Name: use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

SM의 실험실에서 작업은 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 연구 경력 개발 원정대 [WT097411MA]에 의해 지원됩니다.

<ol>
	<li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system.">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li><li>Phalipon, A., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella's+ways+of+manipulating+the+host+intestinal+innate+and+adaptive+immune+system:+a+tool+box+for+survival.">Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival.</a> Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).</li><li>Welch, M. D., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3-mediated+actin-based+motility:+A+tail+of+pathogen+abuse.">Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse.</a> Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).</li><li>Haglund, C. M., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogens+and+polymers:+microbe-host+interactions+illuminate+the+cytoskeleton.">Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins:+the+fourth+component+of+the+cytoskeleton.">Septins: the fourth component of the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).</li><li>Saarikangas, J., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+functions+of+septins+in+metazoans.">The emerging functions of septins in metazoans.</a> EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapment+of+intracytosolic+bacteria+by+septin+cage-like+structures.">Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures.</a> Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62+and+NDP52+proteins+target+intracytosolic+Shigella+and+Listeria+to+different+autophagy+pathways.">p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways.</a> J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells.">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria.">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li><li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans.">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection.">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469, 323-335 (2011).</li><li>Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-defense:+how+cell-autonomous+immunity+protects+against+pathogens.">Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens.</a> Science. 340, 701-706 (2013).</li><li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+bacterial+clearance:+a+not+so+clear+picture.">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autophagy:+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication.">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li><li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish.">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy.">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588 (2013).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+permeabilization+of+cells+and+tissues.">Fixation and permeabilization of cells and tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2008).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8, 445-544 (2012).