Name: use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

ويدعم العمل في المختبر SM من قبل زمالة بحوث التنمية الوظيفي يلكوم ترست [WT097411MA].

<ol>
	<li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system.">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li><li>Phalipon, A., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella's+ways+of+manipulating+the+host+intestinal+innate+and+adaptive+immune+system:+a+tool+box+for+survival.">Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival.</a> Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).</li><li>Welch, M. D., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3-mediated+actin-based+motility:+A+tail+of+pathogen+abuse.">Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse.</a> Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).</li><li>Haglund, C. M., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogens+and+polymers:+microbe-host+interactions+illuminate+the+cytoskeleton.">Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins:+the+fourth+component+of+the+cytoskeleton.">Septins: the fourth component of the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).</li><li>Saarikangas, J., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+functions+of+septins+in+metazoans.">The emerging functions of septins in metazoans.</a> EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapment+of+intracytosolic+bacteria+by+septin+cage-like+structures.">Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures.</a> Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62+and+NDP52+proteins+target+intracytosolic+Shigella+and+Listeria+to+different+autophagy+pathways.">p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways.</a> J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells.">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria.">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li><li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans.">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection.">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469, 323-335 (2011).</li><li>Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-defense:+how+cell-autonomous+immunity+protects+against+pathogens.">Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens.</a> Science. 340, 701-706 (2013).</li><li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+bacterial+clearance:+a+not+so+clear+picture.">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autophagy:+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication.">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li><li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish.">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy.">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588 (2013).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+permeabilization+of+cells+and+tissues.">Fixation and permeabilization of cells and tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2008).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8, 445-544 (2012).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> The Zebrafish Book. , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).</li><li>He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+autophagic+activity+in+transgenic+GFP-Lc3+and+GFP-Gabarap+zebrafish+embryos.">Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos.</a> Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).</li><li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+renovation+of+cells+and+tissues.">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li><li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+levels+of+p62+control+cytoplasmic+inclusion+body+formation+in+autophagy-deficient+mice.">Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice.</a> Cell. 131, 1149-1163 (2007).</li><li>Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction.">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).</li><li>Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 2010-2010 (2011).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (9), (2009).</li><li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+autophagy+in+zebrafish.">Analyzing autophagy in zebrafish.</a> Autophagy. 6, 642-644 (2010).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).</li><li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity.">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

