Name: use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

עבודה במעבדה SM נתמכת על ידי בקריירה מחקר פיתוח [WT097411MA] מלגת Wellcome Trust.

<ol>
	<li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system.">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li><li>Phalipon, A., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella's+ways+of+manipulating+the+host+intestinal+innate+and+adaptive+immune+system:+a+tool+box+for+survival.">Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival.</a> Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).</li><li>Welch, M. D., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3-mediated+actin-based+motility:+A+tail+of+pathogen+abuse.">Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse.</a> Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).</li><li>Haglund, C. M., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogens+and+polymers:+microbe-host+interactions+illuminate+the+cytoskeleton.">Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins:+the+fourth+component+of+the+cytoskeleton.">Septins: the fourth component of the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).</li><li>Saarikangas, J., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+functions+of+septins+in+metazoans.">The emerging functions of septins in metazoans.</a> EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapment+of+intracytosolic+bacteria+by+septin+cage-like+structures.">Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures.</a> Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62+and+NDP52+proteins+target+intracytosolic+Shigella+and+Listeria+to+different+autophagy+pathways.">p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways.</a> J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells.">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria.">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li><li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans.">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection.">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469, 323-335 (2011).</li><li>Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-defense:+how+cell-autonomous+immunity+protects+against+pathogens.">Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens.</a> Science. 340, 701-706 (2013).</li><li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+bacterial+clearance:+a+not+so+clear+picture.">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autophagy:+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication.">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li><li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish.">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy.">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588 (2013).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+permeabilization+of+cells+and+tissues.">Fixation and permeabilization of cells and tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2008).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8, 445-544 (2012).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> The Zebrafish Book. , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).</li><li>He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+autophagic+activity+in+transgenic+GFP-Lc3+and+GFP-Gabarap+zebrafish+embryos.">Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos.</a> Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).</li><li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+renovation+of+cells+and+tissues.">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li><li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+levels+of+p62+control+cytoplasmic+inclusion+body+formation+in+autophagy-deficient+mice.">Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice.</a> Cell. 131, 1149-1163 (2007).</li><li>Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction.">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).</li><li>Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 2010-2010 (2011).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (9), (2009).</li><li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+autophagy+in+zebrafish.">Analyzing autophagy in zebrafish.</a> Autophagy. 6, 642-644 (2010).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).</li><li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity.">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאשר ניטור autophagy ושלד התא במבחנה תוך שימוש בתאים בתרבית רקמה, יכולים להיות מיושמים בפרוטוקולים מפורטים בסעיפי 1 ו -2 למגוון רחב של סוגי תרבית רקמת תא. יתר על כן, כדי לעקוב autophagy (למשל, ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) ושלד תא (לדוגמא., זנבות אקטין, כלובי septin) דינמיקה בזמן אמת במהלך זיהום Shigella באמצעות הדמיה חיה, תאים בתרבית רקמה ניתן transfected זמני באמצעות GFP-, מבני RFP- או CFP מתויג כמו בעבר תיארו 7,8. כדי להגדיל את אחוז התאים הנגועים בShigella (כלומר, בדרך כלל רצוי לניתוח בזמן אמת בהתחשב בכך שShigella יכול לפלוש 5-30% מתאי הלה ב100:. 1 משרד הפנים), להוסיף ישירות 400 μl של Shigella (OD 600 = 0.3 -0.6) לתאים ב2 מ&quot;ל MEM (רעב לסרום) ולחכות לפחות 1.5 לאחר זיהום שעה לכניסת חיידקים מספיק, לברוח מphagosome, שכפול, auהכרת tophagy והקמה כלובי septin. לחלופין, ניתן להשתמש במתח Shigella M90T אפאי, המבטא את adhesin AfaE ויש לי את יכולות פלישה הרבה יותר גבוהות בתאי האפיתל בהשוואה לזן M90T 28. ראוי לציין, מתח M90T אפאי טרם נבדק in vivo באמצעות דג הזברה. צלחות של מושבות Shigella יכולות להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים ומשמשות לכמה ניסויים. עם זאת, לאורך זמן, מושבות של Shigella שאיבדו את הפלסמיד הארסיות גם יכול לספוג אדום קונגו ונראה שיש לי שמר פלסמיד ארסיותם. מסיבה זו אנו ממליצים להשתמש במניות חיידקים טריות במידת האפשר. כאשר ניטור הביולוגיה של התא של זיהום in vivo, פרוטוקולים מתוארים בסעיפי 3 ו דג הזברה שורת 4 שימוש wildtype AB. כדי לפקח על אינטראקציות -leukocyte Shigella, ניתן להשתמש בקווים דג הזברה מהונדסים, למשל, MPX: GFP או, liz: DsRed לחזותייםize נויטרופילים 19,29,30 או MPEG1: mCherry לדמיין מקרופאגים 19,31. כדי להמחיש autophagy in vivo, הקו המהונדס דג הזברה GFP-Lc3 19,24 יכול לשמש כמפורט בסעיף 3.8. להפריע autophagy in vivo, מינון oligonucleotide morpholino היעיל יש להעריך באופן ניסיוני המבוסס על יעילותה לעכב שחבור תמליל או תרגום חלבון. מומלץ לבצע ניסוי טיטרציה וכדי לאשר את הדלדול על ידי RT-PCR (לoligonucleotide morpholino אחוי) או על ידי SDS-PAGE (לoligonucleotide morpholino translational) 32. בידוד RNA מעוברים או זחלי דג הזברה יכול להתבצע באמצעות מיצוי thiocyanate-פנול, כלורופורם guanidinium. כדי לחלץ חלבון מזחלי דג הזברה (8 עד 15 זחלים / צינור), מכאני homogenize באמצעות העלי ב200 מאגר תמוגה μl (1 מ &#39;טריס, 5 M NaCl, 0.5 M EDTA, 0.01% condensat אתילן אוקסיד octylphenolדואר, ומעכבי פרוטאז). צנטריפוגה צינורות ב19,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולהעביר את supernatant לצינור חדש. הוסף חוצץ Laemmli ולחמם את המדגם על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ניתן לאחסן lysates ב -80 מעלות צלזיוס עד צורך, ויכול להיות מוערך על ידי מערבי סופג כאמור בסעיף 2.3. דג הזברה הוא מודל מצוין לin vivo יישום תרופה. ניתוח באמצעות oligonucleotides morpholino יכול להיות כהשלמה עם סמים הוקמו כדי לתפעל autophagy (למשל, rapamycin וbafilomycin). זחלים נגוע ו / או נגועים יכולים להיות מטופלים עם rapamycin (1.5 מיקרומטר) או bafilomycin (80 ננומטר) בדילול מלא בE2 ושטף autophagic יכול להיות מוערך על ידי מערבי סופג כפי שמתואר ב25,33. התוצאה של המניפולציה autophagy על התוצאה של הזיהום וההישרדות של הזחלים הנגועים ניתן להעריך כאמור בסעיף 3.5. בנוסף ללימוד תא