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> The Zebrafish Book. , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).</li><li>He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+autophagic+activity+in+transgenic+GFP-Lc3+and+GFP-Gabarap+zebrafish+embryos.">Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos.</a> Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).</li><li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+renovation+of+cells+and+tissues.">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li><li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+levels+of+p62+control+cytoplasmic+inclusion+body+formation+in+autophagy-deficient+mice.">Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice.</a> Cell. 131, 1149-1163 (2007).</li><li>Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction.">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).</li><li>Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 2010-2010 (2011).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (9), (2009).</li><li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+autophagy+in+zebrafish.">Analyzing autophagy in zebrafish.</a> Autophagy. 6, 642-644 (2010).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).</li><li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity.">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

조직 배양 세포를 이용한 시험 관내 및 세포 골격 자식 작용을 모니터링 할 때, 구역 1 및 2에 기재된 프로토콜은 조직 배양 세포 유형의 다양한 적용 할 수있다. 또한, 자식 작용을 따라 (예, ATG8 / LC3가 autophagosomes을했습니다 +)와 세포 골격 (예., 굴지의 꼬리, septin 케이지) 라이브 영상을 사용하여 이질 감염시 실시간으로 역학, 조직 배양 세포가 일시적으로 GFP-를 사용하여 형질 전환 할 수있다, 이전에 같은 RFP- 또는 CFP-태그 구조는 7,8을 설명했다. (. 즉, 시겔 100에서 HeLa 세포 5-30 %에 침입 할 수 있다는 것을 고려 실시간 분석을 위해 일반적으로 바람직 1 MOI) 이질균에 감염된 세포의 백분율을 증가시키는 (OD 직접 시겔 400 μl를 추가하고, 600 = 0.3 -0.6) 2 ㎖의 세포에 MEM (혈청에 굶주린)와 충분한 세균 항목에 대한 최소 1.5 시간 게시물 감염 기다려 phagosome, 복제, AU에서 탈출tophagy 인식과 septin의 caging. 또한, 하나는 어드 AfaE을 표현하고 상피 세포에서 더 높은 침략 능력 M90T 변형 28에 비해 한 시겔 M90T AfaI의 피로를 사용할 수 있습니다. 참고로, M90T AfaI 변형은 아직 제브라 피쉬를 사용하여 생체 내에서 테스트되지 않았습니다. 시겔 식민지의 플레이트 2 ~ 3 일 동안 4 ° C로 유지하고 여러 가지 실험에 사용 할 수 있습니다. 그러나, 시간이 지남에 따라, 또한 콩고 레드를 흡수하고 나타날 수있는 독성 플라스미드를 잃은 시겔의 식민지는 독성 플라스미드를 유지했다합니다. 이러한 이유로 우리는 가능하면 신선한 박테리아 주식을 사용하는 것이 좋습니다. 생체 내에서 감염 세포 생물학을 모니터링 할 때, 프로토콜 부 (3, 4)를 사용 야생형 AB 선 제브라 피쉬에 기재. 시각적으로는 DsRed : GFP 또는 lyz : 시겔 -leukocyte 상호 작용을 모니터링하기 위해 형질 전환 제브라 피쉬 라인은, 예를 들어, 메가 픽셀 사용할 수 있습니다호중구 19,29,30 또는 MPEG1을이지는 : mcherry 식세포 19,31를 시각화 할 수 있습니다. 3.8 절에 설명 된대로 생체 내에서 자식 작용을 시각화하기 위해, GFP-LC3 제브라 피쉬의 유전자 변형 라인 19,24 사용할 수 있습니다. 생체 내에서 자식 작용을 교란하기 위해 효과적인 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드의 투여 량은 성적 접합 또는 단백질의 번역을 억제하는 효율에 기초하여 실험적으로 평가되어야한다. 이는 적정 실험을 수행하고, (스플 라이스 모르 폴리 뉴클레오티드에 대한) RT-PCR에 의해 고갈을 확인하거나 (병진 모르 폴리 뉴클레오티드에 대한) SDS-PAGE (32)에 의해 적당하다. 제브라 피쉬 배아 또는 유충으로부터 분리 RNA는 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출을 이용하여 수행 될 수있다. 제브라 피쉬의 유충 (8-15 유충 / 관)에서 단백질을 추출하려면, 기계적, 0.01 % 옥틸 페놀 산화 에틸렌 condensat 200 μL 용해 버퍼 (1 M 트리스, 5 M의 NaCl, 0.5 M EDTA에서 유를 사용하여 균질화즉, 및 프로테아제 억제제). 