عند رصد الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي في المختبر باستخدام خلايا زراعة الأنسجة، والبروتوكولات المذكورة في المادتين 1 و 2 يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا زراعة الأنسجة. وعلاوة على ذلك، لمتابعة الالتهام الذاتي (على سبيل المثال، ATG8 / LC3 + ف] autophagosomes) والهيكل الخلوي (على سبيل المثال، ذيول أكتين، أقفاص septin) ديناميكية في الوقت الحقيقي خلال العدوى الشيجلا باستخدام التصوير الحية، وخلايا زراعة الأنسجة يمكن عابر باستخدام GFP-، يبني RFP- أو CFP الموسومة كما وصفت سابقا 7،8. لزيادة نسبة الخلايا المصابة بواسطة الشيجلا (أي مرغوب فيه عموما لتحليلها في الوقت الحقيقي على اعتبار أن الشغيلة يمكن أن تغزو 5-30٪ من خلايا هيلا في 100: 1 وزارة الداخلية)، مباشرة إضافة 400 ميكرولتر من الشغيلة (OD 600 = 0.3 -0.6) إلى الخلايا في 2 مل MEM (المتعطشة المصل) وانتظر لا يقل عن 1.5 ساعة عدوى بكتيرية آخر للدخول كافية، والهروب من يبلوع، والنسخ، والاتحاد الافريقيالاعتراف tophagy وseptin الحبس. بدلا من ذلك، يمكن للمرء استخدام سلالة الشيجلا M90T الفجر العالمية التي تعبر عن adhesin AfaE ولقد أعلى بكثير قدرات الغزو في الخلايا الظهارية مقارنة مع سلالة M90T 28. من المذكرة، لم يتم بعد اختبار سلالة M90T الفجر العالمية في الجسم الحي باستخدام الزرد. يمكن أن تظل لوحات من المستعمرات الشغيلة في 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام وتستخدم لعدة تجارب. لكن، مع مرور الوقت، مستعمرات الشغيلة التي فقدت البلازميد الفوعة يمكن أيضا استيعاب الكونغو الأحمر ويبدو أن الاحتفاظ بلازميد الفوعة بهم. لهذا السبب نحن نوصي لاستخدام مخزونات البكتيرية جديدة عندما يكون ذلك ممكنا. عند رصد بيولوجيا الخلية من عدوى في الجسم الحي والبروتوكولات وصفها في المادتين 3 و 4 استخدام wildtype AB خط الزرد. لمراقبة التفاعلات -leukocyte الشغيلة، وخطوط الزرد المعدلة وراثيا يمكن استخدامها، على سبيل المثال، MPX: GFP أو lyz: DsRed البصرية لإيزي العدلات 19،29،30 أو MPEG1: mcherry لتصور الضامة 19،31. لتصور الالتهام الذاتي في الجسم الحي، وGFP-LC3 خط المعدلة وراثيا الزرد 19،24 يمكن استخدامها كما هو موضح في القسم 3.8. إلى التشويش على الالتهام الذاتي في الجسم الحي، والجرعة الفعالة morpholino قليل النوكليوتيد يجب أن يتم تقييم التجربة على أساس كفاءتها لمنع الربط نص أو الترجمة البروتين. فإنه من المستحسن إجراء تجربة المعايرة وتأكيد استنزاف بواسطة RT-PCR (للصق morpholino قليل النوكليوتيد) أو SDS-PAGE (لمتعدية morpholino قليل النوكليوتيد) 32. عزل الحمض النووي الريبي من أجنة الزرد أو يرقات يمكن أن يؤديها باستخدام استخراج guanidinium ثيوسيانات-الفينول كلوروفورم. لاستخراج البروتين من اليرقات الزرد (8 إلى 15 يرقة / أنبوب)، التجانس ميكانيكيا باستخدام مدقة في 200 ميكرولتر تحلل العازلة (1 M تريس، 5 M كلوريد الصوديوم، 0.5 M EDTA، 0.01٪ octylphenol أكسيد الإيثيلين condensatالإلكترونية، ومثبط البروتياز). أنابيب الطرد المركزي في 19،000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ونقل طاف لأنبوب جديد. إضافة عازلة Laemmli وتسخين العينة في 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ويمكن تخزين لست] في -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها، ويمكن تقييمها من قبل الغرب النشاف كما هو موضح في القسم 2.3. الزرد هو نموذج ممتاز للتطبيق في الجسم الحي المخدرات. التحليل باستخدام أليغنوكليوتيد] morpholino يمكن أن تستكمل مع المخدرات التي أنشئت لمعالجة الالتهام الذاتي (مثل rapamycin وbafilomycin). ويمكن علاج اليرقات غير المصابة و / أو المصابين rapamycin (1.5 ميكرومتر) أو bafilomycin (80 نانومتر) المخفف في E2 ويمكن تقييم تدفق ذاتية البلعمة بواسطة النشاف الغربي كما هو موضح في 25،33. يمكن تقييم نتيجة التلاعب الالتهام الذاتي على نتيجة العدوى وبقاء اليرقات المصابة كما هو موضح في القسم 3.5. بالإضافة إلى دراسة الخلية المضيفةالمحددات، في المختبر وفي الجسم الحي بروتوكولات يمكن تطبيقها لتقييم المحددات البكتيرية اللازمة للاعتراف الالتهام الذاتي، وذلك باستخدام سلالات متحولة البكتيرية التي يتم الاعتراف بها بشكل مختلف من قبل الالتهام الذاتي، على سبيل المثال، الشيجلا ΔicsA (البروتين الشيجلا يكسا المجندين N-WASP ثم Arp2 / 3 لذيل الأكتين وتشكيل septin قفص، وفي غيابها لا يمكن وجود ذيول أكتين، لا أقفاص septin) وShigellaΔicsB (الشيجلا يتجنب استجابة ذاتية البلعمة عبر البروتين المستجيب البكتيرية IcsB، والذي يمنع تجنيد من الآلات الالتهام الذاتي ليكسا، وفي غيابها يمكن أن يكون هناك المزيد من أقفاص septin، والمزيد من الالتهام الذاتي) 7،8. الشيجلا ليس الممرض الطبيعي من الزرد وينمو على النحو الأمثل عند 37 درجة مئوية. ومع ذلك، فقد أظهرت العمل الذي عوامل الفوعة اللازمة لغزو الشغيلة، والهروب من فجوة أكلة والتكرار في قبرصيtosol يمكن التعبير و وظيفية في يرقات الزرد في 28 ° C 19. 