Name: use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

Werk in de SM laboratorium wordt ondersteund door een Wellcome Trust Research Career Development Fellowship [WT097411MA].

<ol>
	<li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system.">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li><li>Phalipon, A., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella's+ways+of+manipulating+the+host+intestinal+innate+and+adaptive+immune+system:+a+tool+box+for+survival.">Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival.</a> Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).</li><li>Welch, M. D., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3-mediated+actin-based+motility:+A+tail+of+pathogen+abuse.">Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse.</a> Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).</li><li>Haglund, C. M., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogens+and+polymers:+microbe-host+interactions+illuminate+the+cytoskeleton.">Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins:+the+fourth+component+of+the+cytoskeleton.">Septins: the fourth component of the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).</li><li>Saarikangas, J., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+functions+of+septins+in+metazoans.">The emerging functions of septins in metazoans.</a> EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapment+of+intracytosolic+bacteria+by+septin+cage-like+structures.">Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures.</a> Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62+and+NDP52+proteins+target+intracytosolic+Shigella+and+Listeria+to+different+autophagy+pathways.">p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways.</a> J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells.">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria.">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li><li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans.">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection.">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469, 323-335 (2011).</li><li>Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-defense:+how+cell-autonomous+immunity+protects+against+pathogens.">Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens.</a> Science. 340, 701-706 (2013).</li><li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+bacterial+clearance:+a+not+so+clear+picture.">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autophagy:+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication.">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li><li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish.">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy.">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588 (2013).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+permeabilization+of+cells+and+tissues.">Fixation and permeabilization of cells and tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2008).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8, 445-544 (2012).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> The Zebrafish Book. , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).</li><li>He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+autophagic+activity+in+transgenic+GFP-Lc3+and+GFP-Gabarap+zebrafish+embryos.">Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos.</a> Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).</li><li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+renovation+of+cells+and+tissues.">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li><li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+levels+of+p62+control+cytoplasmic+inclusion+body+formation+in+autophagy-deficient+mice.">Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice.</a> Cell. 131, 1149-1163 (2007).</li><li>Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction.">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).</li><li>Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 2010-2010 (2011).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (9), (2009).</li><li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+autophagy+in+zebrafish.">Analyzing autophagy in zebrafish.</a> Autophagy. 6, 642-644 (2010).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).</li><li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity.">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).