Name: use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

एसएम प्रयोगशाला में काम एक वेलकम ट्रस्ट रिसर्च कैरियर विकास फैलोशिप [WT097411MA] द्वारा समर्थित है.

<ol>
	<li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system.">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li><li>Phalipon, A., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella's+ways+of+manipulating+the+host+intestinal+innate+and+adaptive+immune+system:+a+tool+box+for+survival.">Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival.</a> Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).</li><li>Welch, M. D., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3-mediated+actin-based+motility:+A+tail+of+pathogen+abuse.">Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse.</a> Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).</li><li>Haglund, C. M., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogens+and+polymers:+microbe-host+interactions+illuminate+the+cytoskeleton.">Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins:+the+fourth+component+of+the+cytoskeleton.">Septins: the fourth component of the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).</li><li>Saarikangas, J., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+functions+of+septins+in+metazoans.">The emerging functions of septins in metazoans.</a> EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapment+of+intracytosolic+bacteria+by+septin+cage-like+structures.">Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures.</a> Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62+and+NDP52+proteins+target+intracytosolic+Shigella+and+Listeria+to+different+autophagy+pathways.">p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways.</a> J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells.">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria.">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li><li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans.">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection.">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469, 323-335 (2011).</li><li>Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-defense:+how+cell-autonomous+immunity+protects+against+pathogens.">Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens.</a> Science. 340, 701-706 (2013).</li><li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+bacterial+clearance:+a+not+so+clear+picture.">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autophagy:+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication.">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li><li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish.">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy.">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588 (2013).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+permeabilization+of+cells+and+tissues.">Fixation and permeabilization of cells and tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2008).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8, 445-544 (2012).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> The Zebrafish Book. , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).</li><li>He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+autophagic+activity+in+transgenic+GFP-Lc3+and+GFP-Gabarap+zebrafish+embryos.">Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos.</a> Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).</li><li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+renovation+of+cells+and+tissues.">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li><li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+levels+of+p62+control+cytoplasmic+inclusion+body+formation+in+autophagy-deficient+mice.">Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice.</a> Cell. 131, 1149-1163 (2007).</li><li>Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction.">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).</li><li>Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 2010-2010 (2011).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (9), (2009).</li><li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+autophagy+in+zebrafish.">Analyzing autophagy in zebrafish.</a> Autophagy. 6, 642-644 (2010).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).</li><li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity.">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).</li></ol>