15 분 동안 4 ° C에서 19,000 XG에 원심 분리기 튜브와 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 15 분 동안 95 ° C에서 샘플을 Laemmli에 버퍼를 추가하고 가열한다. 해물은 필요할 때까지 -80 ° C에 저장 될 수 있으며, 2.3 절에 설명 된대로 웨스턴 블로 팅에 의해 평가 될 수있다. 제브라 피쉬는 생체 내 약물 응용 프로그램을위한 훌륭한 모델입니다. 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 분석 자식 작용 (예를 들어, 라파 마이신 및 bafilomycin)를 조작하기 위해 설립 약물 보완 할 수 있습니다. 감염되지 않은 및 / 또는 감염 유충은 라파 마이신 (1.5 μM) 또는 bafilomycin (80nm의) E2로 희석하고, 25,33에 설명 된대로 autophagic 플럭스가 웨스턴 블 롯팅에 의해 평가 될 수로 처리 할 수있다. 섹션 3.5에 기재된 바와 같이 감염된 애벌레의 감염 및 생존의 결과에 자식 작용 조작의 결과는 평가 될 수있다. 숙주 세포를 연구 외에생체 외 및 생체 내 프로토콜의 결정은, 예를 들면., 시겔 ΔicsA이 (이질 단백질 ICSA는 N-WASP를 모집하고 Arp2 / 3, 차동 자식 작용에 의해 인식되는 박테리아의 돌연변이 균주를 사용하여 자식 작용 인식에 필요한 세균 결정을 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다 그것의 부재에서, 그것의 휴무에 더 굴지의 꼬리, 아니 septin 케이지)와 ShigellaΔicsB (시겔은 ICSA에 자식 작용 기계의 채용을 방지 세균 이펙터 단백질 IcsB 통해 autophagic 응답을 피할 수있을 수 없다, 굴지의 꼬리와 septin 케이지 형성 더 septin 케이지, 더 많은 자식 작용) 7,8있을 수 있습니다. 시겔은 제브라 피쉬의 자연 병원체하지 않고 37 ℃에서 최적 성장한다. 그러나 작품은 싸이의 탐식 액포 및 복제에서 탈출, 시겔 침공에 요구되는 독성 요인을 보여 주었다tosol 표현 및 28 ° C 19에 제브라 피쉬의 유충에서 기능적 할 수 있습니다. 28 ° C 정상적인 제브라 피쉬의 개발 (23)을 보장하기 위해 제브라 피쉬의 양육 및 표준 온도에 가장 일반적으로 사용되는 온도이다. 놀랍게도 인간에서 세균성 이질로 이어질 주요 병원성 이벤트 (상피 세포 내에서 즉, 대식 세포의 죽음, 침략과 곱셈, 세포 간 확산, 호스트 상피 세포의 염증 파괴) 충실하게 시겔 라 감염의 제브라 피쉬 모델에서 재현 19. 자식 작용 및 세포 골격 재하 유전자 발현과 생물학적 기능의 넓은 범위가된다. 마우스 연구 5 배아 치명적인 필수적인 자식 작용 26 또는 septin 유전자의 넉 아웃을 도시 한, 그리고 이러한 문제는 제브라 피쉬 여러 가지고 있다는 사실에 의해 감소 될 수 있지만 이들 유전자 중 일부는 (지브라 피쉬 개발에 필수적 일 것이라는 가능성paralogous 유전자 33). 그렇다면 morpholinos 아래로 적정 수 (II) 자식 작용 및 세포 골격을 조절하는 (ⅰ) 약리학 적 시약의 사용을 포함하여 이런 문제를 극복하기 위해 여러 가지 대안이있는 유전자의 (ⅲ) 녹아웃는 특정 셀에 대해 설계 될 수있다 유형 및 / 또는 (IV) 동물 개발에 필수적인 없습니다 autophagic 인식에 관여하는 유전자 (예., P62)을 대상으로 할 수 있습니다. 제브라 피쉬는 자식 작용과 이질 감염시의 세포 골격을 조사 할 수있는 이상적인 모델 시스템이지만, 분자 도구는 현재 부족하다. 필드는 새로운 툴과 관심 단백질의 구동 셀 특정 식을 생성 할 필요가있다. 자식 작용 / 세포 골격 유전자의 발현을 녹아웃하기 위해, 새로운 시퀀스 모르가 필요하고, 유전체 공학을위한 신규 한 방법 (예를 들면, TALEN는 CRISPR / Cas9)도 사용될 수있다. 한편, 몇 가지 도구는 이전에 인간 또는 마우스 연구에 대해 생성똑같이 제브라 피쉬를 위해 작동하지 않을 수 있습니다. 세포 내 박테리아 S. flexneri는 면역 체계의 1, 2에 의해 인식되는 박테리아의 기능을 포함하여 생물학의 핵심 문제를 해결하기 위해 뛰어난 모델 생물로 떠오르고있다. 숙주 세포의 S. 운동성을 제한 septins을 채용 flexneri와 자식 작용으로, 대상 셀 자율 면역 7,8의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 관찰은 자식 작용 (autophagy)과 세포질 박테리아를 분해 할 수있는 능력을 연구하기위한 새로운 분자 프레임 워크를 제안한다. 주요 문제는 완전히 기본 분자 세포 사건을 해독하고, 중요한 동물 모델을 사용하여 생체 내에서 세균 감염 동안 시험 관내 분석 이러한 이벤트를 확인하는 지금이다. 이를 위해, 제브라 피쉬는 S.의 분석을위한 유용한 새로운 호스트로 설정 한 내용 flexneri 감염 19. 박테리아 숙주 세포 사이의 상호 작용은 고해상도 영상화 할 수 있고,제브라 피쉬 모델 생체 내에서 시겔 감염 세포 생물학을 이해하는데 유용한다. 제브라 피쉬 유충 숙주 방어 세균 자식 작용의 역할을 조사하기 위해 사용될 수 있으며, 작업의 자식 작용 섭동 악영향 이질균 감염 19에 응답하여 호스트의 생존에 영향을 미칠 수 있다는 것을 보여 주었다. 관찰은 호스트 방어를 이해하는 근본적인 진보를 제공 할 수있는 제브라 피쉬의 유충을 사용하여 조직 배양 세포와 생체 내에서를 사용하여 시험 관내에서 caging와 자식 작용을 septin, 시겔의 연구에서 생성 된. 또한 감염성 질환을 퇴치 겨냥한 새로운 전략의 개발을 제안 할 수있다. 이 보고서의 주요 목적은 체외에서 분석 분자 및 세포 사건의 의미를 확인하는 것입니다 (즉, 자식 작용, 굴지의 꼬리, caging septin) 엔트의 맥락에서 생체 내에서 세균 감염시를제브라 피쉬의 유충을 사용하여 분노 생물. 제브라 피쉬의 생물학 및 취급 익숙하지 않으면, 하나는 적절한 제브라 피쉬 사육 (23)과 제브라 피쉬 감염 19,35의 생체 분석에 깊이 프로토콜에서 참조 할 수 있습니다.

