Name: use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

עבודה במעבדה SM נתמכת על ידי בקריירה מחקר פיתוח [WT097411MA] מלגת Wellcome Trust.

<ol>
	<li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system.">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li><li>Phalipon, A., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella's+ways+of+manipulating+the+host+intestinal+innate+and+adaptive+immune+system:+a+tool+box+for+survival.">Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival.</a> Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).</li><li>Welch, M. D., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3-mediated+actin-based+motility:+A+tail+of+pathogen+abuse.">Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse.</a> Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).</li><li>Haglund, C. M., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogens+and+polymers:+microbe-host+interactions+illuminate+the+cytoskeleton.">Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins:+the+fourth+component+of+the+cytoskeleton.">Septins: the fourth component of the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).</li><li>Saarikangas, J., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+functions+of+septins+in+metazoans.">The emerging functions of septins in metazoans.</a> EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapment+of+intracytosolic+bacteria+by+septin+cage-like+structures.">Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures.</a> Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62+and+NDP52+proteins+target+intracytosolic+Shigella+and+Listeria+to+different+autophagy+pathways.">p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways.</a> J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells.">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria.">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li><li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans.">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection.">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469, 323-335 (2011).</li><li>Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-defense:+how+cell-autonomous+immunity+protects+against+pathogens.">Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens.</a> Science. 340, 701-706 (2013).</li><li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+bacterial+clearance:+a+not+so+clear+picture.">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autophagy:+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication.">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li><li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish.">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy.">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588 (2013).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+permeabilization+of+cells+and+tissues.">Fixation and permeabilization of cells and tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2008).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8, 445-544 (2012).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> The Zebrafish Book. , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).</li><li>He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+autophagic+activity+in+transgenic+GFP-Lc3+and+GFP-Gabarap+zebrafish+embryos.">Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos.</a> Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).</li><li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+renovation+of+cells+and+tissues.">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li><li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+levels+of+p62+control+cytoplasmic+inclusion+body+formation+in+autophagy-deficient+mice.">Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice.</a> Cell. 131, 1149-1163 (2007).</li><li>Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction.">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).</li><li>Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 2010-2010 (2011).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (9), (2009).</li><li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+autophagy+in+zebrafish.">Analyzing autophagy in zebrafish.</a> Autophagy. 6, 642-644 (2010).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).</li><li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity.">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאשר ניטור autophagy ושלד התא במבחנה תוך שימוש בתאים בתרבית רקמה, יכולים להיות מיושמים בפרוטוקולים מפורטים בסעיפי 1 ו -2 למגוון רחב של סוגי תרבית רקמת תא. יתר על כן, כדי לעקוב autophagy (למשל, ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) ושלד תא (לדוגמא., זנבות אקטין, כלובי septin) דינמיקה בזמן אמת במהלך זיהום Shigella באמצעות הדמיה חיה, תאים בתרבית רקמה ניתן transfected זמני באמצעות GFP-, מבני RFP- או CFP מתויג כמו בעבר תיארו 7,8. כדי להגדיל את אחוז התאים הנגועים בShigella (כלומר, בדרך כלל רצוי לניתוח בזמן אמת בהתחשב בכך שShigella יכול לפלוש 5-30% מתאי הלה ב100:. 1 משרד הפנים), להוסיף ישירות 400 μl של Shigella (OD 600 = 0.3 -0.6) לתאים ב2 מ&quot;ל MEM (רעב לסרום) ולחכות לפחות 1.5 לאחר זיהום שעה לכניסת חיידקים מספיק, לברוח מphagosome, שכפול, auהכרת tophagy והקמה כלובי septin. לחלופין, ניתן להשתמש במתח Shigella M90T אפאי, המבטא את adhesin AfaE ויש לי את יכולות פלישה הרבה יותר גבוהות בתאי האפיתל בהשוואה לזן M90T 28. ראוי לציין, מתח M90T אפאי טרם נבדק in vivo באמצעות דג הזברה. צלחות של מושבות Shigella יכולות להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים ומשמשות לכמה ניסויים. עם זאת, לאורך זמן, מושבות של Shigella שאיבדו את הפלסמיד הארסיות גם יכול לספוג אדום קונגו ונראה שיש לי שמר פלסמיד ארסיותם. מסיבה זו אנו ממליצים להשתמש במניות חיידקים טריות במידת האפשר. כאשר ניטור הביולוגיה של התא של זיהום in vivo, פרוטוקולים מתוארים בסעיפי 3 ו דג הזברה שורת 4 שימוש wildtype AB. כדי לפקח על אינטראקציות -leukocyte Shigella, ניתן להשתמש בקווים דג הזברה מהונדסים, למשל, MPX: GFP או, liz: DsRed לחזותייםize נויטרופילים 19,29,30 או MPEG1: mCherry לדמיין מקרופאגים 19,31. כדי להמחיש autophagy in vivo, הקו המהונדס דג הזברה GFP-Lc3 19,24 יכול לשמש כמפורט בסעיף 3.8. להפריע autophagy in vivo, מינון oligonucleotide morpholino היעיל יש להעריך באופן ניסיוני המבוסס על יעילותה לעכב שחבור תמליל או תרגום חלבון. מומלץ לבצע ניסוי טיטרציה וכדי לאשר את הדלדול על ידי RT-PCR (לoligonucleotide morpholino אחוי) או על ידי SDS-PAGE (לoligonucleotide morpholino translational) 32. בידוד RNA מעוברים או זחלי דג הזברה יכול להתבצע באמצעות מיצוי thiocyanate-פנול, כלורופורם guanidinium. כדי לחלץ חלבון מזחלי דג הזברה (8 עד 15 זחלים / צינור), מכאני homogenize באמצעות העלי ב200 מאגר תמוגה μl (1 מ &#39;טריס, 5 M NaCl, 0.5 M EDTA, 0.01% condensat אתילן אוקסיד octylphenolדואר, ומעכבי פרוטאז). צנטריפוגה צינורות ב19,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולהעביר את supernatant לצינור חדש. הוסף חוצץ Laemmli ולחמם את המדגם על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ניתן לאחסן lysates ב -80 מעלות צלזיוס עד צורך, ויכול להיות מוערך על ידי מערבי סופג כאמור בסעיף 2.3. דג הזברה הוא מודל מצוין לin vivo יישום תרופה. ניתוח באמצעות oligonucleotides morpholino יכול להיות כהשלמה עם סמים הוקמו כדי לתפעל autophagy (למשל, rapamycin וbafilomycin). זחלים נגוע ו / או נגועים יכולים להיות מטופלים עם rapamycin (1.5 מיקרומטר) או bafilomycin (80 ננומטר) בדילול מלא בE2 ושטף autophagic יכול להיות מוערך על ידי מערבי סופג כפי שמתואר ב25,33. התוצאה של המניפולציה autophagy על התוצאה של הזיהום וההישרדות של הזחלים הנגועים ניתן להעריך כאמור בסעיף 3.5. בנוסף ללימוד תא