Name: super-resolution imaging of the cytokinetic z ring in live bacteria using fast 3d-structured illumination microscopy (f3d-sim)
Uploaded: 2014-09-29T14:00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM at JoVE.com

The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.

<ol>
	<li>Harry, E., Monahan, L., Thompson, L., Kwang, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Cell+Division+The+Mechanism+and+Its+Precison.">Bacterial Cell Division The Mechanism and Its Precison.</a> Int Rev Cytol. 253, 27-94 (2006).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19, 780-782 (1994).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys j. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed (English). 47, 6172-6176 (2008).</li><li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+Diffraction+Barrier+in+Fluorescence+Microscopy+by+Optical+Shelving.">Breaking the Diffraction Barrier in Fluorescence Microscopy by Optical Shelving.</a> Phys Rev Lett. 98, 218103 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophys J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320, 1332-1336 (2008).</li><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+modulated+excitation+microscopy:+Improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating.">Lateral modulated excitation microscopy: Improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> Proc SPIE 3568. , 185-195 (1999).</li><li>Gould, T. J., Burke, D., Bewersdorf, J., Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+enables+3D+STED+microscopy+in+aberrating+specimens.">Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens.</a> Opt Express. 20, 20998-21009 (2012).</li><li>Urban, N. i. c. o. l. a. i. . T., Willig, K. a. t. r. i. n., Hell, S. t. e. f. a. n. . W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices.">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys J. 101, 1277-1284 (2011).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 1607-1611 (2011).</li><li>Strauss, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-SIM+Super+Resolution+Microscopy+Reveals+a+Bead-Like+Arrangement+for+FtsZ+and+the+Division+Machinery+Implications+for+Triggering+Cytokinesis.">3D-SIM Super Resolution Microscopy Reveals a Bead-Like Arrangement for FtsZ and the Division Machinery Implications for Triggering Cytokinesis.</a> PLoS biol. 10, e1001389 (2012).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Rev Microbiol. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E+coli+cell+fission.">Advances in understanding E coli cell fission.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 730-737 (2010).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+physics+of+FtsZ+assembly+and+force+generation.">Modeling the physics of FtsZ assembly and force generation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 9238-9243 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+in+Bacterial+Cytokinesis+Cytoskeleton+and+Force+Generator+All+in+One.">FtsZ in Bacterial Cytokinesis Cytoskeleton and Force Generator All in One.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74, 504-528 (2010).</li><li>Lan, G., Wolgemuth, C. W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-ring+force+and+cell+shape+during+division+in+rod-like+bacteria.">Z-ring force and cell shape during division in rod-like bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16110-16115 (2007).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Contractile+FtsZ+Rings+in+Liposomes.">Reconstitution of Contractile FtsZ Rings in Liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 11000-11004 (2013).</li><li>Murphy, G. E., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography.">Electron cryotomography.</a> BioTechniques. 43, 413-415 (2007).</li><li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+plasmid-based+system+that+allows+rapid+generation+of+tightly+controlled+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus.">A simple plasmid-based system that allows rapid generation of tightly controlled gene expression in Staphylococcus aureus.</a> Microbiology. 157, 666-676 (2011).</li><li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolution+Dissection+of+Coordinated+Events+during+Malaria+Parasite+Invasion+of+the+Human+Erythrocyte.">Super-Resolution Dissection of Coordinated Events during Malaria Parasite Invasion of the Human Erythrocyte.</a> Cell Hos., &amp; Microbe. 9, 9-20 (2011).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26, 4694-4708 (2007).</li></ol>

This publication is sponsored by GE Healthcare.

