Name: transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice
Uploaded: 2014-05-05T16:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice at JoVE.com

אנו מודים לשיה יו (Regeneron Pharmaceuticals) להתחלה מלמד אותנו את הטכניקה וHGD ד&quot;ר ראסל תומסון (אלברט איינשטיין לרפואה) להדרכה המתמדת שלו בהיבטים שונים של הטכנולוגיה. עבודה זו מומנה על ידי Hunter College, CUNY להתחיל את הקרנות ופרס NSF לחם IOS-1,249,166. אנו מודים NYULMC histopathology Core מרכז NYUCI תמיכת גרנט, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 להיסטולוגיה בכבד עכבר.

כל הניסויים שתוארו כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש בהאנטר קולג&#39;, האוניברסיטה של ​​העיר ניו יורק. 1. הכנה של ה-DNA פלסמיד ללא רעלן פנימי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבה אחת של חיי...

<ol>
	<li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA.">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li><li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+foreign+gene+expression+in+hepatocytes+after+tail+vein+injections+of+naked+plasmid+DNA.">High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.</a> Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).</li><li>Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+and+therapeutic-level+hepatic+gene+expression+of+human+factor+IX+after+naked+plasmid+transfer+in+vivo.">Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo.</a> Mol Ther. 3, 947-957 (2001).</li><li>Magin-Lachmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+delivery+of+intact+BAC+DNA+--+comparison+of+different+methods.">In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods.</a> J Gene Med. 6, 195-209 (2004).</li><li>Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+the+human+hepatitis+delta+virus+genome+Is+initiated+in+mouse+hepatocytes+following+intravenous+injection+of+naked+DNA+or+RNA+sequences.">Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences.</a> J Virol. 75, 3469-3473 (2001).</li><li>Giladi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+inhibits+hepatitis+B+virus+replication+in+mice.">Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice.</a> Mol Ther. 8, 769-776 (2003).</li><li>Kobayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector-based+in+vivo+RNA+interference:+dose-+and+time-dependent+suppression+of+transgene+expression.">Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression.</a> J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).</li><li>Layzer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+activity+of+nuclease-resistant+siRNAs.">In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs.</a> Rna. 10, 766-771 (2004).</li><li>McCaffrey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+adult+mice.">RNA interference in adult mice.</a> Nature. 418, 38-39 (2002).</li><li>McCaffrey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+hepatitis+C+translational+initiation+in+vitro,+in+cultured+cells+and+mice.">Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice.</a> Mol Ther. 5, 676-684 (2002).</li><li>McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+and+specific+morpholino+antisense+inhibitor+of+hepatitis+C+translation+in+mice.">A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice.</a> Hepatology. 38, 503-508 (2003).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroporation+as+the+mechanism+of+hydrodynamic+delivery.">Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery.</a> Gene Ther. 11, 675-682 (2004).</li><li>Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+uptake+and+gene+expression+mechanisms+following+intravenous+administration+of+plasmid+DNA+by+conventional+and+hydrodynamics-based+procedures.">Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures.</a> J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).</li><li>Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamics-based+procedure+involves+transient+hyperpermeability+in+the+hepatic+cellular+membrane:+implication+of+a+nonspecific+process+in+efficient+intracellular+gene+delivery.">Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery.</a> J Gene Med. 6, 584-592 (2004).</li><li>Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery+and+its+applications+in+pharmaceutical+research.">Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research.</a> Pharm Res. 28, 694-701 (2011).</li><li>Al-Dosari, M. S., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery:+principle,+limitations,+and+recent+progress.">Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress.</a> Aaps J. 11, 671-681 (2009).</li><li>Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery:+what+we+know+and+what+is+next.">Nonviral gene delivery: what we know and what is next.</a> Aaps J. 9, (2007).</li><li>Herweijer, H., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+progress+and+prospects:+hydrodynamic+gene+delivery.">Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery.</a> Gene Ther. 14, 99-107 (2007).</li><li>Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hydrodynamics-based+procedure+for+controlling+the+pharmacokinetics+of+gene+medicines+at+whole+body,+organ+and+cellular+levels.">The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).</li><li>Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+delivery.">Hydrodynamic delivery.</a> Adv Genet. 54, 65-82 (2005).