מארחגורמים, במבחנה ובפרוטוקולי vivo יכולים להיות מיושמים על מנת להעריך גורמי חיידקים הנדרשים להכרה autophagy, באמצעות זני מוטציה חיידקים שמוכרים באופן דיפרנציאלי על ידי autophagy, למשל., Shigella ΔicsA (חלבון Shigella ICSA מגייס N-WASP ולאחר מכן Arp2 / 3 לזנב אקטין והיווצרות כלוב septin; בהעדרו לא יכול להיות זנבות אקטין, ללא כלובים septin) וShigellaΔicsB (Shigella ימנע את תגובת autophagic באמצעות חלבון חיידקי מפעיל IcsB, המונע את הגיוס של מכונות autophagy לICSA; בהיעדרו לא יכול להיות יותר כלובי septin, יותר autophagy) 7,8. Shigella הוא לא הפתוגן טבעי של דג הזברה וגדל בצורה אופטימלית על 37 C °. עם זאת, עבודה הראתה כי גורמים ארסי הנדרשים לפלישת Shigella, לברוח מvacuole phagocytic ושכפול בCYtosol יכול לבוא לידי ביטוי והם פונקציונליים בזחלי דג הזברה ב28 ° C 19. 28 ° C הוא הטמפרטורה הנפוצה ביותר לגידול דג הזברה וטמפרטורה סטנדרטית על מנת להבטיח התפתחות דג הזברה נורמלית 23. באופן מפתיע, האירועים המרכזיים פתוגניים שיובילו לshigellosis בבני אדם (כלומר, מוות של תאי מקרופאג, פלישה וכפל בתוך תאי אפיתל, התפשטות תא אל התא, ההרס דלקתי של האפיתל המארח) הם בתמונות בנאמנות במודל דג הזברה של זיהום Shigella 19. גני autophagy ושלד תא בכל מקום באים לידי ביטוי ויש מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות. מחקרי עכבר הראו נוקאאוט זה של autophagy החיוני 26 או septin גנים 5 הם קטלניים עובריים, וסביר להניח שחלק מהגנים הללו יהיה גם חיוני להתפתחות דג הזברה (אם כי בעיה זו עשויה להיות מופחתת על ידי העובדה שיש לי דג הזברה מרובהגני paralogous 33). אם כן, קיימות מספר חלופות כדי להתגבר על בעיה זו, כולל (i) השימוש בחומרים כימי תרופתיים לווסת autophagy ושלד התא, (ii) ניתן טיטרציה למטה morpholinos, (iii) בנוקאאוט של גנים יכול להיות מיועד לרק תא מסוים סוגים, ו / או (iv) גני המעורבים בהכרת autophagic שאינם חיוניים להתפתחות של בעלי חיים (לדוגמא., p62) עשוי להיות ממוקד. בעוד דג הזברה היא מערכת מודל אידיאלית לחקור autophagy ושלד התא במהלך זיהום Shigella, כלים מולקולריים כרגע חסרים. השדה צריך ליצור כלים חדשים וביטוי ספציפי תא כונן של חלבוני עניין. להפיל ביטוי של גני autophagy / שלד תא, רצפי morpholino חדשים נדרשים, ושיטות חדשניות להנדסת הגנום (למשל, Talen, CRISPR / Cas9) יכול לשמש גם. בינתיים, מספר כלים שנוצרו בעבר למחקרים בבני אדם או בעכברייתכן באותה מידה לעבוד עבור דג הזברה. החיידקים תאיים ס flexneri התפתח כאורגניזם מודל יוצא דופן כדי לטפל בבעיות מרכזיות בביולוגיה, לרבות היכולת של חיידקים כדי להיות מוכרת על ידי 1,2 המערכת החיסונית. התא המארח מעסיק septins להגביל את תנועתיות של ס &#39; flexneri ולמקד אותם לautophagy, מרכיב קריטי של חסינות אוטונומית תא 7,8. מקרים אלה מצביעים על מסגרת מולקולרית חדשה ללמוד autophagy ויכולתה כדי לבזות חיידקי cytosolic. נושא עיקרי הוא עכשיו לפענח באופן מלא את האירועים מולקולריים ותאיים הבסיסיים, וכדי לאמת את האירועים הללו ניתחו במבחנה במהלך זיהום חיידקי in vivo תוך שימוש במודלים של בעלי חיים רלוונטיים. לשם כך, דג הזברה כבר נקבע כמארח חדש בעל ערך לניתוח של ס &#39; זיהום flexneri 19. יחסי גומלין בין חיידקים ותאי מארח ניתן הדמיה ברזולוציה גבוהה, ומודל דג הזברה צריך להוכיח שימושי להבנת הביולוגיה של התא של זיהום Shigella in vivo. זחלי דג הזברה יכולים לשמש כדי לחקור את תפקידו של autophagy חיידקים בהגנת מארחת, והעבודה הוכיחה כי שההפרעות של autophagy יכולות להשפיע לרעה על הישרדות מארח בתגובה לזיהום Shigella 19. התצפיות שנוצרו ממחקר של Shigella, septin כליאה וautophagy במבחנה תוך שימוש בתאים בתרבית הרקמה וin vivo באמצעות זחלי דג הזברה עשויה לספק התקדמות יסודית בהבנת הגנת מארחת. הם גם יכולים להציע את הפיתוח של אסטרטגיות חדשות שנועדו להילחם במחלות זיהומיות. מטרה קריטית של דו&quot;ח זה היא הגיוני של האירועים המולקולריים ותאיים ניתחו במבחנה (כלומר, autophagy, זנבות אקטין, septin כליאה) במהלך זיהום חיידקי in vivo בהקשר של אף אוזן גרוןהאורגניזם זעם, תוך שימוש בזחלי דג הזברה. אם לא מכיר את ביולוגיה וטיפול דג הזברה, אחד עשוי להתייחס בפרוטוקולי עומק לגידול דג הזברה נכון 23 ובניתוח vivo של זיהום דג הזברה 19,35.