الفلورسنت التصوير الخلية الحية هو أداة قوية تتيح مراقبة التغيرات الدينامية داخل الخلايا مع مرور الوقت. وقد تم تصوير حي من الأحياء الخلية البكتيرية صعبة بسبب حجم الخلايا الصغيرة وانخفاض قدرة الخلايا البكتيرية على تحمل التعرض المتكرر للضوء الإثارة. F3D-SIM توسعت الأدوات المتاحة لاستجواب كل بيولوجيا الخلية ولكن من الضروري القيام بعناية هذه التقنية كما يمكن إدخال القطع الأثرية إذا ما نفذت بشكل سيئ. هناك عدد من الاعتبارات الهامة لنجاح استخدام هذه التقنية. كما هو طريقة التصوير مضان واسعة المجال التي تعتمد على استخدام وظيفة انتشار نقطة ضوء المنبعث، وعدم تطابق مؤشر الانكسار انحراف كروية من الضوء المنبعث يجب تجنبها لتمكين إعادة الإعمار صورة دقيقة. استخدام coverslips من 0.17 مم سمك من نوعية عالية لتجنب اختلاف كثافة إشارة نظرا لسماكة الزجاج التباين في الأغطيةينصح بشدة الشفة. ومن الأهمية بمكان لتقييم بعناية انحراف كروية من الضوء المنبعث أثناء المراحل الأولية من جميع التجارب وضبط معامل الانكسار النفط الغمر حسب الحاجة. هذا قد تختلف من يوم إلى يوم كما أنها تعتمد على كل من درجة الحرارة وتزايد وسائل الإعلام / الركيزة العينة. فإن استخدام زيت غير صحيحة يؤدي إلى إعادة البناء أدنى من الصور مع التحف مثل هالات وإشارات الصدى. في نهاية عملية إعادة الإعمار صورة، لكل مرحلة مقياسا لجودة إعادة الإعمار ويمكن الحصول على &quot;أفضل لائقا للKO زاوية&quot; لكل مرحلة / زاوية الإضاءة. إذا كانت هذه القيمة أقل من 1 لكل زاوية، ثم نوعية بناؤها على الأرجح أن تكون عالية. إذا كانت هذه القيمة فوق 6، فمن الأرجح أن الصورة التي أعيد بناؤها ستحتوي التحف. وتشمل القطع الأثرية المشتركة ط) ظهور خطوط في الصورة التي تتوافقإلى واحدة من زوايا الشبكة. قد يؤدي هذا إشارة من أقل من هذه الزاوية الشبكة. ب) haloing حول الهياكل. قد ينتج هذا عن مستويات متفاوتة جدا من إشارة من الهياكل مشرق مقارنة الهياكل المحيطة بها، وعدم تطابق معامل الانكسار من النفط والعينة أو قد يكون بسبب الهياكل في صورة كونها غير متبلور جدا والتي لا تحتوي على ما يكفي من &quot;هيكل&quot; أن تكون معترف بها من قبل الخوارزمية. ج) &quot;honeycombing&quot; الذي ينتج عن إشارة إلى انخفاض نسبة الضوضاء في الصورة، وعادة بسبب ارتفاع إشارة الخلفية؛ د) الهياكل التي امتدت / ممدود في س ص التي قد تكون بسبب عدم تطابق مؤشر الانكسار النفط والعينة. هذه الأداة من الصعب تمييز للمستخدم عديم الخبرة. فمن المستحسن أن المستخدمين الجدد استشارة باحث SIM من ذوي الخبرة لتقديم المشورة بشأن تفسير الصور والتحليل عند البدء في استخدام هذه التقنية. كما هو الحال مع جميع تجارب التصوير الخلية الحية الفلورسنت، هو استيرادنملة إلى توازن دقيق للمدخلات طاقة الإثارة من أجل تقليل درجة photobleaching من والضيائية من الخلايا مع إشارة كافية الانبعاثات اللازمة لإعادة بناء الصور مع الحد الأدنى من القطع الأثرية. سوف photobleaching من الإفراط (أكبر من 30٪ عبر الاستحواذ ض المكدس واحد) يؤدي إلى نمط شريطية في الصورة أعيد بناؤها. مع استخدام الكاميرات sCMOS والصور فائقة الدقة يمكن بناؤها بنجاح من الصور الخام مع إشارة انبعاثات منخفضة تصل إلى 1،000 التهم فوق الخلفية. هذا يمكن أن تسمح لمرات التعرض قصيرة جدا وبالتالي تقليل photobleaching من وتمكين التقاط السريع لكل إطار. كما أنه يزيد من مقدار الوقت بين الإطارات للخلايا للتعافي من مدخلات طاقة الإثارة. بالإضافة إلى ذلك، كما في الوقت التقاط لكل إطار على حدة يمكن أن تكون قصيرة جدا، يتم تقليل درجة من القطع الأثرية التي أدخلتها &#39;الضبابية&#39; أثناء القبض على الأفراد مع استخدام هذا الأسلوب. هذا فاريمن أوجه 3D-SIM تقدم عددا من المزايا الأخرى خلال فائقة المتاحة وعالية الدقة التصوير تقنيات أخرى للتصوير الحي من قبل علماء الأحياء الخلايا البكتيرية. 