</li></ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Bij het ​​bewaken van autofagie en het cytoskelet in vitro met behulp van weefselkweek cellen, kunnen de in de punten 1 en 2 beschreven protocollen worden toegepast op een breed scala van weefselkweek celtypes. Bovendien zou autofagie volgen (bijvoorbeeld ATG8 / LC3 + ve autofagosomen) en cytoskelet (bv. Actine staarten, Septin kooien) dynamica in real-time tijdens Shigella infectie met levende imaging, kan weefselkweek cellen tijdelijk worden getransfecteerd met GFP, RFP- of GVB-gemerkte constructen zoals eerder beschreven 7,8. (. Dwz algemeen wenselijk voor real-time analyse aangezien Shigella kan binnendringen 5-30% van HeLa-cellen bij 100 1 MOI) Om het percentage cellen geïnfecteerd door Shigella verhogen, direct voeg 400 ul van Shigella (OD 600 = 0,3 -0.6) om cellen in 2 ml MEM (serum uitgehongerd) en wacht ten minste 1,5 uur na infectie voldoende bacteriële binnenkomst, ontsnappen aan de phagosome, replicatie, autophagy erkenning en Septin kooien. Als alternatief kan men de Shigella M90T Afai stam die drukt de adhesine AfaE en hebben veel hogere invasie vaardigheden in epitheliale cellen in vergelijking met de M90T stam 28 gebruiken. Van de nota, de M90T Afai stam is nog niet in vivo getest met behulp van de zebravis. Platen van Shigella kolonies bij 4 ° C bewaard gedurende 2-3 dagen en voor verschillende experimenten. Na verloop van tijd, kolonies van Shigella dat de virulentie plasmide kan absorberen Congo Red en lijken hebben verloren hun virulentie plasmide behouden. Om deze reden adviseren wij om verse bacteriële voorraden te gebruiken als dat mogelijk is. Bij het ​​bewaken van de celbiologie van de infectie in vivo, protocollen beschreven in de hoofdstukken 3 en 4 maken gebruik van wildtype AB lijn zebravis. Om Shigella -leukocyte interacties monitoren, kunnen transgene zebravis lijnen worden gebruikt, bijvoorbeeld, MPX: GFP of Lyz: DsRed om visueleize neutrofielen 19,29,30 of mpeg1: mCherry om macrofagen 19,31 visualiseren. Om autofagie te visualiseren in vivo, kan het GFP-Lc3 zebravis transgene lijn 19,24 worden gebruikt zoals beschreven in paragraaf 3.8. Om autofagie verstoren in vivo, de effectieve morfolino oligonucleotide dosis moet proefondervindelijk worden bepaald op basis van de efficiëntie transcript splicing of eiwittranslatie remmen. Het is raadzaam om een titratie experiment uitgevoerd en de uitputting van RT-PCR (voor splice morfolino oligonucleotide) bevestigen of door SDS-PAGE (voor translationeel morfolino oligonucleotide) 32. RNA isolatie van zebravis embryo&#39;s en larven kan worden uitgevoerd met guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie. Om eiwitten extraheren uit zebravis larven (8 tot 15 larven / buis), mechanisch homogeniseren met stamper in 200 ul lysis buffer (1 M Tris, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% octylfenol ethyleenoxide condensate en protease inhibitor). Centrifugeer buizen bij 19.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 min en breng het supernatant naar een nieuwe buis. Voeg Laemmli buffer en verwarm het monster bij 95 ° C gedurende 15 minuten. Lysaten kunnen bij -80 ° C bewaard totdat het nodig is, en kan worden geëvalueerd door Western blotting zoals beschreven in paragraaf 2.3. De zebravis is een uitstekend model voor in vivo drug toepassing. Analyse middels morfolino oligonucleotiden kunnen worden aangevuld met gevestigde drugs autofagie (bijvoorbeeld rapamycine en bafilomycine) manipuleren. Uninfected en / of geïnfecteerde larven worden behandeld met rapamycine (1,5 uM) of bafilomycine (80 nM) verdund in E2 en autofagocytische flux kan worden geëvalueerd door Western blotting zoals beschreven in 25,33. Het gevolg van autofagie manipulatie van de uitkomst van de infectie en de overleving van de larven besmet kunnen worden geëvalueerd zoals beschreven in paragraaf 3.5. Naast het bestuderen gastheerceldeterminanten, in vitro en in vivo protocollen kunnen worden toegepast om bacteriële determinanten vereist autofagie herkenning te bepalen, waarbij bacteriële mutante stammen die differentieel worden herkend door autofagie, bijvoorbeeld., Shigella ΔicsA (de Shigella eiwitten ICSA rekruteert N-WASP en vervolgens Arp2 / 3 voor actine staart en Septin kooi vorming, in de afwezigheid ervan kan er geen actine staarten, geen Septin kooien) en ShigellaΔicsB (Shigella vermijdt de autophagic reactie via de bacteriële effector eiwit ICSB, die de werving van autofagie machines ICSA voorkomt, in zijn afwezigheid er kunnen meer Septin kooien, meer autofagie) 7,8. Shigella is geen natuurlijk pathogeen van de zebravis en groeit optimaal bij 37 ° C. Echter, heeft het werk aangetoond dat virulentie factoren die nodig zijn voor Shigella invasie, ontsnappen aan de fagocytaire vacuole en replicatie in de cytosol kan worden uitgedrukt en zijn functioneel in zebravis larven bij 28 ° C 19. 