Name: super-resolution imaging of the cytokinetic z ring in live bacteria using fast 3d-structured illumination microscopy (f3d-sim)
Uploaded: 2014-09-29T14:00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM at JoVE.com

The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.

1. Prøvefremstilling <ol><li> Fremstilling af B. subtilis-Celler til Imaging <ol><li> Podes 10 ml Penassay Broth (PAB, også kendt som Antibiotisk Medium 3) med en enkelt koloni af B. subtilis stamme SU570 (168 trpC2 ftsZ :: ftsZ-GFP-spec) 16. Grow natten over i en lav hastighed (100 rpm) ryster ved 30 ° C. </li><li> Fortynd overnatskulturen 0,05 A 600 (absorbansen måles ved 600 nm) i frisk PAB ved 30 ° C med høj hastighed (215 rpm) rystelser og vokse indtil midten eksponentielle fase (A 600 ~ 0.4). </li><li> Der tilsættes 2 g elektroforese-agarose i 100 ml 1x vækstmedium (PAB) i et skruelåg glasflaske. Opløses agarosen ved autoklavering. Dette kan opbevares ved 4 ° C i nogle få måneder, og microwaved at smelte agarosen, når det kræves. Lad det stå ved stuetemperatur. </li><li> Vedhæft en selvklæbende ramme (65 ul kapacitet, se tabel Materialer) på en standard glass objektglas. For at gøre dette, fjerne den tynde polyesterark (hver selvklæbende ramme er placeret mellem to polyester ark, en tynd og en tyk, og har den midterste firkant fjernet) og anvende den eksponerede klæbende overflade af rammen til overfladen af ​​objektglasset. Dette skaber effektivt en firkantet godt oven på objektglasset. Lad tyk polyesterark fastgjort til rammen, da dette vil forhindre dækglas klæber til det efterfølgende trin. </li><li> Smelt agaroseopløsningen i en mikrobølgeovn indtil kogning og pipetten 67 pi i klæbemidlet rammen. Umiddelbart placere et dækglas på toppen for at skabe en flad overflade og henstår ved stuetemperatur i 5-10 min. Fjern dækglasset 1-2 min, medens prøven høstes. </li><li> Harvest en 1 ml portion af prøven og centrifugeres ved 5.900 xg i 30 sek. Derefter dekanteres den klare, og pellet resuspenderes i 200 pi frisk PAB. </li><li> Tag 2,5 ul af koncentrerede prøve afpipetteres på en præ-slemt efterrød agarose pad. Prøven spredes jævnt langs den flade overflade af agarose puden. Fjern den klæbende ramme fra objektglasset med en pincet uden at røre agarose pad. </li><li> Overfør agarose puden fra mikroskopobjektglasset til 35 mm i diameter petriskål med et dækglas bund. Vend agarose puden, således at cellesuspensionen og dækglas af petriskålen er i direkte kontakt med hinanden. Bunden af ​​petriskålen har et brydningsindeks på 1.525 til høj opløsning billeddannelse. </li></ol></li><li> Fremstilling af Levende S. aureus Celler til Imaging <ol><li> Podes 10 ml L-bouillon med en enkelt koloni af S. aureus stamme SA94 (SH1000 indeholdende plov-FtsZ-GFP og pGL485, Erm r, Cmr) 25. Grow natten over i en lav hastighed (100 rpm) roterende rysteapparat ved 37 ° C. </li><li> Fortyndes natten over kultur 0,05 A 600 (absorbans målt ved 600 nm) i frisk L-bouillon med 0,05 mM IPTG (isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid) til at inducere produktion af fusionsproteinet. </li><li> Der inkuberes ved 37 ° C med høj hastighed (215 rpm) rystelser og vokse indtil midten eksponentielle fase (A 600 ~ 0.4). </li><li> Følg trin 1.1.3 - 1.1.8, som beskrevet for B. subtilis forberedelse levende celle. Bemærk: Tilsæt passende koncentration af induktor til agaroseopløsningen i trin 1.1.3 for stammer, der udtrykker en fluorescerende fusionsprotein under inducerbar kontrol. </li></ol></li></ol> 2. Udarbejdelse af mikroskopet Denne metode bruger en DeltaVision OMX (optisk mikroskop, eksperimentel) 3D-SIM imaging system udstyret med et Blaze modul. Til beskrevet forsøgene kun én laser og et kamera. Belysningen og strålegang er beskrevet i figur 1. Denne fremgangsmåde forudsætter, at mikroskopet har en passende kalibrering, optiske overføringsfunktion (OTF)filer og lys kollimation vedligeholdelse udført. <ol><li> For levende celle billeddannelse eksperimenter, så sørg for at varme scenen er knyttet til den keramiske scene og målet opvarmning krave er knyttet til målsætningen (60X 1,42 NA objektiv olie). </li><li> Tænd de objektive og scene varmeapparater mindst 4 timer forud for billedbehandling og langsomt rampe temperaturen til den ønskede indstilling med en maksimal hastighed på 5 ° C / time. Det anbefales at starte denne proces aftenen før billeddannelse og rampe ved 3 ° C / 4 timer. For levende celle eksperimenter med B. subtilis, er de fleste eksperimenter udført ved 30 ° C. For S. aureus, er alle forsøg udføres ved 37 ° C. </li><li> På dagen for eksperimentet, tænde systemet mindst 1 time før billedbehandling, så systemet og lasere til at stabilisere sig helt. Læg den lille skål scene indsatsen på den opvarmede scenen for at forvarme. <ol><li> Tænd master controller arbejdsstation. </li><li> Tænd for billedbehandling workstation. </li><li> Tænd kameraet køler placeret på gulvet uden mikroskop kabinet. </li><li> Tænd alle sCMOS kameraer (selv om de ikke alle vil blive brugt). </li><li> Inde laseren og elektronik kabinet, tænd: <ol><li> Instrumentkontrolleren chassis. </li><li> Nanomotion chassis. </li><li> Jena controller til Z piezo. </li><li> Alle 4 galvo motorstyringer. </li><li> Primær laser styreenhed. </li><li> Sekundær laser styreenhed. </li><li> Alle kamerafunktioner arbejdsstationer. </li><li> OMXIC arbejdsstation. </li></ol></li><li> På den overordnede styring arbejdsstation, skal du åbne OMX-softwaren ved at klikke på ikonet. Angiv stien til lagring af data til en passende mappe data. </li><li> Til at initialisere hardwaren, gå til menuen Hardware skal du vælge Hardware og klik på knappen Genstart Hardware. Luk vindue. </li><li> Start softWoRx software.Turn laserne kræves til forsøgene (488 nm). </li><li> Tænd nøglekontakten til laser sikkerhedsblokeringslås. </li><li> Sørg for korrekt dichroic filter skuffe er indsat under målsætningen. For GFP, det er standard (eller faste) skuffe. </li><li> I OMX SF, gå til menuen Filer, vælg Indstillinger, og vælg Fast skuffe fra skuffen rullemenuen. Luk vindue. </li><li> Gør følgende fra hovedskærmen af softwaren, i afsnittet Lette Parametre: <ol><li> Aktiver passende kamera til excitation laser og emission filter (FITC) kamera fra udvælgelsen Channel. </li><li> Kontroller Billede er indstillet til