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

शिगेला flexneri, एक ग्राम नकारात्मक आक्रामक enteropathogenic जीवाणु, cytosol को phagosomes से बचने, और साइटोसोलिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने और अंतर और कहनेवाला आंदोलन 1,2 बढ़ावा देने के लिए मेजबान actin cytoskeleton भाजन कर सकते हैं. इन विट्रो 3,4 में actin आधारित गतिशीलता की समझ के बावजूद, विवो में बैक्टीरिया के प्रसार को सीमित तंत्र पूरी तरह से परिभाषित नहीं किया गया है. यह सहज प्रतिरक्षा और मेजबान रक्षा की एक और पूरी समझ के लिए महत्वपूर्ण है. Septins, मेटाजोअन बीच प्रोटीन की एक अत्यधिक संरक्षित परिवार, असमलैंगिक oligomeric परिसरों में इकट्ठा और सेलुलर झिल्ली और cytoskeleton 5,6 के साथ संबद्ध है कि nonpolar तंतु कि फार्म प्रोटीन -binding ग्वानोसिन triphosphate (जीटीपी) कर रहे हैं. हाल ही में काम संक्रमित मेजबान कोशिकाओं autoph को लक्षित compartmentalizing बैक्टीरिया द्वारा शिगेला actin आधारित गतिशीलता रोका जा सकता है की खोज की हैactin आधारित गतिशीलता 7,8 counteracts कि पहले सेलुलर तंत्र खुलासा AGY अंदर &#39;septin पिंजरों&#39;,. जांच की एक विस्तृत खुले मैदान अब &#39;septin जीव विज्ञान और संक्रमण&#39; में निहित है. रोगजनकों की एक किस्म से प्रेरित Septin विधानसभा, (उदाहरण के लिए, लिस्टेरिया monocytogenes 7,9,10, माइकोबैक्टीरियम marinum 7,8, कैंडिडा सफेद 11), मेजबान रक्षा 5,12 में एक महत्वपूर्ण मुद्दे के रूप में उभर सकता है. भोजी, एक अत्यधिक संरक्षित intracellular गिरावट प्रक्रिया, क्योंकि लाइसोसोम 13,14 को साइटोसोलिक बैक्टीरिया वितरित करने के लिए अपनी क्षमता का सेल स्वायत्त उन्मुक्ति का एक प्रमुख घटक के रूप में देखा जाता है. हालांकि, विवो में जीवाणु भोजी की भूमिका को सीमित या खराब 15,16 समझा रहता बैक्टीरियल प्रतिकृति को बढ़ावा देने के लिए. यह ऑप्टिकली सुलभ है क्योंकि zebrafish (Danio rerio) संक्रमण के अध्ययन के लिए एक हड्डीवाला मॉडल के रूप में उभरा हैलार्वा चरणों में सहज प्रतिरक्षा प्रणाली पहले से ही 17,18 कार्यात्मक है. हाल ही में काम एस के लिए zebrafish लार्वा की संवेदनशीलता विशेषता है flexneri, जीवाणु भोजी 15 के लिए एक प्रतिमान है, और इन विवो 19 में जीवाणुरोधी उपचार के लिए भोजी के हेरफेर का अध्ययन करने के शिगेला -zebrafish संक्रमण मॉडल का इस्तेमाल किया गया है. यह रिपोर्ट नए उपकरणों और एस अध्ययन करने के लिए assays प्रदान करता है भोजी और cytoskeleton साथ flexneri बातचीत. पहले कदम में, प्रोटोकॉल भोजी-cytoskeleton बातचीत मानव उपकला कोशिका लाइन हेला के शिगेला संक्रमण का उपयोग वर्णित हैं पर नजर रखने के लिए. इन विट्रो में शिगेला संक्रमण प्रक्रिया पर भोजी-cytoskeleton बातचीत की भूमिका का आकलन करने के लिए, तरीकों प्रदान की जाती हैं भोजी और (siRNA या औषधीय अभिकर्मकों का उपयोग) cytoskeleton घटकों में हेरफेर करने के लिए. नए काम शिगेला संक्रमण ओ का उपयोग करके दिखा दिया है किच zebrafish लार्वा, इसी तरह assays vivo में संक्रमण की कोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है. प्रोटोकॉल तैयार करने और zebrafish लार्वा विस्तृत हैं संक्रमित, और इन विवो में शिगेला संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए, प्रोटोकॉल मेजबान अस्तित्व और संक्रमित लार्वा की बैक्टीरियल बोझ प्रदान की जाती हैं यह निर्धारित करने के लिए. (तरीके (या तय रह zebrafish लार्वा का उपयोग) शिगेला को septin और भोजी मार्कर की भर्ती की निगरानी करने के लिए और तरीके [morpholino (1-4 सेल चरण भ्रूण में इंजेक्ट) oligonucleotides या औषधीय अभिकर्मकों का उपयोग vivo में इन प्रक्रियाओं की भूमिका का परीक्षण करने के लिए zebrafish नहाने के पानी को सीधे जोड़ा)] भी चर्चा कर रहे हैं. काम के इस कार्यक्रम साइटोसोलिक मेजबान प्रतिक्रियाओं से संक्रमण के नियंत्रण के लिए आवश्यक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने की उम्मीद है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="771">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:240px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1793&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass microcapillars&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coarse manual manipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;">M-152</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6762</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Dumont #5 fine tweezers</td>
			<td style="width:240px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forchlorfeneuron&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">JetPEI transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">101-01N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L5288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">NB100-2220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V2111</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MatTek glass bottom dish</td>
			<td style="width:240px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM plus L-alanyl-L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">41090028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MEM non-essential amino acids solution</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller device&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co., Novato,</td>
			<td>P-87&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1404</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Phenol red solution</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693116001</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:412px;">p62/SQSTM1 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Cliniscience</td>
			<td style="width:119px;">PM045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8781</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11360039</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12252-011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield hard set mounting medium containing DAPI&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1500&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions

शिगेला flexneri cytosol तक पहुँचने के लिए phagosomes से बचने, और अपनी गतिशीलता और प्रसार को बढ़ावा देने के cytoskeleton actin मेजबान भाजन कर सकते हैं कि एक intracellular रोगजनक है. नए काम actin आधारित गतिशीलता में शामिल प्रोटीन भी भोजी, सेल स्वायत्त उन्मुक्ति के लिए महत्वपूर्ण एक intracellular गिरावट प्रक्रिया से जुड़े होते हैं कि दिखाया गया है. आश्चर्यजनक, मेजबान कोशिकाओं एस के actin आधारित गतिशीलता रोक सकता बैक्टीरिया के अंदर &#39;septin पिंजरों&#39; compartmentalizing और भोजी उन्हें लक्षित करके flexneri. इन टिप्पणियों septins की एक और पूरी समझ, filamentous जीटीपी बाध्यकारी प्रोटीन का एक परिवार, भोजी की प्रक्रिया में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा कि संकेत मिलता है. यह रिपोर्ट एस के कारण भोजी-cytoskeleton बातचीत पर नजर रखने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन flexneri इन विट्रो टिशू कल्चर कोशिकाओं का उपयोग और इन विवो में zebrafish लार्वा का उपयोग. इन प्रोटोकॉल intracellular mechanis की जांच सक्षम, आणविक सेलुलर, और पूरे जीव स्तर पर बैक्टीरिया के प्रसार को नियंत्रित कि एमएस.