28 ° C is het meest gebruikte temperatuur zebravis toegepast en standaardtemperatuur normale zebravis ontwikkeling 23 waarborgen. Opvallend zijn de belangrijkste pathogene gebeurtenissen die tot shigellosis mens (dwz macrofaag celdood, invasie en vermenigvuldiging in epitheelcellen, cel-cel verspreiding, inflammatoire destructie van de ontvangende epitheel) getrouw weergegeven in de zebravis model van Shigella infectie 19. Autofagie en cytoskelet genen zijn alomtegenwoordig uitgedrukt en hebben een breed scala van biologische functies. Mouse studies hebben aangetoond dat knockout essentiële autofagie 26 of Septin genen 5 zijn embryonaal lethaal, en het is waarschijnlijk dat sommige van deze genen essentieel voor de ontwikkeling van de zebravis (wordt hoewel dit probleem kan worden verminderd door het feit dat meerdere zebravisparaloge genen 33). Dan zijn er verschillende alternatieven voor dit probleem, bevattende (i) het gebruik van farmacologische reagentia autofagie en het cytoskelet reguleren, (ii) morfolino kan worden getitreerd beneden verholpen, (iii) knockout van genen worden ontworpen voor specifieke cel types, en / of (iv) genen betrokken bij autofagocytische inzicht dat niet essentieel voor de ontwikkeling dier (bv., P62) worden gericht. Terwijl de zebravis is een ideaal modelsysteem om autofagie en het cytoskelet tijdens Shigella infectie te onderzoeken, zijn moleculaire technieken momenteel ontbreekt. Het veld moet om nieuwe instrumenten en rijden cel specifieke expressie van de eiwitten van belang te genereren. Neerhalen uitdrukking van autofagie / cytoskelet genen, zijn nieuwe morpholino sequenties nodig, en nieuwe methoden voor het genoom techniek (bijvoorbeeld, TALEN, CRISPR / Cas9) kan ook worden gebruikt. In de tussentijd verschillende tools die eerder gegenereerd voor mens of muis studieskan eveneens werken voor de zebravis. De intracellulaire bacteriën S. flexneri heeft ontpopt als een uitzonderlijke modelorganisme om belangrijke kwesties in de biologie, waaronder het vermogen van bacteriën om erkend te worden door het immuunsysteem 1,2 pakken. De gastheercel maakt gebruik septins om de beweeglijkheid van S. beperken flexneri en richten ze naar autofagie, een essentieel onderdeel van een cel autonoom immuniteit 7,8. Deze waarnemingen suggereren een nieuwe moleculaire kader om autofagie en zijn vermogen om cytosole bacteriën afgebroken studie. Een belangrijke kwestie is nu volledig ontcijferen van de onderliggende moleculaire en cellulaire gebeurtenissen, en deze gebeurtenissen in vitro tijdens bacteriële infectie in vivo geanalyseerd met behulp van relevante diermodellen valideren. Daartoe is de zebravis vastgesteld als een waardevolle nieuwe gastheer voor de analyse van S. flexneri infectie 19. Interacties tussen bacteriën en gastheercellen kan worden afgebeeld op hoge resolutie, ende zebravismodel moet nuttig zijn voor het begrijpen van de celbiologie van Shigella infectie in vivo aantonen. Zebravis larven kan worden gebruikt om de rol van bacteriële autofagie afweer onderzoeken en werk heeft aangetoond dat de verstoring van autofagie nadelig kunnen beïnvloeden mogelijk overleving in respons op Shigella infectie 19. De opmerkingen gegenereerd uit onderzoek van Shigella, Septin kooien en autofagie in vitro middels weefselkweek cellen en in vivo in zebravis larven kunnen fundamentele vorderingen in het begrijpen afweer verschaffen. Ze konden ook voorstellen voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën ter bestrijding van infectieziekten. Een kritische doel van dit rapport is het gevoel van de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen in vitro geanalyseerd te maken (dat wil zeggen, autofagie, actine staarten, Septin kooien) tijdens bacteriële infectie in vivo in het kader van een entire organisme, met behulp van de zebravis larven. Als niet bekend is met de zebravis biologie en behandeling, kan men verwijzen naar in de diepte protocollen voor een goede zebravis veeteelt 23 en in vivo analyse van zebravis infectie 19,35.