sekventiel. </li><li> Kontroller strålegang er indstillet til SI. </li><li> Kontrollér tilstand er indstillet til 95 MHz. </li><li> Kontroller 488 laseren er valgt i Excitation. </li><li> Indstil <strong&gt; Størrelse til 512 x 512 til vinduets størrelse og Binning til 1 x 1. </li></ol></li><li> På fanen Experiment, sikre er indstillet til SI fra rullemenuen. </li><li> Sikre Sektionsinddeling er aktiveret, og at den optiske sektion afstand er indstillet til 0,125. </li><li> Sikre fokus punkt, når Scan starter er midten. </li></ol></li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Påfør en dråbe olie til toppen af ​​målet. Ved 37 ° C, den anbefalede olie har et brydningsindeks på 1,518 som bedst passer til brydningsindekset for gelen puden anvendes til at montere de bakterielle celler ved 37 ° C (se trin 1.1.3). </li><li> Anbring prøven petriskål indeholdende de forberedte celler i fase indsatte og dække med den cirkulære opvarmning låg. Sænk fase indtil olien rører bunden afprøven petriskål. </li><li> Skaalen varme i ligevægt i 15 minutter på etapen. Ved hjælp af en lav indstilling Eksponering af 5 msek eller mindre (placeret i afsnittet Lette parametre), fokus på prøven ved hjælp af nano positionering fase kontrol (DZ, som ligger i Nano Positioning afsnit). Fokus op og ned gennem prøven for at afgøre, at lyset spredes jævnt over og under prøven brændplan. Hvis punktspredningsfunktion er ikke engang (sfærisk aberration), rengøre bunden af ​​prøven skålen og formålet med chloroform. Skift olie og gentage dette trin, indtil en passende match er fundet mellem olien og prøve brydningsindeks for at minimere sfærisk aberration. </li><li> Anvendelse af 0,5 um dZ trinstørrelser markere toppen og bunden af billedet stakken. Retur til midten af ​​prøven. Klik på knappen Hent tykkelse i fanen Eksperiment for at indstille tykkelsen erhvervelse prøven. Keep stakken højde til et minimum, samtidig med at være omhyggelig med ikke at klippe toppen og bunden af ​​Z-ringe. Typiske tykkelser for B. subtilis-prøver er 2-3 um. </li><li> Bestem den maksimale intensitet værdi (Max) af prøven billede med den aktuelle risiko% T-indstillingerne. Denne værdi er fundet under billedet vinduet. For time-lapse billeddannelse, justere eksponering og% T for at opnå en maksimal intensitet på 1,100-1,400 over baggrunden for billedet. Er behov for en minimal intensitet på 1.000 over baggrunden for at få billedet genopbygning. For en one-off billede, øge den maksimale intensitet til 4.000-5.000. </li><li> Aktiver Time-lapse sektion under fanen eksperiment. Indstil den ønskede frame rate og den samlede tid. I datafil, skal du indtaste et passende filnavn. Klik på knappen Kør for at starte købet billedet. Bemærk: Billede købet er afsluttet, når gReen statuslinjen er færdig og en logfil vises i datasættet i den relevante mappe data. </li></ol> 4. Kontrol Data Quality <ol><li> Ved starten af ​​købet billedet Bemærk den maksimale intensitet værdi af billedet i begyndelsen af ​​købet billedet for første billede af tidsserien. Ved afslutningen af ​​købet af den første ramme, kontrollere, at der ikke har været mere end et fald på 10% i signal intensitet gennem z-stak for denne første frame. Hvis der har været mere end dette niveau af fotoblegning i det første tidspunkt, vil data gennem tidsserien være af utilstrækkelig kvalitet til analyse og erhvervelse af tidsserier kan stoppes. </li><li> Ved afslutningen af ​​købet af tidsserien åbne det resulterende rå billedfil med .dv endelse og konstatere et fald i maksimal signal intensitet fra begyndelsen af ​​tidsserier til det sidste billede. Kassér alle tidspunkter, hvor der har bin mere end 30% fotoblegning. </li></ol> 5. Genopbygning 3D-SIM billeder <ol><li> Fra processen menuen aktivere SI Genopbygning vinduet. Brug allerede eksisterende indstillinger for alle parametre. </li><li> Aktivere brugen Kanal Specifik OHF knap, og indstillet til Standard filtersæt. Aktivere brugen Kanal Specifikke KO vinkler knap og indstil til Standard filtersæt. </li><li> Træk og slip den rå (.dv) fil i inddatafilen plads. Klik på Gør det. Output filen vil have samme navn som input fil med _SI tilføjes i slutningen. Bemærk: Denne genopbygningsproces kan køres som en opgave ved hjælp af Task Builder funktionen fra processen menuen, hvis flere filer skal forarbejdes. </li></ol> 6. Data Export og analyse <ol><li> Brug Imaris at visualisere 3D-billeder i overgå mode og export billeddata TIFF (300 dpi) eller AVI-filer (ingen komprimering). Størrelse målinger i Imaris kan udføres ved hjælp af målinger værktøj i overgå tilstand. </li><li> Generering 3D intensitet plot af Z ringen fra 3D-SIM billeddata: <ol><li> Undersøger fordelingen af ​​FtsZ rundt om Z-ringen og for at skabe 3D-intensitet plots <ol><li> Åbn en 3D-billedfil for at se de enkelte z-skiver. Brug Volume Viewer værktøj placeret under fanen Vis-menuen for at beskære et område af interesse. </li><li> Indtast vinduet nummer for denne 3D-billede i input-vinduet og indtast en ny og ubrugt vindue nummer i output-vinduet. Vælg område Knappen vil blive tilgængelige til at beskære en individuel Z ring af interesse fra de oprindelige 40 × 40 um synsfelt. </li><li> Indstil den ønskede akse og graden af ​​rotation under fanen rotation. Klik på Do It knappen. Rul gennem volumen for at opnå den ønskede perspektiv Z ringen. </li><li> Brug data inspektør værktøjet og justere than kolonne / række dimensioner til at oprette en ny region af interesse omkring en individuel Z-ring. Klik midt på billedet for at placere denne nye region af interesse. Teksten billeddata er en automatisk genereret tabel, der viser fluorescensintensiteten af ​​hver pixel inden for regionen af ​​interesse. </li><li> Klik på 3D-graf-knappen for at begynde med at se intensiteten plot. </li><li> Alternativt tekstbilledet data kan eksporteres ved at klikke på knappen Gem tabeldata i menuen File. </li><li> Kopiere billedet data fra den gemte tekstfil i et nyt regneark. Vælg alle celler i regnearket, og oprette en ny 3D-Surface graf. Formater 3D intensitet plot graf til offentliggørelse. </li></ol></li><li> For tidsforskudt gentage data trin 6.2.1.1 - 6.2.1.7 på hver af de forskellige tidspunkter fra 3D-billedfilen. </li></ol></li><li> Sporing Gennemsnitlig Fluorescens intensitet over tid <ol><li> Brug tekst billeddata at spore fluorescence intensitet over tid i et område af interesse. </li><li> Marker de celler, der svarer til området af interesse. </li><li> Beregn den gennemsnitlige fluorescensintensitet på hvert tidspunkt for denne region af interesse. </li><li> Brug gennemsnitlige fluorescensintensitet værdier til at generere en separat linje graf. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Harry, E., Monahan, L., Thompson, L., Kwang, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Cell+Division+The+Mechanism+and+Its+Precison.">Bacterial Cell Division The Mechanism and Its Precison.</a> Int Rev Cytol. 253, 27-94 (2006).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19, 780-782 (1994).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys j. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed (English). 47, 6172-6176 (2008).</li><li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+Diffraction+Barrier+in+Fluorescence+Microscopy+by+Optical+Shelving.">Breaking the Diffraction Barrier in Fluorescence Microscopy by Optical Shelving.</a> Phys Rev Lett. 98, 218103 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophys J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320, 1332-1336 (2008).</li><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+modulated+excitation+microscopy:+Improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating.">Lateral modulated excitation microscopy: Improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> Proc SPIE 3568. , 185-195 (1999).</li><li>Gould, T. J., Burke, D., Bewersdorf, J., Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+enables+3D+STED+microscopy+in+aberrating+specimens.">Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens.</a> Opt Express. 20, 20998-21009 (2012).</li><li>Urban, N. i. c. o. l. a. i. . T., Willig, K. a. t. r. i. n., Hell, S. t. e. f. a. n. . W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices.">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys J. 101, 1277-1284 (2011).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 1607-1611 (2011).</li><li>Strauss, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-SIM+Super+Resolution+Microscopy+Reveals+a+Bead-Like+Arrangement+for+FtsZ+and+the+Division+Machinery+Implications+for+Triggering+Cytokinesis.">3D-SIM Super Resolution Microscopy Reveals a Bead-Like Arrangement for FtsZ and the Division Machinery Implications for Triggering Cytokinesis.</a> PLoS biol. 10, e1001389 (2012).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Rev Microbiol. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E+coli+cell+fission.">Advances in understanding E coli cell fission.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 730-737 (2010).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+physics+of+FtsZ+assembly+and+force+generation.">Modeling the physics of FtsZ assembly and force generation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 9238-9243 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+in+Bacterial+Cytokinesis+Cytoskeleton+and+Force+Generator+All+in+One.">FtsZ in Bacterial Cytokinesis Cytoskeleton and Force Generator All in One.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74, 504-528 (2010).</li><li>Lan, G., Wolgemuth, C. W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-ring+force+and+cell+shape+during+division+in+rod-like+bacteria.">Z-ring force and cell shape during division in rod-like bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16110-16115 (2007).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Contractile+FtsZ+Rings+in+Liposomes.">Reconstitution of Contractile FtsZ Rings in Liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 11000-11004 (2013).</li><li>Murphy, G. E., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography.">Electron cryotomography.</a> BioTechniques. 43, 413-415 (2007).</li><li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+plasmid-based+system+that+allows+rapid+generation+of+tightly+controlled+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus.">A simple plasmid-based system that allows rapid generation of tightly controlled gene expression in Staphylococcus aureus.</a> Microbiology. 157, 666-676 (2011).</li><li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolution+Dissection+of+Coordinated+Events+during+Malaria+Parasite+Invasion+of+the+Human+Erythrocyte.">Super-Resolution Dissection of Coordinated Events during Malaria Parasite Invasion of the Human Erythrocyte.</a> Cell Hos., &amp; Microbe. 9, 9-20 (2011).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26, 4694-4708 (2007).</li></ol>

This publication is sponsored by GE Healthcare.

Fluorescerende live-cell imaging er et kraftfuldt værktøj, der giver mulighed for observation af dynamiske ændringer i cellerne over tid. Live-billeddannelse af bakteriel cellebiologi har været udfordrende på grund af den lille celle størrelse og nedsat evne til bakterieceller til at modstå gentagen eksponering for excitationslys. F3D-SIM har udvidet de tilgængelige værktøjer til at afhøre alle cellebiologi, men det er nødvendigt omhyggeligt at udføre denne teknik som kan indføres artefakter hvis dårligt gennemført. Der er en række vigtige overvejelser for vellykket brug af denne teknik. Da det er et bredt felt fluorescensimagografi metode, der bygger på anvendelsen af ​​punktspredningsfunktionen af ​​det udsendte lys, brydningsindeks mismatch og sfærisk aberration af det udsendte lys skal undgås for at muliggøre nøjagtig rekonstruktion. Anvendelsen af ​​dækglas 0,17 mm tykkelse af høj kvalitet for at undgå variation af signalintensitet grund glastykkelse variabilitet i dækslernelæbe er stærkt anbefales. Det er kritisk vigtigt nøje at vurdere sfærisk aberration af det udsendte lys under de indledende faser af alle forsøg og juster immersionsolien brydningsindeks efter behov. Dette kan variere fra dag til dag, som det er afhængig af både temperatur og monteringsmedium / substrat af prøven. Anvendelsen af ​​forkert olie vil resultere i ringere rekonstruktion af billeder med artefakter såsom haloer og ekkosignaler. Ved afslutningen af ​​billedet genopbygningsprocessen, for hver fase et mål for kvaliteten af ​​rekonstruktionen kan opnås ved den &quot;bedst tilpassede Ko vinkel&quot; for hver fase / vinkel på belysning. Hvis denne værdi er mindre end 1 for hver vinkel, så kvaliteten