시겔 flexneri, 그람 음성 침략 장내 유해 세균은 세포질에 phagosomes에서 탈출하고, 세포질 면역 반응을 회피하고 세포 내 및 세포 간 이동 1, 2를 홍보하기 위해 호스트 액틴 세포 골격을 중합 할 수 있습니다. 체외 3,4에서 액틴 기반 운동의 이해에도 불구하고, 생체 내에서 세균의 확산을 제한하는 메커니즘은 완전히 정의되지 않았습니다. 이 선천성 면역 (innate immunity) 및 호스트 방어의보다 완전한 이해에 매우 중요합니다. Septins, 후생 동물 중 단백질의 높은 보존 가족, 헤테로 올리고머 단지에 조립하고 세포막과 세포 골격 5,6와 연관 비극성 필라멘트를 형성하는 단백질을 -binding 구아노 신 삼인산 (GTP)입니다. 최근 연구는 감염된 숙주 세포가 autoph를 목표로 구획화 박테리아에 의해 시겔 액틴을 기반으로 운동을 방지 할 수 있음을 발견했다액틴 기반 운동 7,8 중화 첫번째 세포 메커니즘을 공개 AGY 내부 &#39;septin 케이지&#39;. 조사 활짝 열려 필드는 이제 &#39;septin 생물학 및 감염&#39;에있다. 병원균의 다양한 의해 유도 Septin 조립, (예를 들어, 리스테리아 7,9,10, 마이 코박 테 리움 marinum 7, 8, 칸디다 알비 칸스 11), 호스트 방어 5,12의 핵심 이슈로 등장 할 수있다. 자식 작용, 고도로 보존 된 세포 내 분해 과정 때문에 리소좀 13,14 박테리아 세포질에 전달하는 능력의 자율 면역 세포의 핵심 요소로 간주된다. 그러나, 생체 내에서 세균 자식 작용의 역할은 제한하거나 저조한 15, 16를 이해 남아 세균의 복제를 촉진. 이 광학적으로 액세스 할 수 있기 때문에 제브라 피쉬 (다니오 rerio)는 감염의 연구를위한 척추 동물 모델로 등장했다애벌레 단계에서 선천성 면역 시스템은 이미 17, 18 작동 할 때. 최근 연구는 S.에 제브라 피쉬 유충의 감수성을 특징으로하고있다 flexneri, 세균 자식 작용 (15)에 대한 패러다임은, 생체 (19)에 항균 치료를위한 자식 작용 (autophagy)의 조작을 연구하는 시겔 -zebrafish 감염 모델을 사용하고있다. 이 보고서는 새로운 도구와 S.을 연구 분석을 제공합니다 자식 작용과 세포 골격과 flexneri의 상호 작용. 제 1 단계에서, 프로토콜은 자식 작용-세포 골격 상호 작용은 인간 상피 세포주 HeLa 세포의 감염 시겔를 사용하여 설명된다 모니터링한다. 체외 이질균 감염 과정에 자식 작용 - 골격 상호 작용의 역할을 평가하기 위해, 방법이 제공된다를 자식 작용 및 (또는 약리학 적 siRNA를 이용하여 시약) 세포 골격 성분을 조작한다. 새로운 작품은 이질균 감염 O를 사용하여 해당을 보여 주었다F 지브라 피쉬 유충은 유사한 분석이 생체 내에서 감염 세포 생물학 연구에 적용될 수있다. 프로토콜 준비하고 제브라 피쉬의 유충이 자세히 설명되어 감염 및 생체 내에서 이질 감염에 대한 호스트 응답을 평가하기 위해, 프로토콜은 호스트의 생존과 감염된 유충의 세균 부담이 제공됩니다 결정합니다. (방법 (고정 또는 생활 제브라 피쉬의 유충을 사용하여) 시겔에 septin와 자식 작용 (autophagy) 마커의 채용을 모니터링 및 방법은 [모르 폴리 노의 (1-4 세포 단계의 배아에 주입) 올리고 뉴클레오티드 또는 약물 시약을 사용하여 생체 내에서 이러한 프로세스의 역할을 테스트 제브라 피쉬 목욕 물에 직접 추가)]에 대해서도 설명합니다. 작업이 프로그램은 세포질 숙주 반응에 의한 감염의 제어에 필요한 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 것으로 기대된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="771">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:240px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1793&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass microcapillars&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coarse manual manipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;">M-152</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6762</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Dumont #5 fine tweezers</td>