2 أضعاف الزيادة في القرار في جميع أبعاد 3 والقدرة على صورة يصل إلى 30 ميكرون في عينة تمكن من تصوير الخلايا البكتيرية (والثدييات) كلها خلال التجربة. تقنيات مثل واحد جزيء التعريب التي يتم تنفيذها عادة في موجة زائل لا يمكن أن تحقق عمق تغلغل في عينة ولا تقدم المعلومات على الخلايا بأكملها. التطورات الحديثة التي تسمح أعماق أخذ العينات أعلى لهذه التقنية قد تؤدي في القرار المحوري أفضل الخلايا بأكملها. بالإضافة إلى ذلك، وتقنيات التعريب واحد جزيء التي تتطلب الآلاف من الصور الخام محدودة أيضا في معدل الإطار الذي يمكن التقاطها وربما تتطلب تسوية بين القبض ومعدل الإطار في نهاية المطاف القرار المكانية التي تحققت، حيث أن القرار المكانية التي سيتم شراؤها تعتمد على عدد من ليلةاليلة المسجلة ضمن مساحة محددة. وخفض عدد الإطارات الملتقطة يؤدي إلى انخفاض القرار المكانية ولكن قد يكون كافيا لتحقيق الاستبانة الزمنية اللازمة لعملية بيولوجية من الفائدة. قد تحتاج كمية الانتعاش مرة بين الإطارات أيضا إلى زيادة للحد الضيائية في الخلايا الحية مما يحد من مدة وتردد في ذلك الوقت سلسلة يمكن الحصول على. تقنيات عالية الدقة مثل المجهر الإلكتروني (EM) أو الإلكترون cryotomography (ECT) عرض قرار زيادة مدى 3D-SIM (وتقنيات المجهر الضوئي فائقة الدقة أخرى) ولكن يجب أن تجرى على عينات ثابتة. لتحديد ومعالجة قد يعرض القطع الأثرية وعدم وضع العلامات قد تجعل من الصعب تفسير. خالية من التسمية ECT على النقيض الفقراء ويمكن تحقيق اختراق أعماق عينة من حوالي 500-200 نانومتر 24، لذلك حتى لو كان البروتين من الفائدة يمكن تحديدها، لا يمكن ملاحظة هيكل البروتين في الخلية البكتيرية بأكملها.حتى عندما يمكن استخدامها في وضع العلامات EM، مثل مع immunogold، يتم إجراء التصوير فقط في 2D. 3D هو تحقيقه فقط مع باجتزاء رقيقة وإعادة الإعمار الحسابية الأقسام. وباجتزاء رقيقة يتطلب فني من ذوي الخبرة ولكن يمكن أن يكون مشكلة وتؤدي إلى قطعة أثرية. مع الخلايا الحية أو ثابتة، 3D-SIM لا تحتاج إلى تكون جزءا لا يتجزأ بطريقة محددة والخلايا يمكن أن تكون على استعداد للتصوير بسرعة في حالة الأم القريب. هذه الطريقة سهلة نسبيا لتنفيذ من قبل الباحثين من ذوي الخبرة في الحد الأدنى المجهر الفلورسنت. التجارب لا يمكن أن يؤديها في وسائل الإعلام التي تدعم وظيفة خلايا صحية طالما أنه لا يتألق أو توليد إشارة الخلفية لا داعي لها. عن الخلايا البكتيرية، وهذا يمكن أن تسمح باستخدام أنواع عديدة من مجمع والحد الأدنى من وسائل الإعلام أو استخدام وسائل الإعلام صلبة أو شبه صلبة للسيطرة على الحركة الخلية البكتيرية. العديد من علماء الأحياء الذين المهندسة بالفعل البروتين الفلوري (FP) اندماج واختبار وظيفةيمكن لهذه اندماج يستغرق فترة تصل هذه التكنولوجيا بسرعة دون مزيد الهندسية والتحقق من صحة مع اندماج FP photoactivatable جديدة. لقد وجدنا، وملاحظة عامة، أن S. كانت العنقودية الذهبية أكثر عرضة للphotobleaching من خلال التصوير مع اندماج FP من B. الرقيقة. استخدام لدينا الأصلي أساليب 3D-SIM، حيث تم إنشاء نمط الشبكة من قبل صريف المادي، كنا قادرين على أداء تصوير الخلايا الحية مع عدد من S. اندماج الذهبية FP. ولكن، مع هذا الأسلوب المتقدم F3D-SIM، كنا قادرين على اندماج هذه الصورة FP وتنفيذ سلسلة زمنية قصيرة لالتقاط ديناميات هذه البروتينات الموسومة. هذا ويرجع ذلك إلى انخفاض مرات التعرض اللازمة للتصوير وزيادة الوقت بين الإطارات للانتعاش خلية الأرجح. OMX السعير 3D-SIM هو التكنولوجيا المتاحة تجاريا التي يمكن تنفيذها بسهولة نسبيا في مختبر واحد أو مرفق التصوير الأساسية. يجب توخي الحذر لأداء الأسلوب لتجنب ARTIحقائق بسبب ضعف إعداد العينات أو ضعف التقاط الصور. بمجرد يتقن هذه التقنية، يمكن إجراء دراسات لبنية البروتين وديناميكية في الكائنات الصغيرة مثل البكتيريا في واحد أو متعدد الألوان مضان.