28 ° C هي درجة الحرارة الأكثر شيوعا لتربية الزرد ودرجة الحرارة القياسية لضمان التنمية الزرد العادي 23. اللافت في الأحداث الكبرى المسببة للأمراض التي تؤدي إلى داء الشيغيلات في البشر (أي موت الخلايا البلاعم والغزو والضرب داخل الخلايا الظهارية، وانتشار الخلية الى خلية والدمار التهاب ظهارة المضيف) وترد بإخلاص في نموذج الزرد العدوى الشيجلا 19. وأعرب بتواجد مطلق الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي وجينات لديها مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية. وقد أظهرت الدراسات أن الماوس خروج المغلوب من الالتهام الذاتي أساسي 26 أو 5 septin الجينات الجنينية هي القاتلة، وأنه من المرجح أن بعض هذه الجينات سيكون من الضروري للتنمية الزرد (أيضا على الرغم من أن هذه المشكلة قد يمكن خفضها من خلال حقيقة أن لديها العديد من الزردالجينات paralogous 33). إذا كان الأمر كذلك، هناك عدة بدائل للتغلب على هذه المسألة، بما في ذلك (ط) استخدام الكواشف الدوائية لتنظيم الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي، (ب) يمكن معاير morpholinos أسفل، (ج) خروج المغلوب من الجينات يمكن تصميم لخلية معينة فقط أنواع، و / أو (د) الجينات المسؤولة عن الاعتراف ذاتية البلعمة التي ليست ضرورية للتنمية الحيوانية (مثل، P62) قد تكون مستهدفة. بينما الزرد هو نظام نموذج مثالي للتحقيق الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي خلال العدوى الشيجلا، تفتقر الأدوات الجزيئية حاليا. يحتاج حقل لتوليد أدوات جديدة والتعبير خلية محرك أقراص معينة من البروتينات في المصالح. لاسقاط التعبير عن الجينات الالتهام الذاتي / الهيكل الخلوي، يطلب تسلسل morpholino جديدة، وطرق جديدة للهندسة الجينوم (على سبيل المثال، TALEN، CRISPR / Cas9) يمكن أن تستخدم أيضا. في غضون ذلك، العديد من الأدوات إنشاؤه مسبقا للدراسات الإنسان أو الماوسقد تعمل على قدم المساواة لالزرد. البكتيريا داخل الخلايا S. برزت الفلكسنرية باعتبارها كائن نموذج استثنائي لمعالجة القضايا الرئيسية في علم الأحياء، بما في ذلك قدرة البكتيريا لا بد من الاعتراف من قبل النظام المناعي 1،2. الخلية المضيفة توظف septins لتقييد الحركة من S. الفلكسنرية واستهدافهم لالالتهام الذاتي، عنصر حاسم في خلية مناعة ذاتية الحكم 7،8. وتشير هذه الملاحظات إطار جزيئي جديد لدراسة الالتهام الذاتي وقدرته على البكتيريا تتحلل عصاري خلوي. والمسألة الرئيسية الآن هي فك تماما الأحداث الجزيئية والخلوية الأساسية، والتحقق من صحة هذه الأحداث تحليلها في المختبر خلال العدوى البكتيرية في الجسم الحي باستخدام نماذج حيوانية ذات الصلة. ولهذه الغاية، تم تأسيس الزرد كمضيف جديد قيما لتحليل S. عدوى الفلكسنرية 19. التفاعلات بين البكتيريا والخلايا المضيفة يمكن تصويرها بدقة عالية، وينبغي أن نموذج الزرد تكون مفيدة لفهم بيولوجيا الخلية من عدوى الشغيلة في الجسم الحي. اليرقات الزرد يمكن استخدامها لتحقيق في دور الالتهام الذاتي البكتيري في دفاع المضيف، وأظهرت أن العمل الذي اضطراب الالتهام الذاتي يمكن أن تؤثر سلبا على بقاء المضيفة في الاستجابة للعدوى الشيجلا 19. الملاحظات الناتجة عن دراسة الشيجلا، septin الحبس والالتهام الذاتي في المختبر باستخدام خلايا زراعة الأنسجة في الجسم الحي واستخدام اليرقات الزرد قد توفر التطورات الأساسية في فهم دفاع المضيف. أنها يمكن أن تشير أيضا إلى وضع استراتيجيات جديدة تهدف إلى مكافحة الأمراض المعدية. وثمة هدف بالغ الأهمية من هذا التقرير هو لفهم الأحداث الجزيئية والخلوية تحليلها في المختبر (أي الالتهام الذاتي، والذيول أكتين، septin الحبس) خلال العدوى البكتيرية في الجسم الحي في سياق الأنف والحنجرةكائن غضب، وذلك باستخدام اليرقات الزرد. إذا لم تكن مألوفة مع البيولوجيا الزرد والمناولة، يمكن للمرء الرجوع إليها في البروتوكولات عمق المناسبة لتربية الزرد 23 و في تحليل الجسم الحي للعدوى الزرد 19،35.