af ​​det rekonstruerede vil sandsynligvis være høje. Hvis denne værdi er over 6, er det mest sandsynligt, at det rekonstruerede billede vil indeholde artefakter. Almindelige artefakter i) forekomsten af ​​striber i billedet, der svarertil en af ​​vinklerne af risten. Dette kan skyldes lavere signal fra nettet vinkel; ii) haloing omkring strukturer. Dette kan skyldes meget forskellige niveauer af signalet fra lyse strukturer i forhold til omgivende strukturer, en uoverensstemmelse af brydningsindeks af olien og prøven eller kan skyldes de strukturer i billedet bliver for amorfe og ikke indeholder nok &quot;struktur&quot; til at være anerkendt af algoritmen; iii) »stenreder&quot;, som skyldes et lavt signal-støj-forhold i billedet, normalt på grund af høj baggrund signal; iv) strukturer, der er strakt / aflange i xy, som kan skyldes brydningsindeks misforhold mellem olie og prøve. Denne artefakt er svært at få øje på en uerfaren bruger. Det anbefales, at nye brugere konsultere en erfaren SIM forsker for rådgivning om tolkning og analyse, når du begynder at bruge denne teknik. Som med alle fluorescerende live-cell imaging eksperimenter, er det important til nøje afveje excitationsenergien input med henblik på at minimere graden af ​​fotoblegning og fototoksicitet af cellerne med tilstrækkelig emissionssignal nødvendig for at rekonstruere billeder med minimal artefakt. Overdreven fotoblegning (større end 30% over en enk-stak erhvervelse) vil føre til en striping mønster i det rekonstruerede billede. Med brugen af ​​sCMOS kameraer, kan billederne super opløsning held rekonstrueret fra rå billeder med emission signal så lavt som 1.000 tællinger over baggrunden. Dette kan give mulighed for meget korte eksponeringstider derved reducere fotoblegning og muliggør hurtig opsamling for hver ramme. Det øger også mængden af ​​tid mellem rammer for celler til at inddrive fra excitationsenergien input. Derudover, som indfangning tid for hver enkelt ramme kan være meget kort, er graden af ​​artefakt indført ved &#39;motion blur&#39; i en individuel opsamling reduceret med anvendelsen af ​​denne metode. Det varining for 3D-SIM tilbyder en række andre fordele i forhold til andre tilgængelige supermarkeder og høj opløsning imaging teknologier for levende billeddannelse ved bakterielle cellebiologer. De 2 gange stigning i opløsning i alle tre dimensioner, og evnen til at billedet op til 30 um i en prøve muliggør billeddannelse af hele bakterielle (og mammale celler) under et forsøg. Teknikker, såsom enkelt-molekyle lokalisering, der er almindeligt udføres i kortvarige bølge kan ikke nå dybden af ​​indtrængen i en prøve og ikke tilbyder information om hele celler. Nylige fremskridt, der tillader højere dybder prøvetagning for denne teknik kan resultere i en bedre aksial opløsning på hele celler. Derudover enkelt-molekyle localization teknikker, der kræver tusindvis af rå billeder, der skal erhvervede også begrænset i den frame rate, der kan opfanges og kan kræve kompromis mellem capture frame rate og den ultimative opnåede rumlige opløsning, da den rumlige opløsning er afhængig af Antallet af eveNTS er optaget inden for et afgrænset rum. Reduktion af antallet af optagne billeder vil resultere i en lavere rumlig opløsning, men kan være tilstrækkelig til at opnå den tidsmæssige opløsning kræves til biologisk proces af interesse. Mængden af ​​inddrivelse tid mellem rammer kan også være nødvendigt at øge for at minimere fototoksicitet i levende celler, hvilket begrænser varighed og frekvens, hvor tidsserier kan opnås. Høje teknikker opløsning såsom elektronmikroskopi (EM) eller elektron cryotomography (ECT) har forøget opløsning i 3D-SIM (og andre super-opløsning optisk mikroskopi teknikker), men skal udføres på faste prøver. Fastsættelse og behandling kan indføre artefakter og manglende mærkning kan gøre tolkningen vanskelig. Label-fri ECT har dårlig kontrast og kan opnå prøve indtrængningsdybder på omkring 500-200 nm 24, så selv hvis der kan identificeres proteinet af interesse, ikke kan observeres strukturen af proteinet i en hel bakteriel celle.Selv når der kan anvendes i EM, såsom med immunguld mærkning, billedsensoren udføres kun i 2D. 3D er kun opnås med tynde sektionering og beregningsmæssige rekonstruktion af sektionerne. Den tynde sektionering kræver en erfaren tekniker, men kan være problematisk og føre til artefakt. Med levende eller fikserede celler, er 3D-SIM ikke behøver at blive indlejret i en bestemt måde og celler kan hurtigt forberedt til billeddannelse i en nær oprindelige tilstand. Denne metode er relativt let at gennemføre af forskere med minimal erfaring i fluorescerende mikroskopi. Eksperimenter kan udføres i medier, der understøtter en sund celle funktion, så længe det ikke fluorescerer eller generere unødig baggrundssignal. For bakterielle celler, kan dette gøre det muligt at anvende mange typer af komplekse og minimale medier eller anvendelse af faste eller halvfaste medier for at kontrollere bakteriel cellemotilitet. Mange biologer, der allerede har manipuleret fluorescerende protein (RP) fusioner og afprøvet funktionaliteten afdisse fusioner kan tage op denne teknologi hurtigt uden yderligere teknik og validering med nye fotoaktiverbare FP fusionerne. Vi fandt, som en generel bemærkning, at S. aureus var mere modtagelige for fotoblegning under billedbehandling med FP fusioner end B. subtilis. Ved hjælp af vores oprindelige 3D-SIM metoder, hvor gitter mønster blev genereret af en fysisk rist, var vi ikke i stand til at optræde live cell imaging med en række S. aureus FP fusionerne. Men med denne avancerede F3D-SIM-metoden, var vi i stand til at afbilde disse FP fusioner og udføre serier kort tid til at fange dynamikken i disse mærkede proteiner. Dette er sandsynligvis på grund af de reducerede eksponeringstider nødvendige for billedbehandling og øget tid mellem rammer for celle opsving. OMX Blaze 3D-SIM er en kommercielt tilgængelig teknologi, der kan relativt let implementeres i et enkelt laboratorium eller en kerne imaging facilitet. Der skal udvises omhu for at udføre teknikken at undgå artifakta på grund af dårlig forberedelse prøve eller dårlig billedoptagelse. Når teknikken er styr på den, kan studier af proteiners struktur og dynamik i små organismer såsom bakterier udføres i en enkelt eller multi-farvet fluorescens.