flexneri Shigella, חיידק enteropathogenic פולשנית גראם שלילי, יכול לברוח מphagosomes לcytosol, ופלמר cytoskeleton אקטין המארח להתחמק תגובות חיסוניות cytosolic ולקדם תנועת התוך ובין תאית 1,2. למרות ההבנה של תנועתיות מבוססות אקטין במבחנה 3,4, המנגנונים המגבילים את הפצת חיידקי in vivo לא הוגדרו באופן מלא. הדבר זה הוא קריטי להבנה של חסינות מולדת והגנת מארחת מלאה יותר. Septins, משפחה שמורה ביותר של חלבונים בין metazoans, היא אדנוזין guanosine (GTP) -binding חלבונים שיותכו מתחמי הטרו oligomeric וליצור חוטים פולריים שמקשרים עם ממברנות תאים ו5,6 שלד התא. מחקר שנערך לאחרונה גילה כי תאי מארח נגועים יכולים למנוע תנועתיות המבוססת אקטין Shigella על ידי חיידקי מידור הממוקדים לautoph&quot;כלובי septin &#39;AGY בתוך, חושפים את המנגנון התאי הראשון שמנטרל תנועתיות המבוססת אקטין 7,8. שדה פתוח לרווחה של חקירה נמצא כיום ב&#39;ביולוגיה septin וזיהום &quot;. הרכבה Septin, הנגרמת על ידי מגוון רחב של גורמי מחלה (למשל, חיידקים ליסטריה 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, קנדידה אלביקנס 11), עשויה להתגלות כנושא מרכזי בהגנת מארחת 5,12. Autophagy, תהליך פירוק תאיים שמור ביותר, נתפס כמרכיב מרכזי של חסינות תאים אוטונומיים בגלל יכולתה לספק חיידקי cytosolic ל13,14 הליזוזום. עם זאת, התפקיד של autophagy חיידקי in vivo כדי להגביל או לקדם שכפול חיידקים נשאר גרוע הבין 15,16. דג הזברה (Danio rerio) התפתחה כמודל חוליות לחקר הזיהומים כי זה אופטי נגישבשלבי הזחל כאשר מערכת החיסון המולדת היא כבר פונקציונלית 17,18. מחקר שנערך לאחרונה אפיין את הרגישות של זחלי דג הזברה לס flexneri, הפרדיגמה לautophagy חיידקי 15, והשתמשה במודל זיהום -zebrafish Shigella ללמוד המניפולציה של autophagy לטיפול אנטיבקטריאלי in vivo 19. דוח זה מספק כלים ומבחנים ללמוד ס חדשים אינטראקציות flexneri עם autophagy ושלד התא. בשלב ראשון, פרוטוקולים כדי לפקח על אינטראקציות autophagy-שלד התא מתוארים באמצעות זיהום Shigella של שורת תאי אפיתל האנושית הלה. כדי להעריך את התפקיד של אינטראקציות autophagy-שלד תא בתהליך זיהום Shigella במבחנה, שיטות לתמרן autophagy ורכיבי שלד תא (באמצעות siRNA או חומרים כימיים תרופתיים) מסופקים. עבודה חדשה הראתה כי על ידי השימוש בo זיהום Shigellaזחלי דג הזברה f, ניתן ליישם מבחני דומים ללמוד הביולוגיה של התא של זיהום בגוף חי. פרוטוקולים להכין ולהדביק זחלי דג הזברה הם מפורטים, ולהעריך את תגובת המארח לזיהום Shigella in vivo, פרוטוקולים כדי לקבוע הישרדות מארח וניטל חיידקים של זחלים נגועים מסופקות. שיטות לניטור הגיוס של סמני septin וautophagy לShigella (באמצעות זחלי דג הזברה קבועים או חיים) ושיטות על מנת לבחון את תפקידם של תהליכים אלה in vivo [באמצעות oligonucleotides morpholino (הזריק ב1-4 עובר שלב תא) או חומרים כימיים תרופתיים ( הוספתי ישירות למים באמבטית דג הזברה)] הם דנו גם. תכנית זו של העבודה צפויה לספק תובנות לתוך המנגנונים הנדרשים לשליטה בזיהום על ידי תגובות מארחות cytosolic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="771">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:240px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1793&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass microcapillars&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coarse manual manipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;">M-152</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6762</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Dumont #5 fine tweezers</td>
