלבונים מסודרים על ידי מספר הולך וגדל של אגרות חוב דיסולפיד אז הגדלת מספר השאריות. פפטידים באו לידי ביטוי בציטופלסמה עם התג שלו ושותף היתוך DsbC. בעת שימוש בתנאי התרבות המומלצת, OD 600 של 12 מושגת בדרך כלל. פפטידים היו מטוהרים באמצעות פרוטוקול 8.2-B עם נפח סופי של μl 50 של שרף זיקת ניקל, כך מרבי ~ חלבון היתוך 25 מ&quot;ג / ליטר של ניתן היה לזהות בניסוי זה. איור 6 א מראה את תוצאת אלקטרופורזה ממערכת הניקוד הבוסס על ניפוח להניב בתרבות מ&quot;ג / ליטר של חלבון היתוך מערכת Caliper LabChip (מראה היתוך לפני המחשוף) ו( ברמות של 0.1-2 תרבות מ&quot;ג / ליטר, 2 עד 10 תרבות מ&quot;ג / ליטר, 10-25 מ&quot;ג / תרבות L ולא<html> לא זוהה.) שים לב שתג DsbC ביקע בדרך כלל פועל בסביבות 32 kDa, ולא 27 kDa כצפוי. באופן דומה, התכה DsbC גם להתרוצץ 5 kDa גבוהים מהצפוי. להרבה מטרות שאנו לא רק רואים את ההיתוך שלם (רצועה עליונה), אלא גם שותף ההיתוך לבד (להקה נמוכה יותר). עבור חלק ממטרות אלה אופטימיזציה תנאי התרבות יכולה לשפר את היחס של ההיתוך ללא פגע (רצועה עליונה) בהשוואה לDsbC לבד המאפשר גידול של התשואה הסופית. הניקוד מתבסס רק על הרמה של היתוך ללא פגע. רק 16 מתוך 96 חלבונים לא ניתן היו לזהות ברמת ההיתוך. זה מתאים לרמת הצלחה כוללת של 83%. של 80 חלבונים שניתן היה לזהות, 45 של אלה התגלו ברמות גבוהות יותר מ -2 תרבות מ&quot;ג / ליטר (56%). בהתאם ליעד ואיחוי, תשואות חלבון הן בדרך כלל בטווח של 2-100 תרבות מ&quot;ג / ליטר (אם כי בדוגמא זו באמצעות הפרוטוקול 8.2 B מקסימום ~ חלבון היתוך 25 מ&quot;ג / ליטר של ניתן לאתר). t &quot;&gt; ניתוח של ההצלחה על ידי מספר קשרי דיסולפיד הנוכחיים (המוצג באיור 6) מראה הצלחה סבירה לכל המספרים של אגרות חוב דיסולפיד נבדקו (בין 1 ל -7), עם רמת ההצלחה הנמוכה ביותר במשך 66% עבור מטרות המכילות 6 דיסולפיד אגרות חוב. ניתוח ההתפלגות של הצלחה ביטוי המבוסס על נקודה ומספר השאריות (שמוצג באיור 6C) איזואלקטרית מראה שום נטייה מסוימת לטכניקה, עם שני מטרות וביעדים שלא התגלו פזורים בעלילה הביעו בהצלחה. איור 6 ד &#39;מציג דוגמא של תוצאות ספקטרומטריית מסה המתקבלות מספקטרומטריית electrospray ההמונית יינון (ESI-MS) למטרה אחת, לפני ואחרי ההפחתה של המדגם עם DTT. בדרך כלל, ניתוח ספקטרומטריית כגון ממצה המוני לא הייתי צריכה להתבצע (מדגם מופחת לא צריך להיות מנותח), לעומת זאת לעניין demonstratio יסודיn שהראינו גם תוצאות. היעד המוצג הוא חלבון ארס דיסולפיד עשיר 5.7 kDa עם 4 קשרי דיסולפיד. הקשת בצד השמאל מראה את התוצאות לחלבון לפני הפחתה עם DTT, כפי שהייתה לאחר מחשוף וdesalting ללא התערבות נוספת. הקשת בצד ימין מציגה את החלבון לאחר הפחתה עם DTT ואחרי desalting כדי להסיר כל DTT עודף. היונים המתאימים להמונים הניסיוניים מסומנים בחיצים על הספקטרום והייעוד לכל יון מוצג בירוק. המוני ההורה הניסיוניים שמחושבים ליונים אלה (לחלבון לפני ההפחתה (-DTT) ולאחר ההפחתה (+ DTT)) מוצגים בטבלה. ההמונים (5709.6 דה למדגם לפני הפחתה ו5717.6 דה למדגם המופחת) תערוכת הבדל מסה של 8 דא. הבדל מסה של 2 דה תואם את הנוכחות של אג&quot;ח דיסולפיד חמצון 1, ולכן הבדל מסה של 8 דה ומעיד על הקיום של 4 אגרות חוב דיסולפיד (כצפוי) בהמדגם שאינו מופחת. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. ייצוג סכמטי של פרוטוקול הקרנת ביטוי תפוקה הגבוהה. שימוש בפרוטוקול זה, יכול להיבדק על ידי אדם אחד 96-384 תנאים בשבוע אחד בשיטות ידניות, או עד 1,152 תנאים עם הציוד חצי האוטומטי שתואר. פלסמידים ביטוי נבנים באמצעות טכנולוגיית שיבוט רקומבינציה כך שמטרות רבות יכולות להיות תת משובטות-בבת אחת. תנאי ביטוי ברגע מסיסים זוהו ומחשוף שבוצע, אם רוצה, את החלבון ניתן להמשיך לבקרת איכות כדי לבדוק את החמצון וטוהר, microassays ו / או ייצור בקנה מידה גדולה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" wiDTH = &quot;500&quot; /&gt; איור 2. סכמטי לשיבוט recombinational אוניברסלי ולבנות עיצוב. משיבוטי כניסת היעד, וקטורי ביטוי מרובים יכולים להיות תת שובטו בניסוי יחיד באופן תפוקה גבוה (עד 6 x 96 שיבוטים כניסה בשבוע). החלבון הביע מקודד תג שלו לטיהור זיקת ניקל. DsbC (חסר רצף אות periplasmic לביטוי cytoplasmic) שותף היתוך משמש להגברת מסיסות ו / או קיפול סיוע וחמצון נכון של חלבון המטרה. שים לב שרצף קידוד היעד צריך להכיל אתר פרוטאז TEV N-מסוף (ENLYFQ) אם מחשוף תג הוא רצוי. הבלעה בפינה השמאלית העליונה מראה את הייצור של השיבוטים הכניסה באמצעות וקטור תורם ורצפי היעד, שניתן להשיג על ידי PCR או סינתזת גן. יכולים גם להיות מושגת שיבוטים כניסה מאוספי שיבוט כניסה מסחריות. מערכות שיבוט recombinational מרובות זמינות, עם זאת אנו מנצלים syste Gatewayמ &#39;, כפי שמוצג בסכמטית. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. צינור הקרנת תפוקה גבוהה למטרות דיסולפיד עשיר מרובות. מטרות בתחילה הביעו כהתכה שלו-DsbC בציטופלסמה של BL21 (DE3) pLysS E. coli ב37/17 ° C באמצעות מדיום אוטומטי אינדוקציה (ZYP-5052). טיהור מבוצעת על שרף ניקל ואחרי זיהוי של מבנים מסיסים ידי אלקטרופורזה HTP (או עם כתם /-SDS נקודה). אם בסיבוב הראשון של הקרנת ביטוי הוא לא מוצלח, תנאי תרבות אלטרנטיביים ניסו. אם מבנים לייצר חלבונים מסיסים בתשואות גבוהות מספיק, microassays ובקרת איכות יכולה להתבצע, ואם נדרש, ניתן רדף ייצור בקנה מידה גדולה. למטרות שבו תשואות מסיסים הן לא מספיק גבוהות, הקרנת ביטוי יכולה להמשיך עם stra האלטרנטיביתוספות וטמפרטורות אז שותפי היתוך אחר וביטוי periplasmic. צעדים אופציונליים מסומנים על ידי תיבות מקווקוות. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. התקנת רובוט שולחן עבודה עבור פלטפורמת HTP. הפריסה של שולחן העבודה הרובוט שלנו נוזל טיפול מוצגת, אם כי יכול לשמש גם שולחנות עבודה חלופיים בתנאים שיש אתרים שווי ערך זמינים. ההתקנה מורכבת מתחנת שטיפה (WS) ל( ראש 8 ערוצי הטיפול נוזלי (LiHa)), שתי נושאות microplate עם 4 עמדות כל אחד (MP4, עמדות 1-4 ו5-8), תחנת חלל עם 2 עמדות (Te-Vacs, מיקומים 9 ו10), נושאת microplate עם 3 עמדות (MP3, ממקמת 11-13), שני שייקרים לצלחת עם 2 עמדות כל אחד (Te-השייקרים, ממקם 14-15 ו16-17) וספק לטיפים חד פעמי עם 3 עמדות (דיתי, ממקם 18-20). בנוסףמחדש הם שני ספקי מלונות לצלחות גם עמוקות ואחד לmicroplates (לא מוצג). החומרה המותקנת ברובוט הטיפול הנוזלי היא זרוע 96 רבת ערוצים (MCA96) לשימוש עם טיפים חד פעמי, ראש 8 ערוצי טיפול נוזלי (LiHa) עם טיפים קבועים ומניפולטור רובוטית (רומא) שזז צלחות / ציוד מסביב על שולחן העבודה. המספור של העמדות מכונה לאורך כל הפרוטוקול. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. סכמטי להעברה מצלחת 96 היטב אחת לארבע 24 גם צלחות. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6. נציג תוצאות מוצגות על מסך הביטוי של 96 פרו ארס דיסולפיד עשירteins. החלבונים באו לידי ביטוי כהתכה שלו-DsbC בציטופלסמה ומטוהר באמצעות 50 μl של שרף ניקל (פרוטוקול 8.2-B).) תוצאות ביטוי הקרנה, מראה ג&#39;ל הווירטואלי ורחוק לתשואת הביטוי. לעומת זאת בג&#39;ל הווירטואלי הותאם נתיב לנתיב, כדי לפצות על להקות קלושות מאוד או אינטנסיבית. שימו לב כי עבור חלק ממטרות שניתן לראות שתי להקות, הלהקה העליונה מקבילה לחלבון ההיתוך שלם והרצועה התחתונה מתאימה לתג ההיתוך לבד. ב &#39;) חלקם של חלבונים המתבטאים בכל רמת ביטוי בהשוואה למספר של איגרות חוב דיסולפיד ב החלבון. המספר האמיתי של חלבונים בכל קבוצה הוא יכסה על גרף. C) ההפצה של רמות ביטוי המבוסס על נקודה איזואלקטרית (PI) ומספר השאריות. ד &#39;) דוגמא לתוצאות ספקטרומטריית מסה לארס דיסולפיד עשיר 5.7 kDa חלבון עם 4 קשרי דיסולפיד. הספקטרום עלבצד השמאל מציג את החלבון לפני הפחתה עם DTT והקשת בצד ימין מציג את החלבון מופחת עם DTT ולאחר מכן desalted. היונים המתאימים להמונים הניסיוניים מסומנים בחיצים וההקצאות שלהם מוצגות בצבע ירוק. ההמונים הניסיוניים לחלבון לפני ההפחתה ולאחר ההפחתה מוצגים בטבלה ולהציג את הבדל מסה של 8 דא, מתאים לנוכחות של חלבון חמצון לפני תוספת של צמצום סוכן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> מתכון </td><td> הערה </td></tr><tr><td> ZY </td><td> ~ 928 מיליליטר 10 גרם tryptone תמצית שמרים 5 גרם 925 מיליליטר מים </td><td> מערבבים ולאחר מכן חיטוי לעקר. </td></TR&gt; <tr><td> 2 M MgSO 4 </td><td> 100 מיליליטר 49.3 גרם MgSO 4 · 7H 2 O ~ 60 מיליליטר מים </td><td> מערבבים עד שהיא נמסה אז חיטוי לעקר. </td></tr><tr><td> 50x 5052 </td><td> L 1 250 גליצרול גרם 730 מיליליטר מים 25 גרם גלוקוז 100 גרם α-קטוז </td><td> להוסיף ברצף, מערבבים על אש עד שכל מומס אז חיטוי לעקר. </td></tr><tr><td> 20x NPS </td><td> L 1 900 מיליליטר מים 66 גרם (NH 4) 2 SO 4 136 KH גרם 2 PO 4 142 גרם Na 2 HPO 4 </td><td> להוסיף ברצף ומערבבים עד שכל מומס אז חיטוי לעקר. </td></tr></tbody></table> טבלת 1. מתכון לרכיבים של מדיום ZYP-5052.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli at JoVE.com

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

פרוטוקול לביטוי כמותית, תפוקה הגבוהה הקרנה וטיהור אנליטי של חלבוני היתוך מתרבויות חיידקי Escherichia בקנה מידה קטנה מתואר ומוחל על הביטוי של מטרות חלבון הארס של בעלי החיים דיסולפיד עשיר.

הקרנת תפוקה גבוהה ביטוי כמותי וטיהור יישומים לחלבוני ארס רקומביננטי דיסולפיד עשירים הופק ב<em&gt; א coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

ביטוי של חלבונים רקומביננטי השמרים Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

טיהור ללא chromatographic של פוליפפטידים דמויי אלסטין רקומביננטי וFusions עם פפטידים וחלבונים מן<em&gt; חיידקי Escherichia</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

טיהור וקפל שוב לעמילואיד סיבים של (שלו)<sub&gt; 6</sub&gt; חלבון רקומביננטי Shadoo -tagged מבוטא גופי הכללה ב<em&gt; חיידק</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...