इन विट्रो, एस में टिशू कल्चर कोशिकाओं का संक्रमण होने पर flexneri फेगोसोम से बचने के लिए और cytosol आक्रमण कर सकते हैं. Cytosol में, मेजबान कोशिकाओं septin पिंजरों (चित्रा 1 ए) के अंदर बैक्टीरिया compartmentalizing द्वारा शिगेला की actin आधारित गतिशीलता रोका जा सकता है. Septin पिंजरों द्वारा फँस जीवाणु भी भोजी मार्करों p62 (चित्रा 1 बी) और LC3 (चित्रा 1C) द्वारा लेबल किया जा सकता है. इन टिप्पणियों आक्रामक रोगजनकों के प्रसार को प्रतिबंधित कि मेजबान रक्षा का एक उपन्यास तंत्र पर प्रकाश डाला, और भी भोजी और cytoskeleton के बीच नए संबंधों का पता चलता है. आश्चर्यजनक, भोजी मार्करों की कमी काफी बैक्टीरिया (2A चित्रा) के septin caging कम कर देता है, और काम भी septin caging की कमी काफी भोजी मार्करों 8 की भर्ती कम कर देता है कि दिखाया गया है. इस प्रकार, कम से कम शिगेला के मामले, पिंजरे विधानसभा और autophagosome रचना septin मेंn अन्योन्याश्रित प्रक्रियाओं के रूप में देखा जा सकता है. Septin पिंजरों द्वारा शिगेला की compartmentalization के लिए अन्य सेलुलर आवश्यकताओं actin polymerization और actomyosin गतिविधि (चित्रा 2B) शामिल हैं. संक्रमण का एक नया पशु मॉडल, zebrafish लार्वा 19 से फायदा हो सकता है कोई प्राकृतिक माउस shigellosis के मॉडल, और शिगेला रोगजनन, septin जीव विज्ञान और vivo में जीवाणु भोजी की जांच कर रहे है. यह ऐसे में विवो माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3) के लिए दुम नसों में अस्तित्व प्रयोगों के लिए इंजेक्शन, और पूंछ पेशी इंजेक्शन के रूप में विभिन्न संरचनात्मक साइटों में बैक्टीरिया इंजेक्शन द्वारा zebrafish लार्वा को संक्रमित करने के लिए संभव है. खुराक, एस के आधार पर flexneri या तो 48 घंटे के बाद संक्रमण के भीतर मंजूरी दी जा सकती zebrafish लार्वा में इंजेक्शन, या एक प्रगतिशील और अंततः घातक संक्रमण (आंकड़े -3 बी - 3 डी) में हो सकता है. शिगेला डाह पिताctors 28 डिग्री सेल्सियस, zebrafish के इष्टतम विकास तापमान में व्यक्त कर रहे हैं, और शिगेला द्वारा zebrafish संक्रमण अपने प्रकार III स्राव प्रणाली (T3SS) 19, मानव रोग में एक आवश्यक डाह निर्धारक पर सख्ती से निर्भर है. लिया साथ में, इन टिप्पणियों zebrafish लार्वा शिगेला संक्रमण के vivo विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान नए मेजबान का प्रतिनिधित्व करता है कि संकेत मिलता है. zebrafish लार्वा की ऑप्टिकल अभिगम्यता विवो (चित्रा -4 ए) में septin caging, पहले स्तनधारी मेजबान मॉडल का उपयोग कर पूरा नहीं किया गया है कि एक उपलब्धि के दृश्य में सक्षम बनाता है. Septin पिंजरों विवो में भोजी के लिए लक्षित बैक्टीरिया फंसाने सबूत है कि पूरक करने के लिए, एक GFP-LC3 व्यक्त ट्रांसजेनिक Zebrafish लार्वा को संक्रमित और शिगेला (चित्रा 4 बी) को भोजी मार्कर भर्ती निरीक्षण कर सकते हैं. विवो, एल में शिगेला autophagosomes के ultrastrucutral विश्लेषण के लिएectron माइक्रोस्कोपी स्पष्ट रूप से डबल झिल्ली रिक्तिकाएं 19 से बैक्टीरिया के साइटोसोलिक ज़ब्ती दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. भोजी सेल स्वायत्त उन्मुक्ति का एक प्रमुख घटक है और intracytosolic बैक्टीरिया 14-16 के खिलाफ एक महत्वपूर्ण रक्षा तंत्र के रूप में देखा जाता है. विवो में भोजी समारोह चिह्नित करने के लिए, p62 morpholino इलाज zebrafish लार्वा इस्तेमाल किया जा सकता है. कोर भोजी मशीनरी के विपरीत [जैसे., 36 भोजी से संबंधित प्रोटीन (ATGs) 26], p62 संक्रमण के लिए सामान्य रूप से पूर्व विकसित कर सकते हैं हड्डीवाला विकास 27 और इस प्रकार zebrafish लार्वा के लिए आवश्यक नहीं है. आश्चर्यजनक, p62 समाप्त लार्वा एस के साथ टीका काफी वृद्धि हुई मृत्यु दर और बढ़ बैक्टीरियल बोझ 19 में flexneri परिणाम. कि septin पिंजरे विधानसभा दिखा इन विट्रो काम के साथ समझौते में autophagosome गठन 7,8 साथ अन्योन्याश्रित है, शिगेला को septin भर्ती स्पष्ट रूप से (p62 समाप्त लार्वा में कम है <strओंग&gt; चित्रा 4C). इन आंकड़ों zebrafish अस्तित्व intracellular जीवाणु संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए p62 की मध्यस्थता भोजी पर निर्भर करता है कि प्रदर्शित करता है. <img alt="चित्रा 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> इन विट्रो में septin पिंजरे 1 चित्रा. (ए) HELA कोशिकाओं एस से संक्रमित थे flexneri 4 घंटा 40 मिनट के लिए, तय, SEPT9 और phalloidin के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल, और confocal microcopy ने उतारी. स्केल बार, 1 माइक्रोन. (बी) HELA कोशिकाओं एस से संक्रमित थे flexneri 4 घंटा 40 मिनट के लिए, तय, p62 और SEPT2 के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल, और