Name: in vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein
Uploaded: 2015-01-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein at JoVE.com

This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.

1. إعداد الكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عازلة تجميع (20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4، 100 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA). تخزين في RT ومستقرة لعدة أشهر. الملحق 1 ملي dithiothreitol (DTT) قبل الاستخدام. ملاحظة: منطقة عازلة على أساس HEPES (10 ملي HEPES، ودرجة ا?...

هذا البروتوكول يوضح شروط الفحص المختلفة والأدوات التي كشف تاو سريع حركية التجميع التي تعتمد على الفسفرة. في مقايسة المحطة، يتم إضافة الصبغة مضان تى اتش تى لجزء من رد فعل إزالتها من مزيج الرئيسي في كل نقطة زمنية. اميلويد يسببها ملزم ثم يقاس مضان 26. في المجموعة ال?...

مرض الزهايمر (AD) هو واحد من مجموعة كبيرة من الاضطرابات العصبية المعروفة باسم tauopathies. في الجوهر tauopathy علم الأمراض الكامنة هو التشابك الليفي العصبي، NFTS، في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة 1-4. كثافة NFT يرتبط مع ضعف الادراك 3،5 والخلايا العصبية وفقدان 6. NFT يحتوي على بروتين تاو hyperphosphorylated في المقام الأول (المشار إليها باسم &quot;P-تاو&quot; من الآن فصاعدا) التي تشكل خيوط مستقيمة أو حلزونية تقرن (PHF) 7،8. تاو هو بروتين يرتبط أنيبيب يعتقد لتسهيل النقل المحاور التي لا غنى عنها للإشارات العصبية والاتجار 9،10. كل جزيء تاو يحتوي على 2 إلى 3 الفوسفات في الدماغ العادي، ولكن زيادة المحتوى فسفوريل عدة طيات في المرضى الذين tauopathy 11. من المحتمل أن تساهم في تاو hyperphosphorylation بما في ذلك GSK3β (الجليكوجين سينسيز كيناز 3β) وCDK5 (السيكلين دي تحركات متعددةكيناز معلقة 5) 12،13، ولكن على الزناد المباشر للالفسفرة المرضية لا يزال بعيد المنال 14. الفسفرة غير طبيعية في أو بالقرب من الزخارف ملزم أنيبيب تنأى تاو من أنيبيب 15، ويسبب تاو سوء الترجمة إلى المقصورة somatodendritic، حيث oligomerizes ف تاو إلى خيوط مستقيمة أو حلزونية تقرن التي يمكن أن تتبلمر في نهاية المطاف إلى الادراج NFT. أدى التعادل وثيق بين hyperphosphorylation تاو، وتشكيل NFT، والتنكس العصبي إلى فرضية السائدة التي التشابك ف تاو الحصول على ردود السامة للخلايا أفكارك وغيرها، وبالتالي هي السبب الكامن وراء tauopathy تنكس عصبي 16،17. تم إطلاق شاشات المخدرات والاختبارات السريرية في وقت مبكر على أساس هذا الافتراض 18. ومع ذلك، تواجه هذه الفرضية التحديات 19،20. على سبيل المثال، سانتا كروز وآخرون أظهرت أن الوظائف المعرفية من الفئران المعدلة وراثيا يمكن أن تتحسن عن طريق قمع التعبير عن المسختاو البشري، على الرغم من استمرار NFTS لتشكيل جزيئات من تاو القائمة 21. في نموذج ذبابة الفاكهة، فقد تبين NFT لعزل وعصاري خلوي تاو السامة لحماية الخلايا العصبية الكامنة 22،23. ومن الواضح أن دور التسبب في NFT، إن وجدت، سوف تؤثر بشكل كبير على اتجاه التنمية العلاجات tauopathy. في تركيزات عالية، المؤتلف أو العادي بروتين تاو الدماغ بشكل عفوي ولكن ببطء يبلمر إلى بنية تشبه PHF في المختبر، كما يتبين من ربط عدة ورقة β فضل الأصباغ الفلورية، المجهر الإلكتروني، وتشتت الضوء الطيفي 24-27. مضيفا الهيبارين أو حمض الأراكيدونيك، وهو من الأحماض الدهنية وفرة في دماغ الإنسان، ويسرع بشكل كبير في تشكيل PHF isoform- تاو ومحفز تعتمد على التركيز الخلق 28-32. يثير الاهتمام والفضول، تنقية تاو hyperphosphorylated من أدمغة AD أو عن طريق شاملة أعدت في تفاعلات الفسفرة المختبر لggregates أسرع وأكثر كفاءة 26،33-35. هذه النتائج هي في