Et antal forskellige billeddannende teknologier er blevet anvendt i årenes løb for at studere bakterier, herunder forskellige elektron og optisk mikroskopi teknikker. Mens elektronmikroskopi giver ekstremt høj opløsning, ned til nanometer, er behovet for et vakuum og anvendelse af kontrastmidler begrænset denne teknik til faste og indlejrede enheder. Artefakter kan også indføres som følge af langvarig prøveforberedelse og en fagmand er nødvendig for at forberede prøverne, og at analysere og fortolke de fremkomne billeder. Optisk mikroskopi tilbyder fordelene ved enklere prøveforberedelse, og anvendelsen af ​​flere etiketter med relativ lethed sammenlignet med elektronmikroskopi. Anvendelse af fluorescerende proteiner og farvning af konjugater, evnen til at studere levende celler med fluorescensmikroskopi er også mulig. Med forbedringer i fluorophor stabilitet og fluorescerende protein størrelse / struktur fører til nedsat celle toksicitet, samt forskud på kamera afsløring Technologi, fluorescensmikroskopi hjælp bredt felt og konfokal billeddannende systemer er blevet væsentligt udvidet vores forståelse af de rumlige dynamik af celler. Ved hjælp af disse teknikker, har vores viden om den bakterielle celle i løbet af de sidste 20 år udviklet sig kraftigt til en langt mere detaljeret billede, der viser en høj grad af strukturel og protein organisation inden bakteriecellen 1. De traditionelle metoder til optisk mikroskopi er diffraktion begrænset, hvilket betyder, at den iboende opløsning er omkring halvdelen af ​​bølgelængden af ​​excitationslyset anvendes. Selv med det mest optimale konventionelle optisk mikroskopi system bedst lateral opløsning er omkring 220-250 nm, og den aksiale opløsning er omkring 500 nm (for en gennemgang se Schermelleh et al. 2). For bakterielle cellebiologer i særdeleshed stadig dette alvorligt begrænser vores forståelse af den rumlige organisering af disse små celler; bliver kun 1-2 um i diameter og 1-10 um i længden. Der er også behov for højere teknikker opløsning, der kan udføres på levende celler, hvor dynamiske rumlige adfærd af et protein kan analyseres for at supplere in vitro-data. Gennem det seneste årti har flere super-opløsning fluorescens imaging teknikker blevet udviklet. Super-opløsning mikroskopi beskriver billeddannende teknikker, som mindst dobbelt lateral opløsning opnås med konventionel lysmikroskopi derved overvinder diffraktion barriere. Disse teknikker manipulere belysning og / eller analyse af det udsendte lys for at skabe reel stigning i den tilsyneladende opløsning. Der er i øjeblikket tre hovedtyper af super opløsning teknikker - i) stimuleret emission udtynding mikroskopi 3 (STED); ii) enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi, herunder teknikker såsom fotoaktivering lokalisering mikroskopi 4,5 (PALM), stokastisk optisk genopbygning mikroskopi <sop&gt; 6 (STORM), direkte STORM 7 (dSTORM), og grundtilstand udtynding med individuel molekyle retur 8 (GDSIM); og iii) strukturerede belysning mikroskopi 9-12 (SIM). Single-molekyle localization teknikker giver de største stigninger i lateral opløsning, ned til mellem 10-40 nm i biologiske prøver. I mange implementeringer af enkelt molekyle lokalisering mikroskopi, er dybde af prøvetagning begrænset til kortvarige bølge og de første implementeringer af STED blev også begrænset i dybden prøveudtagning. De seneste fremskridt såsom brugen af ​​adaptive optik, udnyttelse af bygningsfejl i punktspredningsfunktionen på forskellige fokuspunkter, flerlagsenheden detektion og bruge to mål for at udlede den aksiale position af det udsendte lys har set forbedringer i både den aksiale opløsning og prøvetagning dybder i både STED og enkelt molekyle lokalisering 13,14. Dataopsamling satser for STED og enkelt-molekyle localization teknikkerer også relativt langsomt på grund af det store antal billeder, der skal erhverves for maksimal opløsning (op til 50.000 til lokalisering teknikker). Dette opkøb langsom data egner sig ikke til billeddannelse af levende prøver uden brugerdefinerede modifikationer, som ofte er ret dyrt. Disse to teknikker er i øjeblikket optimalt egnet til faste prøver (vedrørende oversigt se 2,15), men meget arbejde der bliver gjort for at løse denne begrænsning. Tredimensionel struktureret belysning mikroskopi (3D-SIM) er en bred felt teknik, der forbedrer både lateral og aksial opløsning resulterer i beslutninger af cirka 110 og 280 nm. Dybde af prøveudtagning er op til 30 um fra dækglasset, der giver mulighed for billeddannelse af hele celler. Variationen i 3D-SIM udviklet af Sedat, Agard, og Gustaffsson på optiske mikroskop Eksperimentelle (OMX) platform indebærer belysning af prøven med en kendt gittermønster der flyttes ind i 15 forskelligepositioner i hver z planet 9-11. Frynser i den resulterende moiré-mønstre, der er oprettet i frekvens plads uden den observerbare region måles. Oplysningerne fra frekvensen rum er beregningsmæssigt rekonstrueret at generere en synlig super opløsning billede 10,11. Den relative hastighed, hvormed de rå billeder kan erhverves ved hjælp af denne teknik muliggør billeddannelse af levende celler. Det er dog vigtigt at bemærke, at for biologiske processer, der forekommer på en tidsskala sekunder, er stadig er for langsom til at fange dynamiske ændringer købet på de rå billeder. For tidsserier med en opsamling på sekunder, kan den gentagne køb uden tilstrækkelig restitutionstid føre til fototoksicitet og fotoblegning, især under live billeddannelse af små bakterieceller. For at overvinde disse problemer, har de seneste fremskridt for hurtig 3D-SIM (F3D-SIM) blevet udviklet. Her beskriver vi en kendt som OMX Blaze 16, der var jegntroduced i slutningen af ​​2011. Denne teknologi skaber den mønstrede belysning uden brug af et fysisk net, som blev anvendt i tidligere systemer. Brugen af ​​forstyrrende lysstråler og ny lukker teknologi giver mulighed for oprettelsen af ​​den mønstrede lys på prøven i en meget hurtig måde. Hastigheden af ​​billedet købet blev yderligere styrket med indførelsen af ​​videnskabelige komplementær metaloxid halvleder (sCMOS) kameraer, især sammenlignet med de eksisterende EMCCD kameraer. Disse ændringer resulterede i en mulig billede erhvervelse på én ramme pr sekund for en prøveudtagning dybde på 1 um (512 x 512 pixel, 9 z-skiver), så overvågning af dynamiske ændringer i celler, der opstår inden for få sekunder 16. Faldet i de tilsyneladende eksponering (excitation) gange til levende celler ved hjælp af denne metode muliggør enten serie længere tid til at blive fanget eller en stigning i capture sats. Her beskriver vi anvendelsen af ​​F3D-SIM mikroskopi at undee struktur og dynamisk bevægelse af cytokinetic Z ringen i cellerne af to bakteriearter: de stavformede model organisme Bacillus subtilis og coccoide humant patogen Staphylococcus aureus. FtsZ er en tubulin-lignende cytoskeletprotein, der spiller en central rolle i celledeling i bakterier 17,18. Det lokaliserer til divisionens hjemmeside for at rekruttere mindst 20 andre division proteiner, der danner division apparatet 17,18, og menes at give den kraft for celle indsnævring 19-23. Denne metode afslører, at FtsZ heterogent fordelt rundt om Z-ringen i begge organismer i en perle-lignende arrangement; løse mangeårig spørgsmålet om, hvorvidt Z ringen er en kontinuerlig ensartet bælte omkring cellen, som visualiseret ved konventionel bredt synsfelt fluorescensmikroskopi eller en diskontinuerlig struktur som foreslået af elektron kryo-tomografi (ECT) 24. Vi viser, hvordan evne 3D-SIM kan langt bedre rumlig undersøgelse af lille (1um diameter) runde celler som S. aureus at opdele i tre på hinanden følgende vinkelrette planer (x, y, z). Time-lapse studier ved hjælp af disse teknikker viser, at strukturen af Z ringen er dynamisk, med brutto organisation ændringer inden for ringen, snarere end FtsZ molekyler bevæger sig ind og ud af et fast stillads 24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Agarose I (Biotecnology grade)</td>