تم استخدام عدد من تقنيات التصوير المختلفة على مر السنين لدراسة البكتيريا بما في ذلك مختلف الإلكترون المجهري والتقنيات البصرية. في حين يقدم المجهر الإلكتروني عالية للغاية القرار، وصولا الى نانومتر، والحاجة إلى فراغ واستخدام عوامل التباين قد حد من هذه التقنية لعينات الثابتة والمدمجة. ويمكن أيضا إدخال القطع الأثرية بسبب مطول إعداد العينات وهناك حاجة إلى ممارس المهرة لإعداد العينات، وتحليل وتفسير الصور الناتجة. المجهر الضوئي يوفر فوائد بساطة إعداد العينات وتطبيق تسميات متعددة مع السهولة النسبية مقارنة مع المجهر الإلكتروني. باستخدام البروتينات الفلورية وتقارن صبغ، والقدرة على دراسة الخلايا الحية مع مضان المجهري هو ممكن أيضا. مع تحسينات في الاستقرار fluorophore وبروتين فلوري حجم / هيكل مما يؤدي إلى انخفاض سمية الخلايا، فضلا عن التقدم في الكشف عن كاميرا ميتاليكology، المجهري مضان باستخدام أنظمة التصوير مبائر واسعة المجال، وتوسعت بشكل كبير من فهمنا لديناميات المكانية من الخلايا. باستخدام هذه التقنيات، معرفتنا الخلية البكتيرية على مدى السنوات ال 20 الماضية قد تقدم كثيرا إلى نظرة أكثر تفصيلا بكثير مما يكشف عن مستوى عال من التنظيم الهيكلي والبروتين داخل الخلية البكتيرية 1. ومع ذلك، الأساليب التقليدية للالمجهر الضوئي هي حيود محدود، وهذا يعني أن القرار الأصيل هو ما يقرب من نصف الطول الموجي للضوء الإثارة المستخدمة. ونتيجة لذلك، حتى مع النظام التقليدي المجهر الضوئي الأكثر الأمثل، وأفضل قرار الجانبي حوالي 220-250 نانومتر، والقرار المحوري حوالي 500 نانومتر (للمراجعة نرى Schermelleh وآخرون. 2). لعلماء الأحياء الخلايا البكتيرية على وجه الخصوص، وهذا لا يزال يحد بشدة فهمنا للمنظمة المكانية من هذه الخلايا الصغيرة؛ يجري فقط 1-2 ميكرون في بقطرالعطر و1-10 ميكرون في الطول. وهناك أيضا حاجة إلى تقنيات عالية الدقة التي يمكن القيام بها على الخلايا الحية حيث يمكن تحليل السلوك المكاني الديناميكي للبروتين لاستكمال البيانات في المختبر. على مدى العقد الماضي، وضعت عدة تقنيات التصوير مضان فائقة القرار. يصف فائقة قرار المجهري تقنيات التصوير التي على الأقل ضعف القرار الجانبي الحصول عليها مع ضوء المجهر التقليدي، وبالتالي التغلب على حاجز الحيود. هذه التقنيات التلاعب الإضاءة و / أو تحليل الضوء المنبعث لخلق الزيادات الحقيقية في القرار واضح. يوجد حاليا ثلاثة أنواع رئيسية من تقنيات فائقة الدقة - ط) حفز نضوب الانبعاثات المجهري 3 (STED). ب) المجهر واحدة جزيء التوطين، بما في ذلك تقنيات مثل تنشيط ضوئي توطين 4،5 المجهري (PALM)، ستوكاستيك المجهر الضوئي إعادة الإعمار <sتصل&gt; 6 (STORM)، STORM المباشر 7 (dSTORM)، والأرض استنزاف الدولة مع عودة جزيء الفردية 8 (GDSIM). والثالث) إضاءة منظم المجهري 9-12 (SIM). تقدم تقنيات التعريب واحد جزيء أكبر الزيادات في القرار الجانبي، وصولا الى ما بين 10-40 نانومتر في العينات البيولوجية. في العديد من التطبيقات من جزيء واحد توطين المجهري، وعمق أخذ العينات يقتصر على موجة زائل وتطبيقات أولية STED كانت محدودة أيضا في عمق أخذ العينات. تحسينات ومع ذلك، التطورات الأخيرة مثل استخدام البصريات التكيفية، واستغلال الاستجماتيزم في وظيفة انتشار نقطة في نقاط الاتصال المختلفة، شهدت الكشف عن طائرة متعددة وباستخدام هدفين للاستدلال على الموقف المحوري للضوء المنبعث في كل من محوري قرار وأخذ العينات أعماق في كل جزيء واحد STED توطين 13،14. معدلات الحصول على البيانات لSTED وتقنيات التعريب واحد جزيءهي أيضا بطيئة نسبيا نظرا لعدد كبير من الصور التي تحتاج إلى الحصول عليها لأقصى دقة ممكنة (تصل إلى 50،000 لتقنيات التعريب). هذا الحصول على البيانات بطيئة لا تصلح لتصوير العينات الحية بدون تعديلات المخصصة التي غالبا ما تكون باهظة التكاليف. حاليا تناسب هذه