الفلكسنرية الشيجلا، بكتيريا سلبية الغرام ممرض للأمعاء الغازية، ويمكن الهروب من phagosomes إلى العصارة الخلوية، وتتبلمر المضيف الأكتين الهيكل الخلوي للتهرب من الاستجابات المناعية عصاري خلوي وتعزيز الحركة البينية بين الخلايا و1،2. على الرغم من فهم الحركة القائم على الأكتين في المختبر 3،4، آليات تقييد نشر البكتيريا في الجسم الحي لم يعرف تماما. هذا أمر بالغ الأهمية من أجل فهم أكثر اكتمالا من المناعة الفطرية والدفاع المضيف. Septins، عائلة الحفظ جدا من البروتينات بين metazoans، هم ثلاثي فسفات (GTP) -binding البروتينات التي تجمع في المجمعات مغاير بلازميدة قليلة القسيمات وتشكل خيوط غير القطبية التي ترتبط بها مع الأغشية الخلوية والهيكل الخلوي 5،6. وقد اكتشف مؤخرا أن عمل الخلايا المضيفة المصابة يمكن أن يمنع الشيجلا الأكتين الحركة القائمة على compartmentalizing بواسطة البكتيريا التي تستهدف autophAGY داخل &quot;أقفاص septin&quot;، وكشف عن آلية الخلوية الأولى التي يصد الأكتين الحركة القائمة على 7،8. حقل مفتوح على مصراعيه للتحقيق يكمن الآن في &quot;البيولوجيا septin والعدوى. التجمع Septin، الناجمة عن مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض (مثل الليستريا المستوحدة 7،9،10، المتفطرة البحرية 7،8، المبيضات البيض 11)، قد تظهر كقضية أساسية في دفاع المضيف 5،12. الالتهام الذاتي، وهي عملية تدهور الخلايا الحفظ جدا، ويعتبر عنصرا أساسيا في مناعة خلايا مستقلة بسبب قدرتها على تقديم البكتيريا عصاري خلوي إلى يحلول 13،14. ومع ذلك، فإن دور الالتهام الذاتي البكتيريا في الجسم الحي لتقييد أو تشجيع تكرار البكتيرية لا تزال غير مفهومة 15،16. برزت الزرد (دانيو rerio) كنموذج الفقارية لدراسة التهابات لأنه يمكن الوصول بصريافي مراحل اليرقات عندما يكون نظام المناعة الفطري هو بالفعل ظيفية 17،18. وقد تميزت الأعمال الأخيرة حساسية اليرقات الزرد إلى S. الفلكسنرية، نموذجا لالالتهام الذاتي البكتيرية 15، واستخدمت الشيجلا نموذج عدوى -zebrafish لدراسة التلاعب الالتهام الذاتي لعلاج مضاد للجراثيم في الجسم الحي 19. يقدم هذا التقرير أدوات والمقايسات لدراسة S. جديدة التفاعلات الفلكسنرية مع الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي. في خطوة أولى، وبروتوكولات لرصد وصفها التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي باستخدام عدوى الشغيلة من خط الخلايا الظهارية البشرية هيلا. لتقييم دور التفاعلات الالتهام الذاتي، الهيكل الخلوي على عملية العدوى الشغيلة في المختبر، وأساليب للتلاعب الالتهام الذاتي ومكونات الهيكل الخلوي (باستخدام الكواشف سيرنا أو الدوائية) وتقدم. وقد أظهرت عمل جديد باستخدام الشيجلا العدوى ساليرقات الزرد جمعة، فحوصات مماثلة يمكن تطبيقها على دراسة بيولوجيا الخلية من عدوى في الجسم الحي. بروتوكولات لإعداد وتصيب اليرقات الزرد مفصلة، ​​وتقييم استجابة المضيف للإصابة الشغيلة في الجسم الحي والبروتوكولات لتحديد بقاء وتقدم المضيف وعبء البكتيرية اليرقات المصابة. طرق لرصد تجنيد septin والالتهام الذاتي علامات لالشيجلا (باستخدام إما ثابتة أو يعيشون اليرقات الزرد) وطرق لاختبار دور هذه العمليات في الجسم الحي [أليغنوكليوتيد] باستخدام morpholino (1-4 حقن في الأجنة مرحلة الخلية) أو الكواشف الدوائية ( وأضاف مباشرة إلى ماء الحمام الزرد)] وتناقش أيضا. ومن المتوقع هذا البرنامج من العمل لتوفير نظرة ثاقبة الآليات المطلوبة للسيطرة على العدوى عن طريق استجابات المضيف عصاري خلوي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="771">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:240px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1793&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass microcapillars&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coarse manual manipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;">M-152</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6762</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Dumont #5 fine tweezers</td>
			<td style="width:240px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forchlorfeneuron&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">JetPEI transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">101-01N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L5288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">NB100-2220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V2111</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MatTek glass bottom dish</td>
			<td style="width:240px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM plus L-alanyl-L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">41090028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MEM non-essential amino acids solution</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller device&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co., Novato,</td>
			<td>P-87&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1404</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Phenol red solution</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693116001</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:412px;">p62/SQSTM1 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Cliniscience</td>
			<td style="width:119px;">PM045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8781</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11360039</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12252-011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield hard set mounting medium containing DAPI&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1500&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions

الشيغيلة الفلكسنرية هو الممرض داخل الخلايا التي يمكن الهروب من phagosomes للوصول إلى العصارة الخلوية، وبلمرة الأكتين المضيف الهيكل الخلوي لتعزيز حركية ونشره. وقد أظهرت عمل جديد أن البروتينات المشاركة في الحركة القائم على الأكتين ترتبط أيضا إلى الالتهام الذاتي، عملية تحلل الخلايا حاسمة لخلية مناعة ذاتية الحكم. لافت للنظر، قد الخلايا المضيفة منع الحركة القائم على الأكتين من S. الفلكسنرية بواسطة compartmentalizing البكتيريا داخل &quot;أقفاص septin&quot; واستهداف لهم الالتهام الذاتي. هذه الملاحظات تشير إلى أن فهم أكثر اكتمالا من septins، وهي عائلة من البروتينات ملزمة GTP الخيطية، سوف توفر رؤى جديدة في عملية الالتهام الذاتي. ويصف هذا التقرير بروتوكولات لمراقبة التفاعلات الالتهام الذاتي، الهيكل الخلوي الناجم عن S. الفلكسنرية في المختبر باستخدام خلايا زراعة الأنسجة في الجسم الحي واستخدام اليرقات الزرد. هذه البروتوكولات تمكن التحقيق من الخلايا mechanisالسيدة التي تتحكم في نشر البكتيريا على مستوى الحي الجزيئية الخلوية، وكله.