			<td style="width:161px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:119px;">0710-500G</td>
			<td style="width:167px;">Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64)</td>
			<td style="width:161px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T-13320</td>
			<td style="width:167px;">Lipophylic dye used for staining cell membranes.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">1.5 ml microtube, graduated Natural</td>
			<td>Scientific specialties Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1210-00</td>
			<td style="width:167px;">Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Luria broth base, Miller&#160;</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">241420</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions. Add 2%?? after autoclaving&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">210932</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Adhesive frame</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ABGAB-0577</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microscope cover glass</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">111512-9</td>
			<td style="width:167px;">22x22 No 1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom</td>
			<td style="width:161px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:119px;">FD35-100</td>
			<td style="width:167px;">Known as FluoroDish with this company. Dish: &#216;35mm, Glass: &#216; 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0378-25G</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lincomycin hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L6004-5MU</td>
			<td style="width:167px;">Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Erythromycin&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Boehringer Mannheim GmbH</td>
			<td style="width:119px;">12390120-14</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Combined Orbital/Linear Shaking waterbath&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Grant scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">OLS-200</td>
			<td style="width:167px;">Shaking speed used for cultures: 215 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">UV visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:119px;">UV-1601</td>
			<td style="width:167px;">600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415R</td>
			<td style="width:167px;">Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15502-10G</td>
			<td style="width:167px;">Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">softWoRx software</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;">version 5.0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Imaris data analysis software</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane Scientific Software, Bitplane AG</td>
			<td style="width:119px;">version 7.0.0</td>
			<td style="width:167px;">Matlab XTensions included</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module.</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Blaze module fitted on OMX V3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss Axioplan 2&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of the cytokinetic z ring in live bacteria using fast 3d-structured illumination microscopy (f3d-sim)

Imaging biologiske prøver ved hjælp af fluorescens mikroskopi er skredet betydeligt frem med nye teknologier til at overvinde den opløsning barriere i diffraktion af lys, så super-opløsning af levende prøver. Der er i øjeblikket tre hovedtyper af super opløsning teknikker - stimuleret emission depletion (STED), single-molekyle lokalisering mikroskopi (herunder teknikker såsom palmeolie, STORM, og GDSIM), og struktureret belysning mikroskopi (SIM). Mens STED og enkelt-molekyle localization teknikker viser de største stigninger i opløsning, har de været langsommere til at tilbyde højere hastigheder på billedet erhvervelse. Tre-dimensionel SIM (3D-SIM) er en bred felt mikroskopi teknik, der giver en række fordele i forhold til både single-molekyle lokalisering og STED. Opløsning er forbedret, med typiske laterale og aksiale beslutninger af 110 og 280 nm og dybde af prøvetagning på op til 30 um fra dækglasset, der giver mulighed forbilleddannelse af hele celler. Nylige fremskridt (hurtige 3D-SIM) i teknologien øger fange hastigheden af ​​rå billeder giver mulighed for hurtig opsamling af biologiske processer, der forekommer i sekunder, mens foto-toksicitet og fotoblegning betydelig reduktion. Her beskriver vi anvendelsen af ​​en sådan metode til billedet bakterielle celler, der huser den fluorescens-mærkede cytokinetic FtsZ protein til at vise, hvordan celler analyseres og typen af ​​unikke oplysninger, at denne teknik kan give.

I denne undersøgelse visualiserede vi den bakterielle celledeling protein FtsZ udtrykt i levende celler som en FtsZ-GFP-fusion, til at illustrere de stærke fordele F3D-SIM i forhold til konventionel fluorescensmikroskopi for at studere bakterielt protein lokalisering og dynamik. FtsZ er en tubulin-lignende cytoskeletprotein der polymeriserer til en dynamisk ringstruktur omkring periferien af ​​cellen. Z ring har en vigtig funktion i celledeling: sin samling markerer det fremtidige sted for deling, det rekrutterer alle celledeling proteiner til denne hjemmeside, og Z ring konstriktion synes at give kraft til at tillade indadgående bevægelse af cellen konvolut under cytokinese 17 18. Når visualiseret ved konventionel bredt synsfelt fluorescensmikroskopi vises Z-ringen som en enkelt tværgående bånd af fluorescens i stavformede bakterier, herunder de bedst undersøgte organismer såsom B. subtilis (figur 2A), &lt;em&gt; E. coli og C. crescentus. Vigtigere er det, vises fluorescensintensiteten hele dette band til at være mere eller mindre ensartet og lokalisering mønster tilbyder meget lidt indsigt i den strukturelle organisering og distribution af FtsZ polymerer inden for Z-ringen. Når de samme celler undersøges ved anvendelse af den her beskrevne F3D-SIM-metoden (figur 2B), men fordelene ved denne teknik er umiddelbart synlige. Første rotation af 3D-SIM billedet omkring z-aksen muliggør visualisering af Z-ringen som en reel ringstruktur i tredimensionelt rum (figur 2C og 3A). Sammen med stigningen i opløsning, det viser, at fordelingen af FtsZ i Z-ringen er i virkeligheden meget uensartede (figur 3). Forbedringen i opløsning gør det også muligt for os at se Z ringe, der har påbegyndt processen med konstriktion at danne en division skillevæg (angivet med invagination af cellemembranen i &lt;strong&gt; figur 