التقنيات اثنين الأمثل للعينات ثابتة (للمراجعة رؤية 2،15)، ومع ذلك، يجري الكثير من العمل لمعالجة هذا القيد. ثلاثي الأبعاد منظم إضاءة المجهر (3D-SIM) هي تقنية واسعة المجال الذي يحسن قرار الجانبي والمحوري على حد سواء مما أدى إلى قرارات ما يقرب من 110 و 280 نانومتر، على التوالي. عمق أخذ العينات هو ما يصل الى 30 ميكرون من ساترة، والسماح لتصوير الخلايا بأكملها. تباين 3D-SIM التي وضعتها سيدات، أجارد، وGustaffsson على (OMX) منصة بصري المجهر التجريبية يتضمن إلقاء الضوء على عينة مع نمط الشبكة المعروفة التي انتقلت الى مختلف 15مناصب في كل طائرة ض 9-11. يتم قياس هامش في أنماط تموج في النسيج الناتجة التي تم إنشاؤها في الحيز الترددي خارج المنطقة يمكن ملاحظتها. المعلومات من الحيز الترددي هي أعيد بناؤها حسابيا لتوليد فائقة دقة وضوح الصورة المرئية 10،11. السرعة النسبية في الصور الخام التي يمكن الحصول عليها باستخدام هذه التقنية تمكن من تصوير الخلايا الحية. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن العمليات البيولوجية التي تحدث لعلى نطاق ومرة ​​ثانية، فإن معدل الاستحواذ على الصور الخام لا تزال بطيئة جدا لالتقاط التغيرات الدينامية. لالسلاسل الزمنية بمعدل القبض على ثوان، يمكنك اكتساب المتكررة دون وقت كاف يؤدي إلى الانتعاش الضيائية photobleaching من و، وخصوصا خلال التصوير الحي من الخلايا البكتيرية صغيرة. للتغلب على هذه المشاكل، وقد وضعت التطورات الأخيرة لسرعة 3D-SIM (SIM-F3D). نحن هنا وصف أحد يعرف OMX الحريق 16 التي كانت طntroduced في أواخر عام 2011. هذه التكنولوجيا يخلق نمط الإضاءة من دون استخدام شبكة المادية كما كان يستخدم في النظم السابقة. استخدام التدخل ضوء الحزم والتكنولوجيا مصراع الجديدة يسمح لخلق ضوء منقوشة على العينة بطريقة سريعة جدا. تم تعزيز سرعة الحصول على الصور كذلك مع إدخال العلمي مكمل معدن أكسيد أشباه الموصلات (sCMOS) الكاميرات، وخصوصا عندما بالمقارنة مع الكاميرات EMCCD القائمة. أدت هذه التغيرات في معدل الممكن الحصول على الصور من إطار واحد في الثانية لعمق أخذ العينات من 1 ميكرون (512 x 512 بكسل، 9 ض شرائح)، مما يتيح رصد التغيرات الديناميكية التي تحدث داخل الخلايا في غضون ثوان 16. انخفاض واضح في التعرض (الإثارة) مرات للعيش الخلايا باستخدام هذا الأسلوب يسمح إما سلسلة زمنية ممتدة ليتم القبض أو زيادة في معدل الالتقاط. نحن هنا وصف تطبيق F3D-SIM المجهري لexaminالبريد هيكل والحركة الديناميكية للZ حلقة cytokinetic في خلايا اثنين من الأنواع البكتيرية: نموذج كائن العصوية الرقيقة على شكل قضيب والممرض البشري مكوراتي المكورات العنقودية الذهبية. FtsZ هو هيكل الخلية البروتين مثل تويولين التي تلعب دورا رئيسيا في انقسام الخلية في البكتيريا 17،18. فإنه يموضع الى الموقع تقسيم لتوظيف ما لا يقل عن 20 البروتينات الانقسام أخرى، وتشكيل جهاز 17،18 التقسيم، ويعتقد لتوفير القوة لخلية انقباض 19-23. يكشف هذا الأسلوب أن يتم توزيع FtsZ بتباين حول الحلبة Z في كل الكائنات في ترتيب تشبه حبة. حل القضية منذ فترة طويلة سواء من الحلبة Z هو حزام موحدة المستمر حول الخلية، كما تصور من قبل التقليدي المجهري مضان واسعة المجال، أو بنية متقطع كما اقترح الإلكترون البرد التصوير المقطعي (ECT) 24. وتبين لنا كيف أن قدرة 3D-SIM يمكن أن تحسن بشكل كبير فحص المكاني للصغيرة (1قطرها ميكرون) خلايا مستديرة مثل S. الذهبية التي تقسم في ثلاث طائرات عمودية متتالية (س، ص، ض). تظهر الدراسات الوقت الفاصل بين استخدام هذه التقنيات أن هيكل الحلقة Z ديناميكي، مع تغييرات جسيمة منظمة داخل الحلبة، بدلا من جزيئات FtsZ يدخلون ويخرجون من سقالة ثابتة 24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Agarose I (Biotecnology grade)</td>