			<td style="width:240px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forchlorfeneuron&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">JetPEI transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">101-01N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L5288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">NB100-2220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V2111</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MatTek glass bottom dish</td>
			<td style="width:240px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM plus L-alanyl-L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">41090028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MEM non-essential amino acids solution</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller device&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co., Novato,</td>
			<td>P-87&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1404</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Phenol red solution</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693116001</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:412px;">p62/SQSTM1 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Cliniscience</td>
			<td style="width:119px;">PM045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8781</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11360039</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12252-011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield hard set mounting medium containing DAPI&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1500&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions

시겔 flexneri는 세포질에 도달 phagosomes에서 탈출, 그 운동성 및 보급을 촉진하기 위해 세포 골격을하는 걸 호스트를 중합 할 수있는 세포 내 병원균이다. 새로운 작품은 액틴 기반의 운동에 관여하는 단백질이 또한 자식 작용, 세포 자율 면역에 중요한 세포 내 분해 과정에 연결되어 있음을 보여 주었다. 놀랍게도, 숙주 세포의 S. 액틴 기반 운동성 못할 수도 박테리아 내부의 &#39;septin 케이지&#39;를 구획화와 자식 작용에를 대상으로 flexneri. 이러한 관찰은 septins의보다 완전한 이해, 사상 GTP 결합 단백질의 가족, 자식 작용의 과정에 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다 나타냅니다. 이 보고서는 S.에 의한 자식 작용 - 세포 골격의 상호 작용을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다 flexneri 시험 관내 조직 배양 세포를 사용하여 생체 내에서 지브라 피쉬의 유충을 사용. 이러한 프로토콜은 세포 내 메커니즘 정보의 조사를 가능하게분자 세포 및 전체 유기체 수준에서 세균의 확산을 제어 MS.