على إصابة خلايا زراعة الأنسجة في المختبر، S. الفلكسنرية تستطيع الهروب من يبلوع وغزو العصارة الخلوية. في العصارة الخلوية، يمكن أن الخلايا المضيفة منع الحركة القائم على الأكتين من الشغيلة من قبل compartmentalizing البكتيريا داخل أقفاص septin (الشكل 1A). ويمكن أيضا البكتيريا شرك أقفاص septin أن توصف من قبل علامات الالتهام الذاتي P62 (الشكل 1B) وLC3 (الشكل 1C). هذه الملاحظات تبرز آلية جديدة للدفاع المضيف الذي يقيد نشر الجراثيم الغازية، وأيضا تكشف روابط جديدة بين الالتهام الذاتي والهيكل الخلوي. لافت للنظر، واستنفاد علامات الالتهام الذاتي يقلل بشكل ملحوظ septin الحبس من البكتيريا (الشكل 2A)، وأظهرت النتائج أيضا إلى أن استنزاف septin الحبس يقلل بشكل ملحوظ من علامات التوظيف الالتهام الذاتي 8. وهكذا، على الأقل في حالة الشيجلا، septin التجمع القفص والتشكل جسيم بلعمي ذاتيويمكن الاطلاع ن كعمليات مترابطة. متطلبات الخلوية الأخرى للتجزئة الشيجلا بواسطة أقفاص septin تشمل بلمرة الأكتين والنشاط أكتوميوزين (الشكل 2B). لا يوجد نموذج الفأر الطبيعي داء الشيغيلات، والتحقيق في الشيجلا المرضية، septin البيولوجيا والالتهام الذاتي البكتيريا في الجسم الحي يمكن أن تستفيد من نموذج حيواني جديد من العدوى، ويرقات الزرد 19. فمن الممكن أن تصيب اليرقات الزرد عن طريق حقن البكتيريا في مختلف المواقع التشريحية مثل الحقن في الوريد الذيلية للتجارب البقاء على قيد الحياة، وذيل حقن العضلات في الجسم الحي المجهري (الشكل 3A). اعتمادا على الجرعة، S. الفلكسنرية حقنه في يرقات الزرد يمكن إما أن يتم مسح خلال 48 ساعة بعد الإصابة، أو قد يؤدي إلى الإصابة تدريجيا وقاتلة في نهاية المطاف (أرقام 3B - 3D). الفوعة كرة القدم الشيجلاوأعرب ctors عند 28 درجة مئوية، ودرجة الحرارة المثلى للنمو الزرد، وعدوى الزرد بواسطة الشيجلا يعتمد على بصرامة نظامها إفراز النوع الثالث (T3SS) 19، أحد المحددات الفوعة أساسيا في الأمراض التي تصيب البشر. معا تؤخذ هذه الملاحظات تشير إلى أن اليرقة الزرد تمثل مجموعة جديدة قيمة لفي الجسم الحي تحليل العدوى الشيجلا. إمكانية الوصول البصرية اليرقات الزرد يمكن تصور الحبس septin في الجسم الحي (الشكل 4A)، وهو إنجاز لم يسبق له مثيل الذي تم إنجازه باستخدام نماذج المضيف الثدييات. لاستكمال أدلة على أن أقفاص septin إيقاع البكتيريا المستهدفة لالالتهام الذاتي في الجسم الحي، يمكن للمرء أن تصيب اليرقات الزرد المعدلة وراثيا معربا عن GFP-LC3 ومراقبة التوظيف الالتهام الذاتي علامة لالشيجلا (الشكل 4B). لتحليل ultrastrucutral من autophagosomes الشغيلة في الجسم الحي، شectron المجهري يمكن استخدامها لتظهر بوضوح عصاري خلوي من عزل البكتيريا عن طريق الفجوات غشاء مزدوج 19. وينظر الالتهام الذاتي كعنصر رئيسي من خلايا مناعة ذاتية الحكم وآلية الدفاع حاسمة ضد البكتيريا intracytosolic 14-16. لتوصيف وظيفة الالتهام الذاتي في الجسم الحي، يمكن استخدام P62 المعالجة morpholino اليرقات الزرد. على عكس الآلات الالتهام الذاتي الأساسية [على سبيل المثال، البروتينات 36 الالتهام الذاتي ذات الصلة (ATGs) 26]، P62 ليست ضرورية للتنمية الفقاريات 27 واليرقات الزرد بالتالي يمكن أن تتطور بشكل طبيعي قبل العدوى. لافت للنظر، اليرقات-P62 المنضب تلقيح مع S. نتيجة الفلكسنرية إلى زيادة كبيرة في الوفيات وزيادة عبء البكتيرية 19. بالاتفاق مع العمل في المختبر تبين أن التجمع septin القفص هو مترابطة مع تشكيل جسيم بلعمي ذاتي 7،8، يتم تقليل توظيف septin إلى الشيجلا بوضوح في يرقات-P62 المنضب ( <strاونج&gt; الشكل 4C). وتظهر هذه البيانات أن بقاء الزرد يعتمد على بوساطة P62 الالتهام الذاتي للسيطرة على عدوى بكتيرية داخل الخلايا. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. قفص septin في المختبر. أصيب (A) خلايا هيلا مع S. الفلكسنرية لمدة 4 ساعة و 40 دقيقة، ثابتة، وصفت مع الأجسام المضادة لSEPT9 وphalloidin، وتصويرها بواسطة microcopy متحد البؤر. شريط النطاق، أصيب 1 ميكرون (B) خلايا هيلا مع S. الفلكسنرية لمدة 4 ساعة و 40 دقيقة، ثابتة، وصفت مع الأجسام المضادة لP62 وSEPT2، وتصويرها بواسطة المجهر الفلورسنت ضوء. شريط النطاق، و transfected 1 ميكرون. خلايا (C) هيلا مع GFP-ATG8 / LC3، مصابة S. الفلكسنرية لمدة 4 ساعة و 40 دقيقة، ثابتة، وصفت مع الأجسام المضادة لSEPT2، وتصويرها بواسطة ضوء الفلورسنت ميلcroscopy. شريط النطاق، 1 ميكرون. تم تعديل هذه الأرقام من Mostowy وآخرون 7. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. متطلبات الخلوية لالشيجلا تشكيل قفص -septin. (A) تم علاج خلايا هيلا مع التحكم (CTRL)، P62، ATG5، ATG6 أو ATG7 سيرنا. تم immunoblotted لست] خلية كاملة من خلايا سيرنا المعاملة لGAPDH، P62، ATG5، ATG6، أو ATG7 لإظهار كفاءة سيرنا نضوب (أعلى). أصيب الخلايا المعالجة سيرنا مع S. الفلكسنرية لمدة 4 ساعة و 40 دقيقة، ثابتة، والمسمى لالمجهر الكمي. الرسوم البيانية (القاع) تمثل متوسط ​​± SEM٪ من الشغيلة داخل أقفاص SEPT2 من ن ≥3 تجارب في العلاج. (B) أصيبوا خلايا هيلا مع S. وlexneri، وتعامل مع DMSO، مثبط حركة الخلايا D (CytD)، latrunculin B (LatB)، نوكودازول (Noco)، أو blebbistatin (البثرة)، وبعد 4 ساعة 40 دقيقة كانت ثابتة والمسمى لالمجهر الكمي. رسوم بيانية تمثل متوسط ​​± SEM٪ من الشغيلة داخل أقفاص SEPT2 من تجربتين مستقلة لكل معاملة. تم تعديل هذه الأرقام من Mostowy وآخرون 7. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> الشكل 3. نموذج الزرد العدوى الشيجلا. (A) الصور لتوضيح اتجاه اليرقة الزرد تحت stereomicroscope. تمركزت (اللوحة اليسرى) الزرد اليرقات الإخصاب آخر 72 ساعة أفقيا في لوحة حقن مع الجانب الظهري من يواجه إبرة الحقن. تم إجراء العدوى (لوحة الأوسط) مجرى الدم عن طريق ينجecting البكتيريا (حل الأحمر) في الوريد الذيلية، الخلفي لافتتاح البولي التناسلي. تم تنفيذ (اللوحة اليمنى) العدوى في العضلات الذيل عن طريق حقن البكتيريا (حل الأحمر) أكثر من الجسيدة. (B) منحنيات البقاء على قيد الحياة من 72 ساعة الإخصاب آخر اليرقات حقنه بجرعات مختلفة من S. الفلكسنرية وحضنت عند 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة إصابة آخر. تم تصنيف اللقاح اعتبارا منخفض (&lt;10 3 كفو، والدوائر المفتوحة) ومتوسطة (~ 4 × 10 3 كفو، مثلثات مفتوحة) أو عالية (~ 10 4 كفو والساحات المفتوحة). يعني٪ ± SEM (قضبان أفقية) من ن ≥3 التجارب في الصف الواحد اللقاح. (C) تعداد البكتيريا الحية في الخليط من اليرقات الفردية في أوقات مختلفة إصابة آخر يقاس الطلاء على LB. ملاحظة، يرقات فقط بعد أن نجا مدرجة في تحليل تعداد العدوى. يعني ± SEM (قضبان أفقية) يظهر أيضا. (D) توزيع GFP- الشيجلا يحددهاالتصوير الحي باستخدام stereomicroscope الفلورسنت في أوقات مختلفة إصابة آخر باستخدام المنخفض والمتوسط، أو جرعة عالية من اللقاح (الذيلية الحقن في الوريد). تراكب من نقل صورة (الرمادي) ومضان GFP (الأخضر) (B) - (D) تم تعديل هذه الأرقام من Mostowy وآخرون 19. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> أصيب الرقم 4. بيولوجيا الخلية من عدوى الشغيلة في الجسم الحي. (A) يرقات اسماك الزرد في عضلة الذيل مع GFP- الشيجلا (جرعة منخفضة) لمدة 24 ساعة، ثابتة، وصفت مع الأجسام المضادة ضد SEPT7 (الحمراء) وGFP (الخضراء )، وتصويرها بواسطة المجهر متحد البؤر. شريط النطاق، أصيب 5 ميكرون (B) GFP-LC3 اليرقات الزرد مع mCherry- الشيجلا (جرعة متوسطة) ل4 ساعة، ثابتة، وصفت مع الأجسام المضادة ضد mCherry (أحمر) وGFP (الأخضر)، وتصويرها بواسطة المجهر متحد البؤر. . شريط النطاق، 1.5 ميكرون (C) يرقات اسماك الزرد تعامل مع أي التحكم (CTRL، الصورة اليسرى) أو P62 (الصورة اليمنى) أصيب morpholinos مع GFP- الشغيلة لمدة 4 ساعة (جرعة متوسطة)، ثابتة، وصفت مع الأجسام المضادة ضد SEPT7 ( أحمر) وGFP (الأخضر)، وتصويرها بواسطة المجهر متحد البؤر. السهام تبرز بعض الأمثلة من الشغيلة شرك في أقفاص septin (CTRL) أو لا (P62 المنضب) إصابة آخر 4 ساعة. شريط النطاق، 5 ميكرون. تم تعديل هذه الأرقام من Mostowy وآخرون 19.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