			<td style="width:161px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:119px;">0710-500G</td>
			<td style="width:167px;">Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64)</td>
			<td style="width:161px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T-13320</td>
			<td style="width:167px;">Lipophylic dye used for staining cell membranes.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">1.5 ml microtube, graduated Natural</td>
			<td>Scientific specialties Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1210-00</td>
			<td style="width:167px;">Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Luria broth base, Miller&#160;</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">241420</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions. Add 2%?? after autoclaving&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">210932</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Adhesive frame</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ABGAB-0577</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microscope cover glass</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">111512-9</td>
			<td style="width:167px;">22x22 No 1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom</td>
			<td style="width:161px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:119px;">FD35-100</td>
			<td style="width:167px;">Known as FluoroDish with this company. Dish: &#216;35mm, Glass: &#216; 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0378-25G</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lincomycin hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L6004-5MU</td>
			<td style="width:167px;">Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Erythromycin&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Boehringer Mannheim GmbH</td>
			<td style="width:119px;">12390120-14</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Combined Orbital/Linear Shaking waterbath&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Grant scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">OLS-200</td>
			<td style="width:167px;">Shaking speed used for cultures: 215 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">UV visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:119px;">UV-1601</td>
			<td style="width:167px;">600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415R</td>
			<td style="width:167px;">Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15502-10G</td>
			<td style="width:167px;">Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">softWoRx software</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;">version 5.0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Imaris data analysis software</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane Scientific Software, Bitplane AG</td>
			<td style="width:119px;">version 7.0.0</td>
			<td style="width:167px;">Matlab XTensions included</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module.</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Blaze module fitted on OMX V3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss Axioplan 2&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of the cytokinetic z ring in live bacteria using fast 3d-structured illumination microscopy (f3d-sim)