الاتفاق ممتازة مع الأدوار المرضية للف تاو. وبالتالي يجوز للنظام في المختبر على أساس تجميع ف تاو بمثابة أداة قوية لفحص AD المخدرات. ونظرا لارتباط وثيق بين تجميع تاو والتنكس العصبي التدريجي للم، وكذلك فشل الأخير في تطوير العقاقير التي تستهدف وحة Aβ، علامة أخرى النسيجية الرئيسية 36-38 م، والفائدة في اكتشاف العقاقير التي تتحكم تاو تجميع آخذ في الارتفاع. في الواقع، العديد من الجماعات قد بدأت بالفعل شاشات المخدرات في الإنتاجية المختلفة، وذلك باستخدام المختبر في ردود الفعل تاو التجميع كما الفحص الابتدائي. تم العثور على عدد من المواد الكيميائية لعرض الأنشطة المثبطة أو انعكاس على تاو التجميع في المختبر 39-42. ومع ذلك، كل الشاشات الحالية منظم تاو تاو تجميع تستخدم معدلة أن يفتقد العلامة المرضية الرئيسية من الفوسفورylation، ورفع مصدر قلق لخصوصية وفعالية استخدام هذه المركبات في علاج م. واحدة من العقبات الرئيسية لتطوير المقايسات تجميع لتوصيف والكيمياء الحيوية وفحص AD المخدرات هو إنتاج كميات كافية من البروتين تاو hyperphosphorylated ذات الصلة pathophysiologically. باستخدام نظام الحفز سحابات بمساعدة الذي شكل الإسوي 1N4R من تاو وكيناز GSK-3β وشارك أعرب في E. القولونية كما يسين سستة البروتينات الانصهار، وتغلبنا على هذا التحدي (. سوي وآخرون، المقدمة؛ انظر الشكل 1 للمنتجات النهائية تاو وف تاو، انظر أيضا 43 لأولي الشامل توصيف الطيف من ص-تاو). من لجنة من تسعة أجسام مضادة محددة لمواقع الفسفرة مختلفة من تاو، وشوهدت إشارات إيجابية في ثمانية مواقع (لا تظهر البيانات). أدناه، وصفنا البروتوكولات وأدوات القياس التي يمكن أن تفرق تجميع د الحركيifferences بين تاو معدلة والأنواع ف تاو. تم تعديل هذه المقايسات من البروتوكولات نشرت أن تقاس زيادة مضان من thioflavin T (تى اتش تى) أو thioflavin S (تي إتش إس) عند اميلويد (المجاميع تاو) ملزمة 26. في أول &quot;محطة&quot;، نهج لا صبغ، يتم تجميع ردود الفعل تجميع وحضنت في غياب الصبغة اميلويد. في نقاط زمنية مختلفة، تتم إزالة قسامة من كل رد فعل ومختلطة مع حجم مساو من المخزن المؤقت تى اتش تى التي تحتوي على وقف التجميع والسماح تى اتش تى لربط المجاميع تاو. ويقاس مضان من قبل IAP FluoroMax-2 التألق. في المجموعة الثانية &quot;مع صبغ&quot; مراقبة الفحص المستمر، يتم تضمين تى اتش تى أو تي إتش إس في ردود الفعل التجميع. ويمكن قياس مضان باستمرار طوال التجربة بأكملها يدويا أو باستخدام قارئ لوحة متعددة. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف مقايسة يستخدم تركيز شبه الفسيولوجية من تاو وف تاو للتجميع في مو قياس مستمردي. تأثير الفسفرة يبقى كشفها بسهولة. أدناه، فإننا سوف تصف الإجراءات العملية خطوة بخطوة، وتظهر نتائج ممثلة من هذه المقايسات. سوف مناقشة بعض من إيجابيات وسلبيات كل نهج، فضلا عن التطبيقات المحتملة متابعة فحص المخدرات. بتركيز عال، تاو المجاميع في هياكل تشبه اميلويد من تلقاء أنفسهم. ومع ذلك، في المختبر، وعادة ما تسارع تاو fibrillization من هذه المحرضات كما الهيبارين (متوسط ​​الوزن الجزيئي، 6،000 جم / مول) وحمض الأراكيدونيك. الأمثلة الموضحة في هذه الوثيقة تتضمن 30 ميكرومتر الهيبارين. ويتم رصد تشكيل تاو المجاميع اميلويد من قبل مضان الناتجة عن اميلويد ملزمة thioflavin T (تى اتش تى) أو thioflavin S (تي إتش إس). على ملزم لالمجاميع تاو، تى اتش تى يسلك التحول الأحمر في مضان (الإثارة: 450 نانومتر؛ الانبعاثات ذروتها: 485 نانومتر). تي إتش إس، من ناحية أخرى، لديها ضعف الانبعاثات في 510 نانومتر (الإثارة في 450 نانومتر) قبل اميلويد ملزمة، ولكن هذا fluorescencزيادات الإلكترونية بشكل كبير في وجود بروتين اميلويد مثل تاو مجمعة 44. كلا الأصباغ تعمل بشكل جيد في الكشف عن تاو وف تاو التجميع. بسبب ذروة الانبعاثات قوية واسعة نسبيا من تى اتش تى (انظر الشكل 2)، وهناك فقط 30٪ تخفيض في وحدة مضان في 510 نانومتر. للراحة، ونحن نستخدم نفس مزيج من موجات الإثارة / الانبعاثات (أي 450 نانومتر / 510 نانومتر) لمراقبة تاو تجميع عند استخدام إما صبغ. ويمكن أن يتم تجميع تاو في وجود أو عدم وجود الصبغة، وهذا يتوقف على الغرض من الفحص وتوافر البروتين تاو. وتظهر كل من وسائط من ردود الفعل أدناه. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن لشرح تشغيل اثنين من الأدوات المختلفة - مقياس التألق عينة واحدة (ISA-سبكس FluoroMax-2) وقارئ متعدد لوحة (SpectraMax M2). وينبغي أن تكون قادرة على التكيف مع هذه البروتوكولات لتناسب احتياجاتهم الخاصة وتوفر أداة القراء.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="449">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:103px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Trizma&#160;base</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1503</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">MAL-7581-06</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">15576-028</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T3516</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin S</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1892</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:116px;">heparin</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">H3393</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">D9779</td>
			<td style="width:103px;">Stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">96-well plate</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:103px;">3917</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">ISA SPEX FluoroMax-2</td>
			<td style="width:128px;">Horiba</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:116px;">SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader</td>
			<td style="width:128px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:128px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:103px;">MAB3494</td>
			<td style="width:103px;">Stored at &#8211;80&#176;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

باستخدام تاو المؤتلف وف تاو (الشكل 1)، أنشأنا اثنين من بروتوكولات مختلفة للمقارنة بين حركية تجميع تاو وف تاو، والاستفادة من انبعاث مضان قوي من تى اتش تى وتي إتش إس عليه وملزم لamyloidal المجاميع البروتين، بما في ذلك تاو وف تاو (الشكل 2). مع أو بدون صبغة الف?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein at JoVE.com

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

واستخدمت البروتينات تاو معدلة وhyperphosphorylated في اثنين من فحوصات في المختبر تجميع للكشف عن حركية تجميع سريع تعتمد على hyperphosphorylation. هذه المقايسات تمهد الطريق لشاشات المستقبلية للمركبات التي يمكن أن تعدل بميل تاو hyperphosphorylated لتشكيل الألياف التي تكمن وراء تطور مرض الزهايمر.

في المختبر تجميع فحوصات عن طريق Hyperphosphorylated تاو البروتين

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

التصاق وتكدس الصفيحات تحت التدفق باستخدام خلايا تدفق ميكروفلويديك

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

في المختبر الهجرة الخليوي والغزو فحوصات

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

في المختبر مثلأيشن الفحص لدراسة البروتين أرجينين مثلأيشن

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...