لمواجهة نشر الممرض، الخلايا المضيفة إعادة تنظيم الهيكل الخلوي لتجزئة البكتيريا وحمل الالتهام الذاتي. يتم تحديد العدوى عن طريق الشيجلا الخلايا زراعة الأنسجة، المضيف والمحددات الكامنة وراء هذه العملية الممرض وتتميز. باستخدام نماذج الزرد العدوى الشيجلا، يتم التحقيق في دور الجزيئات والآليات التي اكتشفت في الجسم الحي.

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

استخدام اعتراض البصرية لدراسة التفاعلات المرضي المضيف الحيوي للخلية الحية التصوير

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

استخدام نموذج لوصف EpiAirway طويل الأجل المضيف الممرض التفاعلات

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

استخدام<em&gt; غاليريا mellonella</em&gt; كما كائن نموذج لدراسة<em&gt; البكتيريا المستروحة</em&gt; عدوى

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

إنشاء "الكثيفة ينقول الإدراج المكتبة استخدام البكتيرية التصريف" في "انتيروباكتيريال سلالات مثل" الإشريكيّة القولونية أو دوسنتاريا فليكسنيري

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

التصوير Ca2 + الردود خلال العدوى دوسنتاريا الخلايا الظهارية

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

الاستخدام التكميلي للتقنيات المجهرية والقراءة الفلورية في دراسة تفاعلات Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

مونولاييرس كولونويد البشرية لدراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة، كومينسالس، وظهاره الأمعاء المضيف

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...