Shigella flexneri, een Gram-negatieve invasieve enteropathogene bacterie, kan ontsnappen uit phagosomes naar het cytosol, en polymeriseren de gastheer actinecytoskelet om cytosole immuunreacties te omzeilen en het bevorderen van intra-en intercellulaire beweging 1,2. Ondanks de kennis van actine gebaseerde motiliteit in vitro 3,4, de mechanismen beperken bacteriële verspreiding in vivo niet volledig gedefinieerd. Dit is van cruciaal belang voor een beter begrip van de aangeboren immuniteit en afweer. Septins, een sterk geconserveerde familie van eiwitten onder metazoa, zijn guanosine trifosfaat (GTP) -bindende eiwitten die assembleren in hetero-oligomere complexen en vormen niet-polaire filamenten die associëren met cellulaire membranen en het cytoskelet 5,6. Recent werk heeft ontdekt dat geïnfecteerde gastheercellen kunnen voorkomen Shigella actine gebaseerd beweeglijkheid door compartimentering bacteriën gericht op autophagy binnen &#39;Septin kooien&#39;, het openbaren van de eerste cellulaire mechanisme dat actine gebaseerd beweeglijkheid 7,8 tegengaat. Een groot open veld van onderzoek ligt nu in &#39;Septin biologie en infectie&#39;. Septin assemblage, veroorzaakt door een verscheidenheid aan pathogenen (bijvoorbeeld Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), kan naar voren als een belangrijk punt in de afweer 5,12. Autophagy een sterk geconserveerd intracellulair afbraakproces wordt gezien als een belangrijke component van cel-autonome immuniteit vanwege zijn vermogen om cytosolische bacteriën leveren in het lysosoom 13,14. Echter, de rol van bacteriële autofagie in vivo te beperken of te bevorderen bacteriële replicatie blijft slecht begrepen 15,16. De zebravis (Danio rerio) ontstaan ​​als een vertebraat model voor de studie van infecties omdat het optisch bereikbaarbij de larvale stadia, wanneer het aangeboren immuunsysteem is reeds functioneel 17,18. Recent werk heeft de gevoeligheid van de zebravis larven S. gekenmerkt flexneri, een paradigma voor bacteriële autofagie 15, en heeft gebruik gemaakt van de Shigella -zebrafish infectie model om de manipulatie van autofagie voor antibacteriële therapie te bestuderen in vivo 19. Dit rapport biedt nieuwe hulpmiddelen en assays om S. studeren flexneri interacties met autofagie en het cytoskelet. In een eerste stap, protocollen monitoren autofagie cytoskelet interacties worden beschreven middels Shigella infectie van de menselijke epitheliale cellijn HeLa. Om de rol van autofagie-cytoskelet interacties op het Shigella infectieproces in vitro beoordelen methoden autofagie cytoskelet componenten (met siRNA of farmacologische reagentia) te manipuleren worden voorzien. Nieuw onderzoek heeft aangetoond dat door het gebruik van Shigella infectie of zebravis larven kunnen soortgelijke assays worden toegepast op de celbiologie van infectie in vivo te bestuderen. Protocollen voor te bereiden en te infecteren zebravis larven behandeld, en de gastheer respons op Shigella infectie in vivo te evalueren, protocollen bepalen samen overleving en bacteriële last van geïnfecteerde larven worden voorzien. Methoden om de werving van Septin en autofagie markers om Shigella controleren (met behulp van een vaste of levende zebravis larven) en methoden om de rol van deze processen te testen in vivo [behulp morfolino- oligonucleotiden (geïnjecteerd in 1-4 cel stadium embryo&#39;s) of farmacologische reagentia ( direct toegevoegd aan de zebravis badwater)] worden ook besproken. Dit programma van het werk zal naar verwachting inzicht in de voor de controle van de infectie door cytosole gastheer reacties mechanismen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="771">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:240px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1793&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass microcapillars&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coarse manual manipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;">M-152</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6762</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Dumont #5 fine tweezers</td>