फ्लोरोसेंट प्रकाश माइक्रोस्कोपी ने उतारी. स्केल बार, 1 माइक्रोन. (सी) HELA कोशिकाओं, GFP-ATG8 / LC3 साथ ट्रांसफ़ेक्ट एस से संक्रमित थे 4 घंटा 40 मिनट के लिए flexneri, तय, फ्लोरोसेंट रोशनी मील से SEPT2 के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल, और imagedcroscopy. स्केल बार, 1 माइक्रोन. ये आंकड़े Mostowy एट अल 7 से संशोधित किया गया है. <img alt="चित्रा 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> शिगेला -septin पिंजरे गठन के लिए चित्रा 2 सेलुलर आवश्यकताओं. (ए) HELA कोशिकाओं पर नियंत्रण के साथ इलाज किया गया (Ctrl), p62, ATG5, ATG6 या ATG7 siRNA. SiRNA इलाज कोशिकाओं के पूरे सेल lysates siRNA कमी (ऊपर) की दक्षता दिखाने के लिए GAPDH, p62, ATG5, ATG6, या ATG7 लिए immunoblotted गया. siRNA इलाज कोशिकाओं एस से संक्रमित थे तय है, और मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी के लिए लेबल, 4 घंटा 40 मिनट के लिए flexneri. रेखाचित्र (नीचे) उपचार प्रति n ≥3 प्रयोगों से SEPT2 पिंजरों के अंदर शिगेला के SEM मतलब ±% का प्रतिनिधित्व करते हैं. (बी) HELA कोशिकाओं एस से संक्रमित थे चडी (CytD) cytochalasin, DMSO के साथ इलाज lexneri, latrunculin बी (LatB), nocodazole (Noco), या blebbistatin (छाला) और 4 घंटे के बाद 40 मिनट तय किया गया और मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी के लिए लेबल. रेखांकन उपचार प्रति दो स्वतंत्र प्रयोगों से SEPT2 पिंजरों के अंदर शिगेला के SEM मतलब ±% का प्रतिनिधित्व करते हैं. ये आंकड़े Mostowy एट अल 7 से संशोधित किया गया है. <img alt="चित्रा 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> चित्रा 3 शिगेला संक्रमण के zebrafish मॉडल. (ए) छवियाँ stereomicroscope के तहत zebrafish लार्वा के उन्मुखीकरण को वर्णन करने के लिए. (बाएं पैनल) zebrafish लार्वा 72 घंटे के बाद निषेचन उनकी पृष्ठीय पक्ष इंजेक्शन सुई का सामना करना पड़ के साथ इंजेक्शन थाली में पार्श्व तैनात थे. (मध्यम पैनल) खून संक्रमण inj द्वारा किया गया थादुम नस में बैक्टीरिया (लाल समाधान) ecting, मूत्रजननांगी उद्घाटन करने के पीछे. पूंछ मांसपेशियों में (सही पैनल) संक्रमण एक विखंड अधिक बैक्टीरिया (लाल समाधान) इंजेक्शन लगाने के द्वारा किया गया था. (बी) 72 घंटा बाद निषेचन लार्वा की जीवन रक्षा घटता एस के विभिन्न खुराक के साथ इंजेक्शन flexneri और 48 घंटे के बाद संक्रमण के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर incubated. प्रभावी inoculum कम (&lt;10 3 CFU, खुला हलकों), मध्यम (~ 4 x 10 3 CFU, खुला त्रिकोण) या उच्च (~ 10 4 CFU, खुला वर्गों) के रूप में वर्गीकृत किया गया था. Inoculum वर्ग प्रति n ≥3 प्रयोगों से SEM ±% (क्षैतिज सलाखों) मीन. (सी) गणन व्यक्ति लार्वा से homogenates में जीवित बैक्टीरिया के विभिन्न समय पौंड पर चढ़ाना द्वारा मापा के बाद संक्रमण पर ध्यान दें, केवल लार्वा गणन विश्लेषण में शामिल कर रहे हैं संक्रमण से बच रही है. यह भी दिखाया ± SEM (क्षैतिज सलाखों) मीन. (डी) GFP- शिगेला का वितरण द्वारा निर्धारितकई बार एक कम, मध्यम या उच्च खुराक inoculum (दुम नसों में इंजेक्शन) का उपयोग कर के बाद संक्रमण पर एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope का उपयोग रहते इमेजिंग. . संचरण छवि (ग्रे) और GFP प्रतिदीप्ति (हरा) (बी) के ओवरले - (डी) ये आंकड़े Mostowy एट अल 19 से संशोधित किया गया है. <img alt="चित्रा 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> चित्रा 4 विवो में शिगेला संक्रमण की कोशिका जीव विज्ञान. (ए) zebrafish लार्वा 24 घंटा, तय, GFP SEPT7 (लाल) के खिलाफ और एंटीबॉडी के साथ लेबल (हरे रंग के लिए GFP- शिगेला (कम खुराक) के साथ पूंछ मांसपेशियों में संक्रमित थे ), और confocal माइक्रोस्कोपी ने उतारी. स्केल बार, 5 माइक्रोन. (बी) GFP-LC3 zebrafish लार्वा mCherry- शिगेला (मध्यम खुराक) के लिए से संक्रमित थे4 घंटा, तय, mCherry (लाल) के खिलाफ और GFP (हरा) के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल, और confocal माइक्रोस्कोपी ने उतारी. . या p62 (सही छवि) morpholinos SEPT7 खिलाफ एंटीबॉडी (के साथ लेबल, तय, 4 घंटे के लिए GFP- शिगेला (मध्यम खुराक) से संक्रमित थे, स्केल बार, 1.5 माइक्रोन (सी) zebrafish लार्वा या तो नियंत्रण (बाएं छवि Ctrl) के साथ इलाज लाल) और GFP (हरा) के लिए, और confocal माइक्रोस्कोपी ने उतारी. तीर septin पिंजरों (Ctrl) या नहीं में फँस शिगेला के कुछ उदाहरण उजागर 4 घंटा बाद संक्रमण (p62 समाप्त). स्केल बार, 5 माइक्रोन. ये आंकड़े Mostowy एट अल 19 से संशोधित किया गया है.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