</li><li>Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+delivery+of+the+Sleeping+Beauty+transposon+system+to+livers+of+mice+by+hydrodynamic+injection.">Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection.</a> Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).</li><li>Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence-based+in+vivo+monitoring+of+NF-kappaB+activity+through+a+gene+delivery+approach.">Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach.</a> Cell Commun Signal. 11, (2013).</li><li>Knapp, J. E., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+delivery+of+DNA.">Hydrodynamic delivery of DNA.</a> Methods Mol Biol. 245, 245-250 (2004).</li><li>Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+expression+of+naked+plasmid+DNA+encoding+hepatocyte+growth+factor+in+mice+promotes+liver+and+overall+body+growth.">Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth.</a> Hepatology. 33, 848-859 (2001).</li><li>Maruyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression+of+naked+DNA+delivered+to+rat+liver+via+tail+vein+injection.">High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection.</a> J Gene Med. 4, 333-341 (2002).</li><li>Hen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+foreign+genes+in+chicks+by+hydrodynamics-based+naked+plasmid+transfer+in+vivo.">Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo.</a> Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).</li><li>Eastman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+catheter-based+procedures+for+transducing+the+isolated+rabbit+liver+with+plasmid+DNA.">Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA.</a> Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).</li><li>Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naked+plasmid+DNA+transfer+to+the+porcine+liver+using+rapid+injection+with+large+volume.">Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume.</a> Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).</li><li>Vanden Bossche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+general+aspects+of+the+distribution+and+epidemiology+of+bovine+trypanosomosis+in+southern+Africa.">Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa.</a> Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).</li><li>Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis:+Epidemiology+and+control.">Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control.</a> Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).</li><li>Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primate+trypanosome+lytic+factors.">Characterization of primate trypanosome lytic factors.</a> Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).</li><li>Pays, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trypanolytic+factor+of+human+serum.">The trypanolytic factor of human serum.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).</li><li>Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+trypanosome+lytic+factor+from+human+serum.">Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum.</a> Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).</li><li>Vanhamme, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+L-I+is+the+trypanosome+lytic+factor+of+human+serum.">Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum.</a> Nature. 422, 83-87 (2003).</li><li>Nielsen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haptoglobin-related+protein+is+a+high-affinity+hemoglobin-binding+plasma+protein.">Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein.</a> Blood. 108, 2846-2849 (2006).</li><li>Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosome+lytic+factor,+a+subclass+of+high-density+lipoprotein,+forms+cation-selective+pores+in+membranes.">Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes.</a> Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).</li><li>Perez-Morga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+L-I+promotes+trypanosome+lysis+by+forming+pores+in+lysosomal+membranes.">Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes.</a> Science. 309, 469-472 (2005).</li><li>Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+apolipoprotein+components+within+the+trypanosome+lytic+factor+complex+revealed+in+a+novel+transgenic+mouse+model.">Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model.</a> J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).</li><li>Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+resistance-associated+protein+blocks+lysosomal+targeting+of+trypanosome+lytic+factor+in+Trypanosoma+brucei.">Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei.</a> Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).</li><li>Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery+of+baboon+trypanosome+lytic+factor+eliminates+both+animal+and+human-infective+African+trypanosomes.">Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+trypanolytic+ApoL1+variants+with+kidney+disease+in+African+Americans.">Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans.</a> Science. 329, 841-845 (2010).</li><li>Tzur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+the+APOL1+gene+are+highly+associated+with+end+stage+kidney+disease+risk+previously+attributed+to+the+MYH9+gene.">Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene.</a> Hum Genet. 128, 345-350 (2010).</li><li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver.">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14, 129-137 (2007).</li></ol>