			<td style="width:240px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forchlorfeneuron&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">JetPEI transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">101-01N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L5288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">NB100-2220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V2111</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MatTek glass bottom dish</td>
			<td style="width:240px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM plus L-alanyl-L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">41090028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MEM non-essential amino acids solution</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller device&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co., Novato,</td>
			<td>P-87&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1404</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Phenol red solution</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693116001</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:412px;">p62/SQSTM1 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Cliniscience</td>
			<td style="width:119px;">PM045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8781</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11360039</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12252-011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield hard set mounting medium containing DAPI&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1500&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions

Shigella flexneri is een intracellulaire pathogeen die kan ontsnappen uit phagosomes naar het cytosol te bereiken, en polymeriseren de gastheer actine cytoskelet om haar beweeglijkheid en de verspreiding te bevorderen. New werk heeft aangetoond dat eiwitten betrokken bij actine gebaseerde motiliteit eveneens verbonden met autofagie, een intracellulaire afbraakproces cruciaal voor mobiele autonome immuniteit. Opvallend, kunnen gastheercellen actine gebaseerde beweeglijkheid van S. te voorkomen flexneri door compartimentering van bacteriën in &#39;Septin kooien&#39; en richten ze naar autofagie. Deze waarnemingen geven aan dat een meer volledig begrip van septins, een familie van draadvormige-GTP-bindende eiwitten, zal nieuwe inzichten verschaffen in het proces van autofagie. Dit rapport beschrijft de protocollen bij autofagie-cytoskelet interacties veroorzaakt door S. bewaken flexneri in vitro middels weefselkweek cellen en in vivo in zebravis larven. Deze protocollen mogelijk onderzoek intracellulaire mechanisms dat bacteriële verspreiding op moleculair, cellulair en hele organisme te regelen.

Na infectie van weefselkweekcellen in vitro, S. flexneri kan ontsnappen uit de phagosome en binnen te vallen het cytosol. In het cytosol, kunnen gastheercellen de actine gebaseerde beweeglijkheid van Shigella te voorkomen door compartimentering van bacteriën in Septin kooien (figuur 1A). Bacteriën ingesloten door Septin kooien kan ook worden gelabeld door autofagie markers p62 (Figuur 1B) en LC3 (figuur 1C). Deze waarnemingen markeert een nieuw mechanisme van afweer die verspreiding van invasieve pathogenen beperkt, en ook onthullen nieuwe verbindingen tussen autofagie en het cytoskelet. Opvallend is dat de uitputting van autofagie markers aanzienlijk vermindert Septin kooien van bacteriën (Figuur 2A), en het werk heeft ook aangetoond dat de uitputting van Septin kooien vermindert werving van autofagie 8 markers. Aldus, althans bij Shigella, Septin kooiconstructie en autophagosome vormingenn kunnen worden gezien als onderling afhankelijke processen. Andere cellulaire eisen voor compartimentering van Shigella door Septin kooien bevatten actine polymerisatie en actomyosine activiteit (figuur 2B). Er is geen natuurlijke muismodel van shigellose, en het onderzoek van Shigella pathogenese, Septin biologie en bacteriële autofagie in vivo kunnen profiteren van een nieuw diermodel van infectie, de zebravis larven 19. Het is mogelijk zebravis larven besmetten injecteren bacteriën in verschillende anatomische plaatsen zoals caudale intraveneuze