מארחגורמים, במבחנה ובפרוטוקולי vivo יכולים להיות מיושמים על מנת להעריך גורמי חיידקים הנדרשים להכרה autophagy, באמצעות זני מוטציה חיידקים שמוכרים באופן דיפרנציאלי על ידי autophagy, למשל., Shigella ΔicsA (חלבון Shigella ICSA מגייס N-WASP ולאחר מכן Arp2 / 3 לזנב אקטין והיווצרות כלוב septin; בהעדרו לא יכול להיות זנבות אקטין, ללא כלובים septin) וShigellaΔicsB (Shigella ימנע את תגובת autophagic באמצעות חלבון חיידקי מפעיל IcsB, המונע את הגיוס של מכונות autophagy לICSA; בהיעדרו לא יכול להיות יותר כלובי septin, יותר autophagy) 7,8. Shigella הוא לא הפתוגן טבעי של דג הזברה וגדל בצורה אופטימלית על 37 C °. עם זאת, עבודה הראתה כי גורמים ארסי הנדרשים לפלישת Shigella, לברוח מvacuole phagocytic ושכפול בCYtosol יכול לבוא לידי ביטוי והם פונקציונליים בזחלי דג הזברה ב28 ° C 19. 28 ° C הוא הטמפרטורה הנפוצה ביותר לגידול דג הזברה וטמפרטורה סטנדרטית על מנת להבטיח התפתחות דג הזברה נורמלית 23. באופן מפתיע, האירועים המרכזיים פתוגניים שיובילו לshigellosis בבני אדם (כלומר, מוות של תאי מקרופאג, פלישה וכפל בתוך תאי אפיתל, התפשטות תא אל התא, ההרס דלקתי של האפיתל המארח) הם בתמונות בנאמנות במודל דג הזברה של זיהום Shigella 19. גני autophagy ושלד תא בכל מקום באים לידי ביטוי ויש מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות. מחקרי עכבר הראו נוקאאוט זה של autophagy החיוני 26 או septin גנים 5 הם קטלניים עובריים, וסביר להניח שחלק מהגנים הללו יהיה גם חיוני להתפתחות דג הזברה (אם כי בעיה זו עשויה להיות מופחתת על ידי העובדה שיש לי דג הזברה מרובהגני paralogous 33). אם כן, קיימות מספר חלופות כדי להתגבר על בעיה זו, כולל (i) השימוש בחומרים כימי תרופתיים לווסת autophagy ושלד התא, (ii) ניתן טיטרציה למטה morpholinos, (iii) בנוקאאוט של גנים יכול להיות מיועד לרק תא מסוים סוגים, ו / או (iv) גני המעורבים בהכרת autophagic שאינם חיוניים להתפתחות של בעלי חיים (לדוגמא., p62) עשוי להיות ממוקד. בעוד דג הזברה היא מערכת מודל אידיאלית לחקור autophagy ושלד התא במהלך זיהום Shigella, כלים מולקולריים כרגע חסרים. השדה צריך ליצור כלים חדשים וביטוי ספציפי תא כונן של חלבוני עניין. להפיל ביטוי של גני autophagy / שלד תא, רצפי morpholino חדשים נדרשים, ושיטות חדשניות להנדסת הגנום (למשל, Talen, CRISPR / Cas9) יכול לשמש גם. בינתיים, מספר כלים שנוצרו בעבר למחקרים בבני אדם או בעכברייתכן באותה מידה לעבוד עבור דג הזברה. החיידקים תאיים ס flexneri התפתח כאורגניזם מודל יוצא דופן כדי לטפל בבעיות מרכזיות בביולוגיה, לרבות היכולת של חיידקים כדי להיות מוכרת על ידי 1,2 המערכת החיסונית. התא המארח מעסיק septins להגביל את תנועתיות של ס &#39; flexneri ולמקד אותם לautophagy, מרכיב קריטי של חסינות אוטונומית תא 7,8. מקרים אלה מצביעים על מסגרת מולקולרית חדשה ללמוד autophagy ויכולתה כדי לבזות חיידקי cytosolic. נושא עיקרי הוא עכשיו לפענח באופן מלא את האירועים מולקולריים ותאיים הבסיסיים, וכדי לאמת את האירועים הללו ניתחו במבחנה במהלך זיהום חיידקי in vivo תוך שימוש במודלים של בעלי חיים רלוונטיים. לשם כך, דג הזברה כבר נקבע כמארח חדש בעל ערך לניתוח של ס &#39; זיהום flexneri 19. יחסי גומלין בין חיידקים ותאי מארח ניתן הדמיה ברזולוציה גבוהה, ומודל דג הזברה צריך להוכיח שימושי להבנת הביולוגיה של התא של זיהום Shigella in vivo. זחלי דג הזברה יכולים לשמש כדי לחקור את תפקידו של autophagy חיידקים בהגנת מארחת, והעבודה הוכיחה כי שההפרעות של autophagy יכולות להשפיע לרעה על הישרדות מארח בתגובה לזיהום Shigella 19. התצפיות שנוצרו ממחקר של Shigella, septin כליאה וautophagy במבחנה תוך שימוש בתאים בתרבית הרקמה וin vivo באמצעות זחלי דג הזברה עשויה לספק התקדמות יסודית בהבנת הגנת מארחת. הם גם יכולים להציע את הפיתוח של אסטרטגיות חדשות שנועדו להילחם במחלות זיהומיות. מטרה קריטית של דו&quot;ח זה היא הגיוני של האירועים המולקולריים ותאיים ניתחו במבחנה (כלומר, autophagy, זנבות אקטין, septin כליאה) במהלך זיהום חיידקי in vivo בהקשר של אף אוזן גרוןהאורגניזם זעם, תוך שימוש בזחלי דג הזברה. אם לא מכיר את ביולוגיה וטיפול דג הזברה, אחד עשוי להתייחס בפרוטוקולי עומק לגידול דג הזברה נכון 23 ובניתוח vivo של זיהום דג הזברה 19,35.