			<td style="width:240px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forchlorfeneuron&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">JetPEI transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">101-01N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L5288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">NB100-2220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V2111</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MatTek glass bottom dish</td>
			<td style="width:240px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM plus L-alanyl-L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">41090028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MEM non-essential amino acids solution</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller device&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co., Novato,</td>
			<td>P-87&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1404</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Phenol red solution</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693116001</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:412px;">p62/SQSTM1 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Cliniscience</td>
			<td style="width:119px;">PM045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8781</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11360039</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12252-011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield hard set mounting medium containing DAPI&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1500&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions

flexneri Shigella הוא הפתוגן תאיים שיכול לברוח מphagosomes להגיע cytosol, ופלמר המארח יקטין שלד תא כדי לקדם את תנועתיות וההפצה שלה. עבודה חדשה הראתה כי חלבונים מעורבים בתנועתיות המבוסס על אקטין גם צמודים לautophagy, תהליך פירוק תאיים חיוני לחסינות אוטונומית תא. באופן מפתיע, תאי מארח עלולים למנוע תנועתיות המבוסס על תקטין של ס &#39; flexneri ידי מידור חיידקים &quot;כלובי septin &#39;בתוך ולמקד אותם לautophagy. תצפיות אלו מצביעות על כך שהבנה של septins מלאה יותר, משפחה של חלבוני קושרי GTP סיביים, תספק תובנות חדשות על התהליך של autophagy. דו&quot;ח זה מתאר פרוטוקולים כדי לפקח על אינטראקציות autophagy-שלד תא הנגרמות על ידי ס &#39; flexneri במבחנה תוך שימוש בתאים בתרבית רקמה וin vivo באמצעות זחלי דג הזברה. פרוטוקולים אלה מאפשרים חקירה של mechanis תאיתms ששולט הפצת חיידקים ברמת האורגניזם המולקולרית, תאית, וכל.

עם הזיהום של תאים בתרבית רקמה במבחנה, ס &#39; flexneri יכול לברוח מphagosome ולפלוש cytosol. בcytosol, תאי מארח יכולים למנוע את תנועתיות המבוסס על אקטין של Shigella ידי מידור חיידקים בתוך כלובי septin (איור 1 א). חיידקים וממולכד על ידי כלובי septin יכולים גם להיות מתויגים על ידי p62 סמני autophagy (איור 1) וLC3 (איור 1 ג). תצפיות אלו מדגישות מנגנון חדשני של הגנת מארחת המגביל את ההפצה של גורמי מחלה פולשנית, וגם לחשוף את הקישורים חדשים בין autophagy ושלד התא. באופן מפתיע, הדלדול של סמני autophagy מפחית באופן משמעותי כליאת septin של חיידקים (איור 2 א), והעבודה הראתה גם כי הדלדול של כליאת septin מפחית גיוס של סמני autophagy 8 באופן משמעותי. כך, לפחות במקרה של Shigella, septin הרכבה כלוב וformatio autophagosomeניתן לצפות n