2C og 2D). Yderligere eksempler på B. subtilis Z ringe visualiseret ved denne teknik er vist i figur 3BI - 3Biv og illustrerer, hvordan fluorescensintensiteten omkring Z-ringen er aldrig den samme. Desuden er områder med meget lav fluorescens intensitet observeres ofte. Vi henviser til disse regioner som mellemrum (hvide pilespidser). Vi observerer disse huller i 15% af alle Z undersøgte ringe (n = 84) og overvejende Z ringe med en diameter på 800-900 nm (93%). For at kvantificere disse observationer blev 3D intensitet parceller skabt af Z ringen og er vist i figur 3CI og 3Cii hjælp Z ringene vist i figur 3Biii og 3Biv. Intensiteten plots viser, at typisk mængden af fluorescens i Z-ringen kan variere op til 3 - 4 gange i forskellige regioner af B. subtilis Z ringen. Desuden 3D intensitet plots viser, at gaps af fluorescens inde Z ringen næsten læse baseline niveauer af baggrundsfluorescens (sort pil i figur 3CI). Disse ovenstående eksempler skildrer gode rekonstruktioner af Z-ringen og er afhængige af tilstrækkeligt lys, der udsendes fra prøven uden væsentlige fotoblegning. Dette opnås gennem lysstyrken af ​​GFP fluorofor fusioneret til FtsZ og overflod i cellen under disse betingelser (høj signal-støj-forhold). I andre celler, hvor signal-støj-forholdet er lavt genopbygningen af ​​billedet er dårlig. For at simulere denne forekomst med FtsZ-GFP, mængden af emissionen Signalet fra B. subtilis-celler blev reduceret ved at sænke excitationsenergi. Som vist i figur 3D en 100 ganges reduktion af ekscitationsenergi resulterer i et billede af Z-ring, der har betydelige artefakter. Dette sker som følge af utilstrækkelig lokal kontrast mellem FtsZ-GFP signalet og baggrunden fører til poor rekonstruktion af billedet. Interessant B. subtilis Z ringe viste mere udtalte mangler og heterogenitet i de øverste og nederste områder af ringen, men ikke i siderne af ringen (figur 3B). Dette sker på grund af forskellen i opløsning opnås ved denne variation af 3D-SIM i den laterale plan i forhold til den aksiale plan. Dette resulterer i de øverste og nederste områder af Z-ringen (sideflade) er afbildet med optimal opløsning. Hullerne i Z-ringen er for små til at blive opdaget i siderne af Z ringen som visualiseret i den aksiale plan, som har omkring halvdelen af ​​opløsning af fartøjets sideflade. Bakterier, der har en coccoid morfologi, såsom S. aureus, har Z ringe, som er placeret i alle planer. Så billeddannelse Z ringe, når den ligger i den laterale plan (eller tæt på det), giver mulighed for at billedet alle regioner i ringen med optimal opløsning. Drage fordel af dette, undersøgte vi strukturZ ringen i levende S. aureus-celler ved anvendelse af en stamme, der indeholder et plasmid bærende en ftsZ-GFP-fusion. Produktionen af denne sammensmeltning er under kontrol af en P spac inducerbar promotor (se trin 1.2.1). Når afbildet med i det aksiale plan, S. aureus Z ringe optrådte identisk med B. subtilis Z ringe, som er til stede i det samme plan (figur 4AI). , Billedbehandling Z ringe i sideflade bekræftede imidlertid, at hele Z ringen optrådte både perle-lignende og heterogene. Omkring 26% af disse ringe viste også mindst en synlig &quot;hul&quot; af fluorescens (figur 4Aii, 4B). Svarende til B. subtilis FtsZ fluorescens intensitet plots viser, at intensiteten af fluorescens i Z-ringen varierer så meget som 4 - 6 gange i forskellige områder af S. aureus Z ringen (figur 4C). Kan måles længde og bredde af perlerne (se skematisk i figur 4D). Dette viste, at 80% af Z ringe (n = 43), som blev undersøgt havde en perle længde på 200 nm, og nåede en maksimal længde på 400 nm. Bredden af ​​perler, på den anden side, målt op til 200 nm. Der var gennemsnitligt 12 ± 2 (SEM) FtsZ perler pr Z ringen. Lignende lokalisering af data blev observeret, når indfødte FtsZ blev visualiseret med disse metoder ved hjælp immunfluorescensmikroskopi (IFM), der viser, at denne heterogene og perle-lignende lokalisering mønster var ægte og ikke et artefakt forårsaget af ekspression af ftsZ-GFP i tillæg til indfødte FtsZ (data ikke vist). Denne udvikling af 3D-SIM er i stand til at vise, at Z-ringen fremstår som en heterogen struktur og er muligvis diskontinuert i naturen. For at løse spørgsmålet om, hvordan denne heterogene Z-ring struktur undergår konstriktion og letter celledeling, kan en time-lapse-analyse af Z ring dynamik udføres. En af de vigtigste udfordringer medfluorescens mikroskopi time-lapse studier er i minimering af prøven fotoblegning og fototoksicitet under billedbehandling. 3D-SIM kræver et stort antal af rå billeder, der skal opnås, hvilket betyder, at fotoblegning af en prøve over tid vil resultere i et dårligt signal-støj-forhold, der fører til et tilstrækkeligt signal til at tillade passende billede rekonstruktioner. Anvendelsen af ​​den nye teknologi minimerer mængden af ​​ekscitationsenergi anvendes for hver eksponering og dermed et fald i energi indtaste de levende celler. Det gør den ved en kombination af lysstråle interferometri at skabe den strukturerede mønster på prøven og brug af videnskabelige CMOS-kameraer, der øger følsomheden og kvante effektivitet. Denne kombination resulterer i z-stak erhvervelse af 1 um pr sekund (512 × 512 pixels x 8 Z-skiver) i forhold til 1 um pr 5-8 sekunder (512 x 512 pixels x 8 Z-skiver) opnået med vores tidligere iteration af 3D-SIM-kort (beskrevet i Riglar et al. 26).Reducering af billedet erhvervelse tid og eksponering indstillinger kan også hjælpe med at minimere fototoksicitet af levende celler, som er særlig relevant i time-lapse studier. Den nye teknologi, der præsenteres her løser også et andet problem i live-cell imaging, som vi refererer til som &quot;motion blur&quot;, som i denne sammenhæng refererer til lokalisering af proteiner skiftende under billedet erhvervelse. Ved at sænke billedet erhvervelse tid mængden af ​​&#39;motion blur&#39; minimeres dermed skabe et mere præcist billede genopbygning. Tidligere undersøgelser, der har rettet hvordan FtsZ er organiseret inden for Z-ringen har ikke været i stand til at vise, hvordan Z ringstruktur ændrer sig over tid. For at undersøge dette aspekt udførte vi time-lapse hjælp F3D-SIM. Dette aktiveret erhvervelse af en 3D-SIM billede af Z ringen i B. subtilis hver 5-10 sek over en periode på 50 sekunder, hvilket tidligere ikke var muligt på denne tidsskala. Vist i figur 5A er en example af de hurtige skift i FtsZ spredning i Z-ring over tid (diameter på 890 nm). Andre Z ringe, der var synligt i færd med konstriktion blev også vist sig at have lignende dynamik, der ramte distributionen af ​​FtsZ rundt om Z-ring (ikke vist). 3D intensitet plot kan også genereres for hvert af de tidspunkter at kvantificere og værdsætte de stadige fluorescensintensitets ændringer og dermed relativ overflod af FtsZ i forskellige regioner af Z ringen på en tidsskala sekunder (figur 5B). Regioner af interesse kan identificeres ud fra disse intensitet grunde til at spore udsving i fluorescens intensitet (figur 5C). Sporing af disse ændringer i Z ringstruktur under disse forhold ville være næsten umuligt uden den avancerede F3D-SIM-teknologi. Desuden dette arbejde viste, at i S. aureus den dynamiske bevægelse FtsZ ligner den, der observeres i B. subtilis. S. aureus RN4220 celler producing FtsZ-GFP blev afbildet til 50 sek ved 10 sek tidsintervaller. Ændringer heterogenitet Z ringen i S. aureus med F3D-SIM var også lignende til B. subtilis (se pile og pile i figur 6). Disse tidsudløbsdata undersøgelser støtter en model af Z ring konstriktion (den iterative klemme model), der blev forudsagt ved undersøgelse af faste C. crescentus celler, men kunne ikke påvises på grund af behovet for at undersøge Z-ring dynamik i levende celler 27. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. Skematisk af den optiske konfiguration af F3D-SIM anvendes i denne undersøgelse. Laserlys fra laseren tabel ledes gennem et SIM-fiber til en kollimatorlinse og fastgjort rist, derefter ind i fase styremodul, der skaber både specifik bølgelængde optimale afstand of de ± 1. ordens stråler fra nul ordre centrale bjælke og fase skridt til SIM-samling. Bjælkerne derefter indtaste vinkel kontrol modul, hvor strålerne reflekteres til de 3 forskellige klynger for at skabe de 3 indfalds-. Bjælkerne derefter indtaste mikroskop og lys sti som vist (Modificeret med tilladelse fra Paul Goodwin, API). <img alt="Figur 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig2highres.jpg" width="400" /> Figur 2. Sammenligning af konventionelle bredt synsfelt fluorescens og 3D-SIM-billeddannelse af B. subtilis-celler, der udtrykker ftsZ-GFP. (A) Konventionel bredt felt fluorescensimagografi B. subtilis-celler, der udtrykker ftsZ-GFP (SU570, grøn) som en enkelt kopi blev også farves med membranen farvestoffet FM4-64 (rød). Scale bar = 5 um. Billedet blev opnået ved hjælp af et opretstående fluorescensmikroskop.(B) 3D-SIM-billeddannelse af den samme B. subtilis stamme udtrykker ftsZ-GFP, farves med FM4-64. Regioner af interesse fra billedet kan vælges (stiplet boks) for at zoome ind. Billedet kan også roteres omkring z-aksen for at se 3D FtsZ ringe i den aksiale plan. (C, D) Fjernelsen af ud-of- fokusering og forbedret billedopløsning fra 3D-SIM tillader klar visualisering af Z ringe (herunder dem, der er stramme) og den indre cellemembran under divisionen (angivet med hvide pile). Bemærk, at den protokol tekst beskriver visualisering af et enkelt fluorophor. Imidlertid kan fremgangsmåden tilpasses til at erhverve op til fire forskellige bølgelængder samtidigt. Dette tal er blevet genoptrykt fra Strauss et al 16. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3. Repræsentative billeder af Z-ringen i levende stavformede bakterieceller (B. subtilis), der udtrykker FtsZ-GFP bruger 3D-SIM. (Ai) Z ringen observeret som et bånd af fluorescens vinkelret på den lange akse af den celle, som er i xy-planet. (Aii) Billedet er blevet drejet omkring z-aksen ved hjælp af Imaris 3D visualiseringssoftwaren (se protokol trin 6.1), således at man er på udkig gennem ringen struktur til tydeligt se, hvordan FtsZ distribueres i Z-ringen. Dette billede, nu i ZX plan viser, at ringen har en heterogen fordeling af FtsZ med regioner med ringe eller slet ingen fluorescens (hvide pilespidser). Billedet skal drejes for at overholde disse sabbatår regioner fluorescens. Bi-Biv viser yderligere eksempler på roterede Z ringe, der nu ligger i ZX-planet. Z ringe i (Bi-iii) have en diameter på ~ 0,9 um. (BIV) viser en Z ring med en diameter på onlå 0,65 um gennemgår indsnævring. (Ci) Denne typiske 3D intensitet profil viser fluorescensintensitet (dvs. koncentration) forskelle i FtsZ-GFP omkring Z-ring, der har en diameter på 0,85 um (se protokol trin 6.1-6.3). Graden af fluorescens i disse huller er lav og nærmer baggrundsfluorescens niveauer (sort pil). (CII) En lignende 3D ​​intensitet profil Z ringen i processen af konstriktion. FtsZ-GFP koncentrationen er også uensartet; diameter, 0,65 um. Paneler A har B, CI og CII, blevet genoptrykt fra Strauss et al 16. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4. repræsentant 3D-SIM billeder af S. aureus celler, der producerer FtsZ-GFP. Da disse celler er runde (cocci), vil Z-ringen have forskellige orienteringer. Celler, der viser et band af fluorescens i normal visning orientering (dvs. i XY-planet) som vist i (AI), ser meget ligner dem i stavformede celler, når roteres omkring Z-aksen som for figur 1ai. I (Aii) Z ringen allerede i XY-planet; sideværts orientering og opløsning er maksimal over hele ring, som nu giver en perle-lignende struktur (B). (C) En 3D intensitet plot af den relative overflod af FtsZ-GFP i Z ringen. (D) Skematisk repræsentation af S . aureus Z ringen. Røde pile angiver perle længde og bredde (se protokol trin 6.1). Dette tal er blevet ændret fra Strauss et al 16. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig5highres.jpg" width="500" /> &lt;strong&gt; Figur 5. F3D-SIM muliggør hurtig analyse af FtsZ lokalisering over tid i 3D-SIM. (A) ændringer i FtsZ-GFP fordeling inden for Z-ring i stavformede B. subtilis-celler kan visualiseres for at angive dynamikken i ringen. (Sek) er angivet på det øverste venstre hjørne af hvert billede. (B) 3D fluorescensintensitets plots viser uensartet og dynamisk fordeling af FtsZ i Z ringen. (C) FtsZ dynamik (FtsZ-GFP-fluorescens ændringer i ring) kan også undersøges nærmere ved at kvantificere fluorescens intensitet over tid i to regioner af interesse. Dette tal er blevet genoptrykt fra Strauss et al 16. <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig6highres.jpg" width="500" /> Figur 6. F3D-SIM time-lapse billeder viser ændringer i FtsZ lokalisering inden ringens over tid i S. enureus. Et hvidt pilespids indikerer et hul, når det initialt detekteret i Z ringen. Den opståen og forsvinden af ​​huller i samme position (som markeret med den hvide pilespids) over tid viser, hvordan FtsZ omfordeles omkring Z-ringen. Hvide pile indikerer dannelsen af ​​huller i Z ringen på senere tidspunkter. (Sek) vises i øverste venstre side af billederne. Dette tal er blevet ændret fra Strauss et al 16.

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-opløsning Imaging af Cytokinetic Z Ring i levende bakterier Brug af Fast 3D-strukturerede Illumination Mikroskopi (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Visualisering Bakterier i Nematoder anvendelse af fluorescensmikroskopi

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-opløsning Imaging af Bakteriel Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Levende Imaging af Apoptotisk Cell Clearance under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Prøverne, til Optimering STORM Super-opløsning Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Prøve forberedelse til single virion Atomic Force mikroskopi og superopløsning fluorescens Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tre-dimensionel Super Resolution Mikroskopi af F-actinfilamenter af Interferometrisk fotoaktiverede Lokalisering Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open source Single-partikel Analyse for Super-resolution Microscopy med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundtilstand udtynding super-resolution Imaging i pattedyrceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Anvendelsen af højhastigheds super-resolution hastighed mikroskopi i Live primære Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Specifik mærkning af mitokondrielle nukleoider til tidsforfald struktureret belysning mikroskopi

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...