flexneri Shigella, חיידק enteropathogenic פולשנית גראם שלילי, יכול לברוח מphagosomes לcytosol, ופלמר cytoskeleton אקטין המארח להתחמק תגובות חיסוניות cytosolic ולקדם תנועת התוך ובין תאית 1,2. למרות ההבנה של תנועתיות מבוססות אקטין במבחנה 3,4, המנגנונים המגבילים את הפצת חיידקי in vivo לא הוגדרו באופן מלא. הדבר זה הוא קריטי להבנה של חסינות מולדת והגנת מארחת מלאה יותר. Septins, משפחה שמורה ביותר של חלבונים בין metazoans, היא אדנוזין guanosine (GTP) -binding חלבונים שיותכו מתחמי הטרו oligomeric וליצור חוטים פולריים שמקשרים עם ממברנות תאים ו5,6 שלד התא. מחקר שנערך לאחרונה גילה כי תאי מארח נגועים יכולים למנוע תנועתיות המבוססת אקטין Shigella על ידי חיידקי מידור הממוקדים לautoph&quot;כלובי septin &#39;AGY בתוך, חושפים את המנגנון התאי הראשון שמנטרל תנועתיות המבוססת אקטין 7,8. שדה פתוח לרווחה של חקירה נמצא כיום ב&#39;ביולוגיה septin וזיהום &quot;. הרכבה Septin, הנגרמת על ידי מגוון רחב של גורמי מחלה (למשל, חיידקים ליסטריה 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, קנדידה אלביקנס 11), עשויה להתגלות כנושא מרכזי בהגנת מארחת 5,12. Autophagy, תהליך פירוק תאיים שמור ביותר, נתפס כמרכיב מרכזי של חסינות תאים אוטונומיים בגלל יכולתה לספק חיידקי cytosolic ל13,14 הליזוזום. עם זאת, התפקיד של autophagy חיידקי in vivo כדי להגביל או לקדם שכפול חיידקים נשאר גרוע הבין 15,16. דג הזברה (Danio rerio) התפתחה כמודל חוליות לחקר הזיהומים כי זה אופטי נגישבשלבי הזחל כאשר מערכת החיסון המולדת היא כבר פונקציונלית 17,18. מחקר שנערך לאחרונה אפיין את הרגישות של זחלי דג הזברה לס flexneri, הפרדיגמה לautophagy חיידקי 15, והשתמשה במודל זיהום -zebrafish Shigella ללמוד המניפולציה של autophagy לטיפול אנטיבקטריאלי in vivo 19. דוח זה מספק כלים ומבחנים ללמוד ס חדשים אינטראקציות flexneri עם autophagy ושלד התא. בשלב ראשון, פרוטוקולים כדי לפקח על אינטראקציות autophagy-שלד התא מתוארים באמצעות זיהום Shigella של שורת תאי אפיתל האנושית הלה. כדי להעריך את התפקיד של אינטראקציות autophagy-שלד תא בתהליך זיהום Shigella במבחנה, שיטות לתמרן autophagy ורכיבי שלד תא (באמצעות siRNA או חומרים כימיים תרופתיים) מסופקים. עבודה חדשה הראתה כי על ידי השימוש בo זיהום Shigellaזחלי דג הזברה f, ניתן ליישם מבחני דומים ללמוד הביולוגיה של התא של זיהום בגוף חי. פרוטוקולים להכין ולהדביק זחלי דג הזברה הם מפורטים, ולהעריך את תגובת המארח לזיהום Shigella in vivo, פרוטוקולים כדי לקבוע הישרדות מארח וניטל חיידקים של זחלים נגועים מסופקות. שיטות לניטור הגיוס של סמני septin וautophagy לShigella (באמצעות זחלי דג הזברה קבועים או חיים) ושיטות על מנת לבחון את תפקידם של תהליכים אלה in vivo [באמצעות oligonucleotides morpholino (הזריק ב1-4 עובר שלב תא) או חומרים כימיים תרופתיים ( הוספתי ישירות למים באמבטית דג הזברה)] הם דנו גם. תכנית זו של העבודה צפויה לספק תובנות לתוך המנגנונים הנדרשים לשליטה בזיהום על ידי תגובות מארחות cytosolic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="771">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:240px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1793&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass microcapillars&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coarse manual manipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;">M-152</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6762</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Dumont #5 fine tweezers</td>