כתהליכים תלויים זה בזה. דרישות סלולריות אחרות למידור של Shigella ידי כלובי septin כוללות פילמור אקטין ופעילות actomyosin (איור 2). אין מודל טבעי עכבר של shigellosis, וחקירה של הפתוגנזה Shigella, ביולוגיה septin וautophagy חיידקי in vivo יכול להפיק תועלת ממודל חדש של בעלי חיים של זיהום, זחלי דג הזברה 19. אפשר להדביק זחלי דג הזברה על ידי הזרקת חיידקים באתרים אנטומיים שונים כגון זריקות זנב תוך ורידי לניסויי הישרדות, וזריקות שריר זנב למיקרוסקופיה in vivo (איור 3 א). בהתאם למינון, ס &#39; flexneri מוזרק בזחלי דג הזברה יכולה גם להיות מסומנת בתוך לאחר זיהום 48 שעות, או עלול לגרום לזיהום מתקדם וסופו של דבר קטלני (3B מספרים - 3D). fa ארסיות Shigellactors באים לידי ביטוי ב28 ° C, טמפרטורת הצמיחה האופטימלית של דג הזברה, וזיהום דג הזברה על ידי Shigella תלוי אך ורק על מערכת ההפרשה מהסוג III שלה (T3SS) 19, הקובע ארסיות חיונית במחלות של בני אדם. יחד צילום, תצפיות אלה מצביעים על כך שזחל דג הזברה מייצג מארח חדש בעל ערך לניתוח vivo של זיהום Shigella. הנגישות האופטית של זחלי דג הזברה מאפשרת הדמיה של כליאת septin in vivo (איור 4 א), הישג ​​שמעולם לא לפני הושג תוך שימוש במודלי מארח יונקים. כדי להשלים את ההוכחה לכך שכלובי septin ללכוד את החיידקים ממוקדים לautophagy in vivo, אחד יכול להדביק את זחלי דג הזברה מהונדסים להביע GFP-Lc3 ולבחון גיוס סמן autophagy לShigella (איור 4). לניתוח ultrastrucutral של autophagosomes Shigella in vivo, אלמיקרוסקופיה ectron יכולה לשמש כדי להראות את תפיסת cytosolic של חיידקים על ידי וקואולות קרום כפולה 19 בבירור. Autophagy נתפס כמרכיב מרכזי של חסינות תאים אוטונומיים ומנגנון הגנה חיוני מפני חיידקי intracytosolic 14-16. לאפיין פונקצית autophagy in vivo, ניתן להשתמש בם זחלי דג הזברה שטופל morpholino p62. בניגוד למכונות autophagy הליבה [לדוגמא., 36 חלבוני autophagy קשורים (ATGs) 26], p62 הוא לא חיוני להתפתחות של בעלי החוליות 27 וזחלים וכך דג הזברה יכול להתפתח בצורה תקינה לפני ההדבקה. באופן מפתיע, זחלים מדולדלים p62 מחוסן עם ס &#39; תוצאת flexneri בסיכון מוגבר לתמותה באופן משמעותי וניטל חיידקים מוגבר 19. בהסכם עם עבודה במבחנה מראה שהרכבת כלוב septin הוא תלות הדדית עם היווצרות autophagosome 7,8, גיוס septin לShigella מצטמצם באופן ברור בזחלים מדולדלים p62 ( <strאונג&gt; 4C איור). נתונים אלה מראים כי הישרדות דג הזברה תלויה בautophagy בתיווך p62 לשלוט זיהום חיידקים תוך תאיים. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 כלוב septin במבחנה. () תאי הלה היו נגועים בס flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים לSEPT9 וphalloidin, וצלם על ידי microcopy confocal. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר תאי הלה (B). נדבקו עם ס &#39; flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים לp62 וSEPT2, וצלם על ידי מיקרוסקופ אור הניאון. סרגל קנה מידה, 1 תאים (C) הלה מיקרומטר. היו transfected עם GFP-ATG8 / LC3, נגוע בס flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים לSEPT2, וצלמתי על ידי מיל אור הניאוןcroscopy. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר. נתונים אלה שונים מMostowy et 7 אל. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> .2 דרישות איור נייד להיווצרות כלוב -septin Shigella. () טופלו תאי הלה עם שליטה (CTRL), p62, ATG5, ATG6 או ATG7 siRNA. lysates כל התא של תאים שטופלו-siRNA היה immunoblotted לGAPDH, p62, ATG5, ATG6, או ATG7 להראות את היעילות של דלדול siRNA (למעלה). תאים שטופל siRNA היו נגועים בס flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, ומתויג למיקרוסקופיה כמותית. גרפים (תחתון) מייצגים את ממוצע% ± SEM של Shigella בתוך כלובי SEPT2 מn ≥3 ניסויים לטיפול. (B) תאי הלה היו נגועים בס flexneri, שטופל בDMSO, cytochalasin D (CytD), B latrunculin (LatB), nocodazole (Noco), או blebbistatin (בועה) ולאחר 4 שעות 40 דקות היו קבועות ומתויגות למיקרוסקופיה כמותית. גרפים מייצגים את ממוצע% ± SEM של Shigella בתוך כלובי SEPT2 משני ניסויים בלתי תלויים לטיפול. נתונים אלה שונים מMostowy et 7 אל. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3 מודל דג הזברה של זיהום Shigella. תמונות () כדי להמחיש את הכיוון של זחל דג הזברה תחת סטראו. (לוח שמאלי) זחלי 72 הודעה hr הפריה דג הזברה הוצבו רוחבי בצלחת ההזרקה עם צד הגב שלהם מול מחט הזריקה. זיהום (פנל התיכון) בזרם דם בוצע על ידי injecting החיידקים (פתרון אדום) בוריד הזנב, אחורי לפתיחה ואברי המין. זיהום (פנל מימין) בשריר הזנב בוצע על ידי הזרקת החיידקים (פתרון אדום) מעל somite. (B) עקומות הישרדות של זחלים שלאחר הפריה 72 שעה מוזרק במינונים שונים של ס &#39; flexneri וטופחו על 28 מעלות צלזיוס במשך לאחר זיהום 48 שעות. הבידוד היעיל סווג כנמוך (&lt;10 3 CFU, חוגים פתוחים), בינוני (~ 4 x 10 3 CFU, משולשים פתוחים) או (~ 10 4 CFU, ריבועים פתוחים) הגבוה. אומר% ± SEM (פסים אופקיים) מn ≥3 ניסויים בכיתה הבידוד. (C) ספירת חיידקים חיים בhomogenates מזחלים בודדים בזמנים שונים לאחר הזיהום שנמדד על ידי ציפוי על ק&quot;ג הערה, רק זחלים ששרדו את הזיהום כלולים בניתוח ספירה. הממוצע ± SEM (פסים אופקיים) מוצג גם. (ד) הפצה של GFP- Shigella שנקבע על ידיהדמיה בשידור חי באמצעות סטראו ניאון בזמנים שונים לאחר הזיהום באמצעות מדיום, או הבידוד נמוך, במינון גבוה (זנב זריקות תוך ורידי). כיסוי של תמונת שידור (אפורה) וקרינת GFP (ירוק) (ב) -. (ד &#39;) נתונים אלה שונים מMostowy et al 19. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4 הביולוגיה של התא של זיהום Shigella in vivo. זחלי דג הזברה () היו נגוע בשריר הזנב עם GFP- Shigella (מינון נמוך) ל24 שעות, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים נגד SEPT7 (אדום) ולGFP (ירוק ), וצלם על ידי מיקרוסקופ confocal. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. זחלי דג הזברה (B) GFP-Lc3 היו נגועים בmCherry- Shigella (מינון בינוני) ל4 שעות, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים נגד mCherry (אדום) ולGFP (ירוק), וצלם על ידי מיקרוסקופ confocal. . סרגל קנה מידה, 1.5 מיקרומטר (C) זחלי דג הזברה שטופלו באו שליטה (CTRL; תמונה משמאל) או p62 (תמונה מימין) morpholinos היה נגוע בGFP- Shigella ל4 שעה (מינון בינוני), קבוע, שכותרתו עם נוגדנים נגד SEPT7 ( אדום) ולGFP (ירוק), וצלם על ידי מיקרוסקופ confocal. חיצים להדגיש כמה דוגמאות של Shigella וממולכד בכלובי septin (CTRL) או לא (p62 מדולדל) לאחר זיהום 4 שעות. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. נתונים אלה שונים מMostowy et al 19.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

כדי לנטרל את הפצת הפתוגן, תאי מארח לארגן מחדש את שלד התא שלהם למדר חיידקים ולגרום autophagy. זיהום Shigella שימוש של תאי רקמת תרבות, מארח וגורמי הפתוגן שבבסיס תהליך זה זוהה ואופיין. תוך שימוש במודלי דג הזברה של זיהום Shigella, התפקיד של מולקולות ומנגנונים גילו נחקרים in vivo.

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

הדמיה Ca2 + תגובות במהלך זיהום שיגלה תאי אפיתל

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...