रोगाणु प्रसार प्रतिक्रिया, मेजबान कोशिकाओं बैक्टीरिया compartmentalize और भोजी प्रेरित करने के लिए उनके cytoskeleton पुनर्निर्माण. टिशू कल्चर कोशिकाओं, मेजबान और इस प्रक्रिया अंतर्निहित रोगजनक निर्धारकों का उपयोग करना शिगेला संक्रमण की पहचान की और विशेषता है. शिगेला संक्रमण के zebrafish मॉडल का प्रयोग, खोज अणुओं और तंत्र की भूमिका विवो में जांच कर रहे हैं.

का प्रयोग करें<em&gt; शिगेला flexneri</em&gt; भोजी-cytoskeleton बातचीत का अध्ययन

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

गतिशील लाइव सेल इमेजिंग के लिए मेजबान पैथोजन सहभागिता के अध्ययन के लिए एक ऑप्टिकल जाल का प्रयोग करें

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

लंबे समय तक मेजबान रोगज़नक़ सहभागिता निस्र्पक के लिए EpiAirway मॉडल का उपयोग

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

का प्रयोग करें<em&gt; गैलेरिया मेल्लोनेल्ला</em&gt; एक मॉडल जीव के रूप में अध्ययन करने के लिए<em&gt; लीजोनेला pneumophila</em&gt; संक्रमण

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

जीन या ड्रग थेरेपी में उपयोग के लिए लक्ष्य निर्धारण एचआईवी -1 उत्पादन प्रभावकारिता और आरएनए की विषाक्तता का मूल्यांकन

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

ऐसे ई कोलाई या शिगेला flexneri के रूप में Enterobacterial उपभेदों में बैक्टीरियल विकार का उपयोग कर एक घने Transposon प्रविष्टि पुस्तकालय का निर्माण

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

इमेजिंग सीए2 + उपकला कोशिकाओं के शिगेला संक्रमण के दौरान प्रतिक्रियाएं

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

साल्मोनेला एसपीपी की स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च प्रवाह मंच./शिगेला एसपीपी.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

क्रिप्टोकॉकस-अमीबा इंटरेक्शन के अध्ययन में सूक्ष्म तकनीक और फ्लोरोसेंट रीडिंग का पूरक उपयोग

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

एक उच्च थ्र्रपुट शिगेला-विशिष्ट जीवाणुनाशक परख

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

मानव कोलोनॉइड Monolayers रोगजनकों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, Commensals, और मेजबान आंत्र उपकला

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...