			<td style="width:240px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forchlorfeneuron&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">JetPEI transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">101-01N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L5288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">NB100-2220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V2111</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MatTek glass bottom dish</td>
			<td style="width:240px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM plus L-alanyl-L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">41090028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MEM non-essential amino acids solution</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller device&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co., Novato,</td>
			<td>P-87&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1404</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Phenol red solution</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693116001</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:412px;">p62/SQSTM1 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Cliniscience</td>
			<td style="width:119px;">PM045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8781</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11360039</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12252-011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield hard set mounting medium containing DAPI&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1500&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions

flexneri Shigella הוא הפתוגן תאיים שיכול לברוח מphagosomes להגיע cytosol, ופלמר המארח יקטין שלד תא כדי לקדם את תנועתיות וההפצה שלה. עבודה חדשה הראתה כי חלבונים מעורבים בתנועתיות המבוסס על אקטין גם צמודים לautophagy, תהליך פירוק תאיים חיוני לחסינות אוטונומית תא. באופן מפתיע, תאי מארח עלולים למנוע תנועתיות המבוסס על תקטין של ס &#39; flexneri ידי מידור חיידקים &quot;כלובי septin &#39;בתוך ולמקד אותם לautophagy. תצפיות אלו מצביעות על כך שהבנה של septins מלאה יותר, משפחה של חלבוני קושרי GTP סיביים, תספק תובנות חדשות על התהליך של autophagy. דו&quot;ח זה מתאר פרוטוקולים כדי לפקח על אינטראקציות autophagy-שלד תא הנגרמות על ידי ס &#39; flexneri במבחנה תוך שימוש בתאים בתרבית רקמה וin vivo באמצעות זחלי דג הזברה. פרוטוקולים אלה מאפשרים חקירה של mechanis תאיתms ששולט הפצת חיידקים ברמת האורגניזם המולקולרית, תאית, וכל.

עם הזיהום של תאים בתרבית רקמה במבחנה, ס &#39; flexneri יכול לברוח מphagosome ולפלוש cytosol. בcytosol, תאי מארח יכולים למנוע את תנועתיות המבוסס על אקטין של Shigella ידי מידור חיידקים בתוך כלובי septin (איור 1 א). חיידקים וממולכד על ידי כלובי septin יכולים גם להיות מתויגים על ידי p62 סמני autophagy (איור 1) וLC3 (איור 1 ג). תצפיות אלו מדגישות מנגנון חדשני של הגנת מארחת המגביל את ההפצה של גורמי מחלה פולשנית, וגם לחשוף את הקישורים חדשים בין autophagy ושלד התא. באופן מפתיע, הדלדול של סמני autophagy מפחית באופן משמעותי כליאת septin של חיידקים (איור 2 א), והעבודה הראתה גם כי הדלדול של כליאת septin מפחית גיוס של סמני autophagy 8 באופן משמעותי. כך, לפחות במקרה של Shigella, septin הרכבה כלוב וformatio autophagosomeניתן לצפות n