시험관, S.에서 조직 배양 세포의 감염시 flexneri는 phagosome를 종료하고 세포질에 침입 할 수 있습니다. 세포질에서, 숙주 세포는 septin 케이지 (그림 1A) 내부에 박테리아를 구획화하여 시겔의 액틴 기반의 운동성을 방지 할 수 있습니다. septin 새장에 갇힌 박테리아는 자식 작용 마커 P62 (그림 1B)와 LC3 (그림 1C)로 표시 할 수 있습니다. 이러한 관찰은 침입 병원균의 확산을 제한 호스트 방어의 새로운 메커니즘을 강조하고, 또한 자식 작용과 세포 골격 사이에 새로운 링크를 알 수있다. 놀랍게도, 자식 작용 마커의 고갈은 크게 박테리아 (그림 2A)의 septin의 caging을 줄이고, 작업도 septin의 caging의 고갈이 크게 자식 작용 마커 8의 채용을 줄일 것으로 나타났습니다. 따라서, 적어도 시겔의 경우, 케이지 어셈블리와 autophagosome 상자 형성을 septin 목록N은 상호 의존적 인 프로세스로 볼 수 있습니다. septin 케이지에 의해 시겔의 구획화에 대한 다른 세포 요구 사항은 액틴의 중합 및 액토 마이 오신 활동 (그림 2B)를 포함한다. 감염의 새로운 동물 모델, 제브라 피쉬 애벌레 19 혜택을 누릴 수있는 자연 마우스 세균성 이질의 모델 및 시겔의 병인, septin 생물학 및 생체 내에서 세균 자식 작용의 조사가 없습니다. 그러한 생체 현미경 (도 3A)에 대한 꼬리 정맥 생존 실험 주사, 꼬리 근육 주사 등 다양한 해부학 적 위치에있는 박테리아를 주입하여 제브라 피쉬 유충을 감염시킬 수있다. 용량, S.에 따라 flexneri 중 하나를 48 시간 게시물 감염에서 해제 할 수 있습니다 제브라 피쉬의 유충에 주입, 또는 진보적 궁극적으로 치명적인 감염 (그림 3B - 3D)가 발생할 수 있습니다. 시겔의 독성 FActors는 28 ° C, 제브라 피쉬의 최적 성장 온도에서 표현되고, 이질균에 의한 감염은 제브라 피쉬의 유형 III 분비 시스템 (T3SS) 19, 인간의 질병에 필수적인 독성 결정에 따라 엄격하게 의존한다. 촬영 함께, 이러한 관찰은 제브라 피쉬의 유충은 시겔 라 감염의 생체 분석을위한 유용한 새 호스트를 나타낸다는 것을 나타냅니다. 제브라 피쉬의 유충의 광학 접근성은 생체 내 (그림 4A)에서 septin의 caging 전에 포유류 호스트 모델을 사용하여 수행 된 적이없는 성취의 시각화를 가능하게한다. septin 케이지가 생체 내에서 자식 작용을 대상으로 박테리아를 포획 증거를 보완하기 위해, 하나는 GFP-LC3를 발현하는 형질 전환 제브라 피쉬의 유충 감염 시겔 (그림 4B)에 자식 작용 마커 모집을 관찰 할 수 있습니다. 생체 엘에서 시겔 autophagosomes의 ultrastrucutral 분석을 위해ectron 현미경 명확 이중 액포 막 (19)에 의해 세균의 세포질 격리를 표시하는데 사용될 수있다. 자식 작용은 세포 자율 면역의 핵심 구성 요소 및 intracytosolic 박테리아 14-16에 대한 중요한 방어 메커니즘으로 볼 수 있습니다. 생체 내에서 기능 자식 작용을 특성화하기 위해, P62의 모르 폴리 노 - 처리 된 애벌레 지브라 피쉬가 사용될 수있다. 핵심 자식 작용 기계는 달리 [예., 36 자식 작용 관련 단백질 (ATGs) 26], P62은 감염에 일반적으로 이전 개발할 수 있습니다 척추 개발 27 따라서 제브라 피쉬의 유충을위한 필수적인 것은 아니다. 놀랍게도, P62-고갈 유충 S. 접종 크게 증가 사망률 증가 박테리아 부담 19 flexneri 결과입니다. 그 septin 케이지 어셈블리를 보여주는 체외 작업과 일치 autophagosome 형성 7,8와 상호 의존적이며, 시겔에 septin 모집 명확하게 (P62-고갈 유충에 감소 <str옹&gt; 그림 4C). 이 자료는 제브라 피쉬의 생존 세포 내 세균 감염을 제어하는​​ P62 매개 자식 작용 (autophagy)에 의존한다는 것을 보여줍니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> 체외 septin 케이지 1도. (A) HeLa 세포를 감염되었다 S. flexneri는 4 시간 40 분 동안 고정 SEPT9 및 phalloidin에 대한 항체로 표지하고, 공 초점 축소 복사에 의해 촬상. 스케일 바, 1 μm의. (B) HeLa 세포는 S.에 감염되었다 flexneri는 4 시간 40 분, 고정, P62 및 SEPT2에 대한 항체로 표지하고, 형광 현미경으로 몇 군데. 스케일 바는, 1 μm의. (C) 헬라 세포는 GFP-ATG8 / LC3로 형질 S.에 감염되었다 4 시간 40 분 동안 flexneri, 고정, 형광등 마일에 의해 SEPT2에 대한 항체로 표지 및 영상화croscopy. 스케일 바, 1 μm의. 이 수치는 Mostowy 등 7에서 수정되었습니다. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> 시겔 -septin 케이지 형성을위한 그림 2 셀룰러 요구 사항. (A) HeLa 세포가 제어 처리 하였다 (CTRL), P62, ATG5, ATG6 또는 ATG7의 siRNA. siRNA를 처리 한 세포의 전체 세포 용 해물은 siRNA의 고갈 (위)의 효율을 보여 GAPDH, P62, ATG5, ATG6 또는 ATG7 대해 immunoblotted 하였다. siRNA를 처리 한 세포는 S.