التصوير من العينات البيولوجية باستخدام المجهر مضان تقدمت بشكل كبير مع التكنولوجيات الجديدة للتغلب على قرار حاجز حيود الضوء السماح فائقة الدقة من العينات الحية. يوجد حاليا ثلاثة أنواع رئيسية من تقنيات فائقة الدقة - حفز نضوب الانبعاثات (STED)، واحدة جزيء التوطين المجهري (بما في ذلك تقنيات مثل النخيل، STORM، وGDSIM)، ومنظم المجهري إضاءة (SIM). في حين تشير توطين تقنيات STED واحد جزيء أكبر الزيادات في القرار، فقد كانت أبطأ لتقديم زيادة سرعات من الحصول على الصور. SIM ثلاثي الأبعاد (3D-SIM) هي واسعة المجال المجهري مضان تقنية أن تقدم عددا من المزايا على حد سواء واحدة جزيء التوطين وSTED. تم تحسين القرار، مع قرارات نموذجية الجانبية ومحوري من 110 و 280 نانومتر، على التوالي وعمق أخذ العينات تصل إلى 30 ميكرون من ساترة، والسماح لالتصوير الخلايا بأكملها. التطورات الأخيرة (سريع 3D-SIM) في التكنولوجيا زيادة معدل التقاط الصور الخام تسمح لالتقاط سريع من العمليات البيولوجية التي تحدث في ثوان، في حين خفض ملموس الصور وphotobleaching من سمية. نحن هنا وصف استخدام واحدة من هذه الطريقة لصورة الخلايا البكتيرية إيواء fluorescently البروتين المسمى cytokinetic FtsZ لاظهار كيف يتم تحليل الخلايا ونوع المعلومات الفريدة التي يمكن أن توفر هذه التقنية.

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

فائقة الدقة التصوير من Cytokinetic Z الدائري في البكتيريا تعيش طريق سريع منظم 3D الإضاءة المجهري (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

تصور البكتيريا في نيماتودا باستخدام المجهر الفلورسنت

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

فائقة التصوير القرار من ماكينات شعبة الجرثومي

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

ثلاثي الأبعاد فائقة الدقة المجهر من الشعيرات F-أكتين من التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

تطبيق القرار فائقة السرعة سرعة الفحص المجهري في هدب الأولية الحية

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

وضع علامات محددة من النيوكليويدات الميتوكوندريا لمرور الوقت المجهر الإضاءة منظم

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...