injecties overlevingsexperimenten en staart spier injecties in vivo microscopie (figuur 3A). Afhankelijk van de dosis, S. flexneri geïnjecteerd in de zebravis larven kan ofwel binnen de 48 uur na de infectie worden gewist, of kan leiden tot een progressieve en uiteindelijk fatale infecties (Figuren 3B - 3D). Shigella virulentie factors expressie bij 28 ° C, de optimale groeitemperatuur van zebravis en zebravis infectie door Shigella strikt afhankelijk van het type III secretiesysteem (T3SS) 19, in menselijke ziekte een belangrijke determinant voor virulentie. Genomen samen, deze waarnemingen wijzen erop dat de zebravis larven een waardevolle nieuwe host voor in vivo analyse van Shigella infectie. De optische toegankelijkheid van de zebravis larven maakt visualisatie van Septin kooien in vivo (figuur 4A), een prestatie die nog nooit eerder is uitgevoerd met behulp van zoogdiergastheer- modellen. Om bewijs te vullen dat Septin kooien vangen bacteriën gericht op autofagie in vivo, kan men transgene zebravis larven te infecteren die GFP-Lc3 en observeren autofagie marker rekrutering van Shigella (Figuur 4B). Voor ultrastrucutral analyse van Shigella autofagosomen in vivo, elEctron microscopie kan worden gebruikt om duidelijk de cytosolische vastlegging bacteriën door dubbel membraan vacuolen 19. Autofagie wordt gezien als een belangrijke component van cel-autonome immuniteit en een cruciale afweermechanisme tegen intracytosolic bacteriën 14-16. Om autofagie functie karakteriseren in vivo, kan p62-morpholino behandeld zebravis larven worden gebruikt. In tegenstelling tot de kern autophagy machines [bv. De 36 autophagy verwante eiwitten (ATG) 26], p62 is niet essentieel voor de ontwikkeling van vertebraten 27 en dus zebravis larven gewoonlijk vóór infectie. Opvallend-p62 uitgeput larven geënt met S. flexneri resulteren in significant verhoogde mortaliteit en een verhoogde bacteriële last 19. In overleg met de in vitro werk waaruit blijkt dat Septin kooiassemblage is onderling afhankelijk met autophagosome formatie 7,8, wordt Septin rekrutering voor Shigella duidelijk in-p62 uitgeputte larven verminderd ( <strong&gt; Figuur 4C). Deze gegevens tonen aan dat zebravis overleving afhankelijk-p62 gemedieerde autofagie intracellulaire bacteriële besmetting te bestrijden. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1 De Septin kooi in vitro. (A) HeLa-cellen werden geïnfecteerd met S. flexneri 4 uur 40 min, vaste, gelabeld met antilichamen tegen SEPT9 en falloïdine en afgebeeld door confocale microkopie. Schalingsbalk werden 1 urn. (B) HeLa-cellen geïnfecteerd met S. flexneri 4 uur 40 min, vaste, gelabeld met antilichamen tegen p62 en SEPT2 en afgebeeld door fluorescerend licht microscopie. Schalingsbalk werden 1 urn. (C) HeLa-cellen getransfecteerd met GFP-ATG8 / LC3, geïnfecteerd met S. flexneri 4 uur 40 min, vaste, gelabeld met antilichamen tegen SEPT2 en afgebeeld door fluorescerende microscopy. Schaal bar, 1 micrometer. Deze cijfers zijn gewijzigd vanaf Mostowy et al 7. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> Figuur 2 Cellular eisen Shigella -septin kooi formatie. (A) HeLa-cellen werden behandeld met controle (CTRL), p62, ATG5, ATG6 of ATG7 siRNA. Hele cellysaten van siRNA behandelde cellen werden immunoblotting voor GAPDH, p62, ATG5, ATG6 of ATG7 de doeltreffendheid van siRNA depletie (boven) vertonen. -siRNA behandelde cellen werden geïnfecteerd met S. flexneri gedurende 4 uur 40 min, vast, en gelabeld voor kwantitatieve microscopie. Grafieken (onderaan) stellen het gemiddelde ± SEM% van Shigella binnen SEPT2 kooien van n ≥3 experimenten per behandeling. (B) HeLa-cellen werden geïnfecteerd met S. flexneri, behandeld met DMSO, cytochalasine D (CytD), latrunculin B (LatB), nocodazole (Noco), of blebbistatin (Bleb) en na 4 uur 40 min werden vastgesteld en gelabeld voor kwantitatieve microscopie. Grafieken geven het gemiddelde% ± SEM van Shigella binnenkant SEPT2 kooien van twee onafhankelijke experimenten per behandeling. Deze cijfers zijn gewijzigd ten opzichte van Mostowy et al 7. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3 De zebravis model van Shigella infectie. (A) De beelden illustreren oriëntatie van de zebravis larven onder de stereomicroscoop. (Linker paneel) zebravis larven 72 uur na de bevruchting werden lateraal gepositioneerd in de injectie plaat met hun dorsale zijde naar de injectienaald. (Midden-panel) bloedbaan infectie werd uitgevoerd door injecterende de bacteriën (rode oplossing) in de staartader, posterieur van de urogenitale opening. (Rechter paneel) Infectie in de staart spier werd uitgevoerd door injectie van bacteriën (rode oplossing) over een somite. (B) overlevingscurven van 72 uur na de bevruchting larven geïnjecteerd met verscheidene doses S. flexneri en geïncubeerd bij 28 ° C gedurende 48 uur na infectie. De effectieve entstof werd geclassificeerd als laag (&lt;10 3 CFU, open cirkels), medium (~ 4 x 10 3 CFU, open driehoeken) of hoog (~ 10 4 CFU, open vierkantjes). Bedoel% ± SEM (horizontale balken) uit n ≥3 experimenten per inoculum klasse. (C) Bepaling van het aantal levende bacteriën in homogenaten van individuele larven op verschillende tijdstippen na infectie gemeten door platen op LB Let op, alleen larven na de infectie worden opgenomen in opsomming analyse overleefd. Gemiddelde ± SEM (horizontale balken) ook weergegeven. (D) Verdeling van GFP Shigella bepaald doorlive-beeldvorming met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop op verschillende tijdstippen na infectie met een lage, gemiddelde of hoge dosis entstof (caudale intraveneuze injecties). Overlay beeldoverdracht (grijs) en GFP-fluorescentie (groen) (B), van -. (D) hebben deze cijfers aangepast is Mostowy et al 19. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> Figuur 4 De celbiologie van Shigella infectie in vivo. (A) zebravis larven werden geïnfecteerd in de staart spier GFP Shigella (lage dosis) gedurende 24 uur, vastgesteld gelabeld met antilichamen tegen SEPT7 (rood) en GFP (green ) en afgebeeld door confocale microscopie. Schaal bar, 5 micrometer. (B) GFP-Lc3 zebravis larven besmet waren met mCherry- Shigella (medium dosis) voor4 uur, vastgesteld gelabeld met antilichamen tegen mCherry (rood) en GFP (groen) en afgebeeld door confocale microscopie. . Schaal bar, 1,5 micrometer (C) zebravis larven behandeld met ofwel controle (CTRL; linker afbeelding) of P62 (rechter afbeelding) morpholinos waren geïnfecteerd met GFP Shigella gedurende 4 uur (medium dosis), vaste, gelabeld met antilichamen tegen SEPT7 ( rood) en GFP (groen) en afgebeeld door confocale microscopie. Pijlen markeren enkele voorbeelden van Shigella ingesloten in Septin kooien (CTRL) of niet (p62 verarmd) een 4 uur na infectie. Schaal bar, 5 micrometer. Deze cijfers zijn gewijzigd vanaf Mostowy et al 19.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Pathogeen verspreiding tegen te gaan, gastheercellen reorganiseren hun cytoskelet om bacteriën te grendelen en veroorzaken autofagie. Met behulp van Shigella infectie van weefselkweek cellen, gastheer en pathogeen determinanten ten grondslag liggen aan dit proces worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Met behulp van zebravis modellen van Shigella-infectie, de rol van de ontdekte moleculen en mechanismen worden onderzocht in vivo.

Gebruik van<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Naar Autophagy-cytoskelet interacties te bestuderen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Gebruik van de EpiAirway Model voor het karakteriseren van op lange termijn gastheer-pathogeen interacties

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Gebruik<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Als modelorganisme om te studeren<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infectie

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flow Virometry Analyseer antigene Spectra van Virions en extracellulaire blaasjes

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Oprichting van een dichte Transposon invoeging bibliotheek met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw in de Enterobacterial stammen zoals Escherichia Coli of Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Imaging Ca2 + reacties tijdens Shigella besmetting van epitheliale cellen

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...