에 감염되었다 고정 및 정량 현미경 표지, 4 시간 40 분 동안 flexneri. 그래프 (아래)는 처리 당 N ≥3 실험 SEPT2 케이지 내부 시겔의 SEM ± 평균 %를 나타냅니다. (B) 헬라 세포 S.에 감염되었다 FD (CytD) 사이토, DMSO로 처리 lexneri, latrunculin B (LATB), nocodazole (Noco) 또는 blebbistatin (물집)과 4 시간 후 40 분 고정하고 정량적 현미경 표지. 그래프 처리 당 두 개의 독립적 인 실험에서 SEPT2 케이지 내부 시겔의 SEM ± 평균 %를 나타냅니다.이 수치는 Mostowy 등 7에서 수정되었습니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> 그림 3 이질 감염의 제브라 피쉬 모델입니다. (A) 이미지는 실체 현미경을 이용하여 제브라 피쉬 유충의 방향을 설명합니다. (왼쪽 패널) Zebrafish의 유충 72 시간 게시물 수정은 자신의 몸 윗면은 주사 바늘을 향 분사 플레이트 측면에 위치했다. (중앙 패널) 혈류 감염은 INJ에 의해 수행되었다꼬리 정맥에 박테리아 (빨간색 솔루션) 돌출 한, 비뇨 생식기 입구에 후방. 꼬리 근육 (오른쪽 패널) 감염은 체절을 통해 박테리아 (적색 용액)을 주입하여 수행 하였다. (B) 72 시간 후 수정 애벌레의 생존 곡선을 S.의 다양한 용량으로 주입 flexneri하고 48 시간 게시물 감염 28 ° C에서 배양 하였다. 유효 접종 낮은 (&lt;10 세 CFU 오픈 원), 중 (~ 4 × 10 3 CFU 오픈 삼각형) 또는 높은 (~ 10 4 CFU, 열린 광장)으로 분류 하였다. 접종 클래스 당 N ≥3 실험에서 ± SEM % (가로 막대)를 의미한다. (C) 열거 개별 애벌레에서 균질에 살고있는 박테리아의 여러 번 (LB)에 도금에 의해 측정 된 게시물 감염에 참고 만 유충 열거 분석에 포함 된 감염을 살아나. 도 표시 ± SEM (가로 막대)를 의미한다. (D) GFP- 시겔의 분포에 의해 결정여러 번 낮음, 중간, 높음 용량 접종 (꼬리 정맥 주사)를 이용하여 게시물 감염에서 형광 실체 현미경을 사용하여 라이브 영상. . 전송 이미지 (회색)와 GFP의 형광 (녹색) (B)의 오버레이 - (D)이 수치는 Mostowy 등 19에서 수정되었습니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> 그림 4 생체 내에서 이질 감염 세포 생물학. (A) Zebrafish의 유충은 24 시간, 고정, GFP SEPT7 (빨간색)과 항체로 표지 (녹색에 대한 GFP- 시겔 (저용량)와 꼬리 근육에 감염된 ) 및 공 초점 현미경에 의해 촬상. 스케일 바, 5 μm의. (B) GFP-LC3 제브라 피쉬의 유충 mCherry- 시겔 (중간 용량)에 대한 감염되었다4 시간 고정, mCherry (빨간색)와 GFP (녹색)에 항체로 표지하고, 공 초점 현미경으로 몇 군데. . 또는 P62 (오른쪽 이미지) morpholinos가 SEPT7에 대한 항체 (표지, 고정, 4 시간 동안 GFP- 시겔 라 (중간 용량)에 감염되었다, 스케일 바, 1.5 μm의 (C)는 Zebrafish의 유충은 어느 컨트롤 (왼쪽 이미지 CTRL)로 처리 빨간색)와 GFP (녹색), 그리고 공 초점 현미경으로 몇 군데. 화살표를 septin 케이지 (CTRL) 여부에 갇힌 시겔의 몇 가지 예를 강조 4 시간 게시물 감염 (P62은 고갈). 스케일 바, 5 μm의. 이 수치는 Mostowy 등 19에서 수정되었습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

병원균의 확산을 대응하기 위해 숙주 세포는 박테리아를 구획하고 자식 작용을 유도하는 자신의 세포 골격을 재구성. 조직 배양 세포, 호스트와이 프로세스를 기본 병원체 결정의 사용 이질균 감염 식별 특징으로한다. 시겔 감염 제브라 피쉬 모델을 사용하여, 분자 발견 및 메커니즘의 역할은 생체에 조사된다.

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

사용<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 모델 생물로 공부하기<em&gt; 레지오넬라 뉴모 필라</em&gt; 감염

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

상피 세포의 Shigella 감염 동안 캘리포니아2 + 응답 이미징

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...