כתהליכים תלויים זה בזה. דרישות סלולריות אחרות למידור של Shigella ידי כלובי septin כוללות פילמור אקטין ופעילות actomyosin (איור 2). אין מודל טבעי עכבר של shigellosis, וחקירה של הפתוגנזה Shigella, ביולוגיה septin וautophagy חיידקי in vivo יכול להפיק תועלת ממודל חדש של בעלי חיים של זיהום, זחלי דג הזברה 19. אפשר להדביק זחלי דג הזברה על ידי הזרקת חיידקים באתרים אנטומיים שונים כגון זריקות זנב תוך ורידי לניסויי הישרדות, וזריקות שריר זנב למיקרוסקופיה in vivo (איור 3 א). בהתאם למינון, ס &#39; flexneri מוזרק בזחלי דג הזברה יכולה גם להיות מסומנת בתוך לאחר זיהום 48 שעות, או עלול לגרום לזיהום מתקדם וסופו של דבר קטלני (3B מספרים - 3D). fa ארסיות Shigellactors באים לידי ביטוי ב28 ° C, טמפרטורת הצמיחה האופטימלית של דג הזברה, וזיהום דג הזברה על ידי Shigella תלוי אך ורק על מערכת ההפרשה מהסוג III שלה (T3SS) 19, הקובע ארסיות חיונית במחלות של בני אדם. יחד צילום, תצפיות אלה מצביעים על כך שזחל דג הזברה מייצג מארח חדש בעל ערך לניתוח vivo של זיהום Shigella. הנגישות האופטית של זחלי דג הזברה מאפשרת הדמיה של כליאת septin in vivo (איור 4 א), הישג ​​שמעולם לא לפני הושג תוך שימוש במודלי מארח יונקים. כדי להשלים את ההוכחה לכך שכלובי septin ללכוד את החיידקים ממוקדים לautophagy in vivo, אחד יכול להדביק את זחלי דג הזברה מהונדסים להביע GFP-Lc3 ולבחון גיוס סמן autophagy לShigella (איור 4). לניתוח ultrastrucutral של autophagosomes Shigella in vivo, אלמיקרוסקופיה ectron יכולה לשמש כדי להראות את תפיסת cytosolic של חיידקים על ידי וקואולות קרום כפולה 19 בבירור. Autophagy נתפס כמרכיב מרכזי של חסינות תאים אוטונומיים ומנגנון הגנה חיוני מפני חיידקי intracytosolic 14-16. לאפיין פונקצית autophagy in vivo, ניתן להשתמש בם זחלי דג הזברה שטופל morpholino p62. בניגוד למכונות autophagy הליבה [לדוגמא., 36 חלבוני autophagy קשורים (ATGs) 26], p62 הוא לא חיוני להתפתחות של בעלי החוליות 27 וזחלים וכך דג הזברה יכול להתפתח בצורה תקינה לפני ההדבקה. באופן מפתיע, זחלים מדולדלים p62 מחוסן עם ס &#39; תוצאת flexneri בסיכון מוגבר לתמותה באופן משמעותי וניטל חיידקים מוגבר 19. בהסכם עם עבודה במבחנה מראה שהרכבת כלוב septin הוא תלות הדדית עם היווצרות autophagosome 7,8, גיוס septin לShigella מצטמצם באופן ברור בזחלים מדולדלים p62 ( <strאונג&gt; 4C איור). נתונים אלה מראים כי הישרדות דג הזברה תלויה בautophagy בתיווך p62 לשלוט זיהום חיידקים תוך תאיים. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 כלוב septin במבחנה. () תאי הלה היו נגועים בס flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים לSEPT9 וphalloidin, וצלם על ידי microcopy confocal. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר תאי הלה (B). נדבקו עם ס &#39; flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים לp62 וSEPT2, וצלם על ידי מיקרוסקופ אור הניאון. סרגל קנה מידה, 1 תאים (C) הלה מיקרומטר. היו transfected עם GFP-ATG8 / LC3, נגוע בס flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים לSEPT2, וצלמתי על ידי מיל אור הניאוןcroscopy. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר. נתונים אלה שונים מMostowy et 7 אל. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> .2 דרישות איור נייד להיווצרות כלוב -septin Shigella. () טופלו תאי הלה עם שליטה (CTRL), p62, ATG5, ATG6 או ATG7 siRNA. lysates כל התא של תאים שטופלו-siRNA היה immunoblotted לGAPDH, p62, ATG5, ATG6, או ATG7 להראות את היעילות של דלדול siRNA (למעלה). תאים שטופל siRNA היו נגועים בס flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, ומתויג למיקרוסקופיה כמותית. גרפים (תחתון) מייצגים את ממוצע% ± SEM של Shigella בתוך כלובי SEPT2 מn ≥3 ניסויים לטיפול. (B) תאי הלה היו נגועים בס flexneri, שטופל בDMSO, cytochalasin D (CytD), B latrunculin (LatB), nocodazole (Noco), או blebbistatin (בועה) ולאחר 4 שעות 40 דקות היו קבועות ומתויגות למיקרוסקופיה כמותית. גרפים מייצגים את ממוצע% ± SEM של Shigella בתוך כלובי SEPT2 משני ניסויים בלתי תלויים לטיפול. נתונים אלה שונים מMostowy et 7 אל. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3 מודל דג הזברה של זיהום Shigella. תמונות () כדי להמחיש את הכיוון של זחל דג הזברה תחת סטראו. (לוח שמאלי) זחלי 72 הודעה hr הפריה דג הזברה הוצבו רוחבי בצלחת ההזרקה עם צד הגב שלהם מול מחט הזריקה. זיהום (פנל התיכון) בזרם דם בוצע על ידי injecting החיידקים (פתרון אדום) בוריד הזנב, אחורי לפתיחה ואברי המין. זיהום (פנל מימין) בשריר הזנב בוצע על ידי הזרקת החיידקים (פתרון אדום) מעל somite. (B) עקומות הישרדות של זחלים שלאחר הפריה 72 שעה מוזרק במינונים שונים של ס &#39; flexneri וטופחו על 28 מעלות צלזיוס במשך לאחר זיהום 48 שעות. הבידוד היעיל סווג כנמוך (&lt;10 3 CFU, חוגים פתוחים), בינוני (~ 4 x 10 3 CFU, משולשים פתוחים) או (~ 10 4 CFU, ריבועים פתוחים) הגבוה. אומר% ± SEM (פסים אופקיים) מn ≥3 ניסויים בכיתה הבידוד. (C) ספירת חיידקים חיים בhomogenates מזחלים בודדים בזמנים שונים לאחר הזיהום שנמדד על ידי ציפוי על ק&quot;ג הערה, רק זחלים ששרדו את הזיהום כלולים בניתוח ספירה. הממוצע ± SEM (פסים אופקיים) מוצג גם. (ד) הפצה של GFP- Shigella שנקבע על ידיהדמיה בשידור חי באמצעות סטראו ניאון בזמנים שונים לאחר הזיהום באמצעות מדיום, או הבידוד נמוך, במינון גבוה (זנב זריקות תוך ורידי). כיסוי של תמונת שידור (אפורה) וקרינת GFP (ירוק) (ב) -. (ד &#39;) נתונים אלה שונים מMostowy et al 19. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4 הביולוגיה של התא של זיהום Shigella in vivo. זחלי דג הזברה () היו נגוע בשריר הזנב עם GFP- Shigella (מינון נמוך) ל24 שעות, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים נגד SEPT7 (אדום) ולGFP (ירוק ), וצלם על ידי מיקרוסקופ confocal. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. זחלי דג הזברה (B) GFP-Lc3 היו נגועים בmCherry- Shigella (מינון בינוני) ל4 שעות, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים נגד mCherry (אדום) ולGFP (ירוק), וצלם על ידי מיקרוסקופ confocal. . סרגל קנה מידה, 1.5 מיקרומטר (C) זחלי דג הזברה שטופלו באו שליטה (CTRL; תמונה משמאל) או p62 (תמונה מימין) morpholinos היה נגוע בGFP- Shigella ל4 שעה (מינון בינוני), קבוע, שכותרתו עם נוגדנים נגד SEPT7 ( אדום) ולGFP (ירוק), וצלם על ידי מיקרוסקופ confocal. חיצים להדגיש כמה דוגמאות של Shigella וממולכד בכלובי septin (CTRL) או לא (p62 מדולדל) לאחר זיהום 4 שעות. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. נתונים אלה שונים מMostowy et al 19.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

כדי לנטרל את הפצת הפתוגן, תאי מארח לארגן מחדש את שלד התא שלהם למדר חיידקים ולגרום autophagy. זיהום Shigella שימוש של תאי רקמת תרבות, מארח וגורמי הפתוגן שבבסיס תהליך זה זוהה ואופיין. תוך שימוש במודלי דג הזברה של זיהום Shigella, התפקיד של מולקולות ומנגנונים גילו נחקרים in vivo.

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

הדמיה Ca2 + תגובות במהלך זיהום שיגלה תאי אפיתל

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...