כאשר מבוצע כהלכה, HGD הוא אמצעי בטוח ויעיל להפליא של משלוח transgene. השלבים הקריטיים לHGD המוצלח הם: 1) מספק את הכמות הנכונה של ה-DNA בנפח גדול של מי מלח רכב 2) לוריד הזנב של עכבר 3) בפחות מ -8 שניות. למרות התהליך של הזרקה עצמה ללא ספק דורש קצת מי...

מאז התיאור הראשון שלה על ידי יו et al. וג&#39;אנג et al., משלוח הידרודינמית גן (HGD) הפך לכלי רב ערך ללימוד תפקוד גן במערכות מכרסמים מודל 1, 2. הטכניקה כרוכה בהזרקה המהירה (5-7 שניות) בהיקפים גדולים (8-12% ממשקל גוף) של פתרון לוריד הזנב של עכברים כדי להקל על הספיגה של ה-DNA פלסמיד על ידי התאים של אברי מטרת 1, 2. תנאים אלו מובילים לביטוי גנים חזק בכבד ובביטוי פחות גנים בכליות, טחול, הריאות ולב. הזרקה של 10 מיקרוגרם פלסמיד pCMV-LacZ יכולה transfect ככל 40% מhepatocytes, מה שהופך HGD השיטה היעילה ביותר, לא ויראלי, in vivo מסירת הגן עד כה 1. בניגוד לנישאים נגיפיים, pDNA הוא קל להכנה, לא לעורר תגובה חיסונית במארח המכרסם 3 ואינו מהווה סיכון בריאותי על ידי recombining עם הסוףוירוסי ogenous. בנוסף, מאחר שמולקולות ה-DNA מועברות על ידי HGD לא צריכה אריזה, שיטה זו מתאימה למשלוח של כרומוזומים בקטריאלי מלאכותיים (BAC) גדולים כמו 150 KB 4. סוגים אחרים של מולקולות שכבר נמסרו על ידי שיטה הידרודינמית כוללים RNA 5-10, 11 morpholinos, חלבוני 12, 13 ומולקולות קטנות אחרות 12, 14. היתרונות והחסרונות של HGD על פני שיטות משלוח אחרות כבר נדונו בביקורות מצוינות בספרות 15-20 ומספר המחברים סיפק תיאור מפורט של ההליך 21-23. היכרות transgenes לעכברים על ידי HGD היא בטוחה ויעיל 1-3, 24 והשיטה נעשתה שימוש בחולדות עם הצלחה דומה 25. עם שינויים מסוימים, ניסויי הוכחה של הקונספט בוצעו בתרנגולות 26, ראבביטים 27 וחזירים 28, אם כי, vivo היישום בטכניקה זו בבעלי חיים גדולים יותר עדיין מהווה אתגר. בעת השימוש בשיטה זו, עוד הגבלה נפוצה היא שרבים מוקטורי הביטוי היונקים הזמינים חסרים את המרכיבים כדי להשיג רמה גבוהה מתמשכת, של ביטוי גנים. באמצעות פלסמיד, ביטוי גני pCMV לוק באברי המטרה ניכר כבר בעשר דקות לאחר HGD, לעומת זאת, רמת הביטוי הראשונית, הגבוהה יורדת בצורה חדה בשבוע שלאחר הזרקת 1 הראשון. ביטוי transgene ארוך טווח אפשרי בהתאם לאמרגן ואינטרון השתמש בפלסמיד עיצוב 3, 24 זריקות עם זאת, תחזוקה של ביטוי גנים ברמה הגבוהה דורשת לעתים קרובות חוזרות ונשנות. מסיבה זו, HGD עשוי להיות פחות מתאים ללמוד מחלות כרוניות שהן תוצאה של חשיפה ארוך טווח לחלבונים מזיקים או מוצרי חלבון. עם המגבלות האלה, HGD הוא כלי רב עוצמה במיוחד ללימוד פותפקיד tential של גן ואת ההשפעה שלו מוטציות in vivo, כמו גם את ההשפעות והרגולציה של חלבונים הטיפוליים ולהקמת מודלים של בעלי חיים למחלות (לסקירה, ראה 15). לדוגמא, HGD ניתן להשתמש כדי להקצות פונקציה לתחומים וחומצות אמינו של חלבונים על ידי החדרת בנפרד מבני גנים שונים לעכברים שהגנים המתאימים בנוקאאוט. יתר על כן, בטכניקה זו ניתן להשתמש בכל זן עכבר. פרוטוקול זה מתאר HGD בעכברים עם דגש על ההיבטים הטכניים הדרושים כדי להשיג transfection המוצלח: החדרת מחט נכונה לוריד, הזרקת הנפח ומהירות המשלוח. יישומה של שיטה זו בא לידי הביטוי במודל של עכברים של trypanosomiasis אפריקה, מחלה של בני אדם ובעלי חיים קטלנית 29, 30. בעוד כמה מינים של trypanosomes לגרום למחלות בבעלי חיים, רוב לא יכול לגרום למחלה בבני אדם בשל מולדת מתחמים חיסוניים בבגורמי עונג עילאי טבע דם הנקראים trypanosome ממס (TLFs) 29, 31 ב, 32. , ליפופרוטאינים אלה יוצרים הנקבוביות בצפיפות גבוהה (HDL) מכילים שני חלבונים ייחודיים, הפרימטים ספציפיים:. HPR, ליגנד, המאפשר את הספיגה של TLFs לtrypanosomes, ותתנצ-I, את רכיב ממס ביום 31 ב, 33-38 Trypanosoma rhodesiense brucei הוא מסוגל להדביק בני אדם בשל ביטוי של חלבון בסרום הקשורים התנגדות (SRA) שנקשר ומנטרל תתנצ-אני אדם 34, 39. בון TLF לא נוטרל על ידי SRA בשל תתנצ-חלבון מסתעף 40. כפי שדווח בעבר, באמצעות וקטור יונקים ביטוי (pRG977), ביטוי מהונדס של רכיבי TLF בון בעכברים מקנה הגנה מפני trypanosomes אדם זיהומיות 40. הנתונים שהוצגו כאן הנציג להדגים כיצד מסירת גן הידרודינמית ניתן להחיל כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות של חלבון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcohol Prep Wipe</td>
			<td style="width:113px;">Webcol</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6818</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AST kit, Amplite Colorimetric</td>
			<td style="width:113px;">AAT Bioquest</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical Tube, 50 ml</td>
			<td style="width:113px;">BD Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:113px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12362</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:113px;">KIMTECH</td>
			<td align="right" style="width:119px;">34120</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse Tail Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MTI RST</td>
			<td style="width:167px;">Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305109</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">pRG977 (mammalian expression vector)</td>
			<td style="width:113px;">Regeneron Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Material Transfer Agreement required</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">NC9054335</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">309657</td>
			<td style="width:167px;">Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice

ביטוי יעיל של transgenes in vivo הוא בעלת חשיבות מכרעת בלימוד תפקוד גן ובפיתוח טיפולים למחלות. בשנים האחרונות, משלוח הידרודינמית גן (HGD) התפתחה כשיטת פשוטה, מהירה, בטוחה ויעילה לאספקת transgenes למכרסמים. טכניקה זו נשענת על הכוח שנוצר על ידי ההזרקה המהירה של כמויות גדולות של פתרון פיסיולוגי כדי להגדיל את החדירות של קרום תא של איברי perfused ובכך להעביר דנ&quot;א לתוך תאים. אחד היתרונות העיקריים של HGD הוא היכולת להציג transgenes לתאי יונקים באמצעות DNA עירום פלסמיד (pDNA). היכרות עם גן אקסוגני באמצעות פלסמיד היא מינימאלי מייגע, יעיל ביותר ובניגוד לנישאים נגיפיים, בטוח להפליא. HGD שימש בתחילה להעברת גנים לעכברים, הוא משמש כעת כדי לספק מגוון רחב של חומרים, כולל oligonucleotides, כרומוזומים מלאכותיים, רנ&quot;א, חלבונים ומולקולות קטנות לעכברים, חולדותו, במידה מוגבלת, בעלי חיים אחרים. פרוטוקול זה מתאר HGD בעכברים ומתמקד בשלושה היבטים מרכזיים של השיטה שהן קריטיים לביצוע ההליך בהצלחה: הכנסה נכונה של המחט לווריד, נפח ההזרקה ומהירות המשלוח. ניתנות דוגמאות כדי להראות את יישומה של שיטה זו לביטוי החולף של שני גנים המקודדים חלבונים מופרשים, הפרימטים ספציפיים, אפוליפופרוטאין LI (תתנצ-I) וחלבונים הקשורים לhaptoglobin (HPR).

מיקום נכון של המחט לוריד הזנב של העכבר (כפי שמודגם באיור 1) הוא תנאי הכרחי לאספקת transgene בהצלחה על ידי transfection מבוסס הידרודינמיקה. לעתים קרובות החלק המאתגר ביותר של הטכניקה, לעומת זאת, הוא השמירה של המחט בתוך וריד הזנב ללא תנועה כך שכל הנפח של הזריקה יכול להיות מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice at JoVE.com

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

ביטוי חולף של חלבונים על ידי הידרודינמית ג&#39;ין משלוח בעכברים

בtransfection vivo של DNA עירום על ידי מסירת גן הידרודינמית מציג גנים לתוך הרקמה של בעלי חיים עם תגובה דלקתית מינימאלית. כמויות מספיקות של מוצר גן נוצרות באופן שתפקוד הגן והרגולציה, כמו גם מבנה חלבון ותפקוד ניתן לנתח.

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...