Name: use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

Работа в лаборатории SM поддерживается Wellcome Trust Research Career Development Fellowship [WT097411MA].

<ol>
	<li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system.">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li><li>Phalipon, A., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella's+ways+of+manipulating+the+host+intestinal+innate+and+adaptive+immune+system:+a+tool+box+for+survival.">Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival.</a> Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).</li><li>Welch, M. D., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3-mediated+actin-based+motility:+A+tail+of+pathogen+abuse.">Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse.</a> Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).</li><li>Haglund, C. M., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogens+and+polymers:+microbe-host+interactions+illuminate+the+cytoskeleton.">Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins:+the+fourth+component+of+the+cytoskeleton.">Septins: the fourth component of the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).</li><li>Saarikangas, J., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+functions+of+septins+in+metazoans.">The emerging functions of septins in metazoans.</a> EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapment+of+intracytosolic+bacteria+by+septin+cage-like+structures.">Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures.</a> Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62+and+NDP52+proteins+target+intracytosolic+Shigella+and+Listeria+to+different+autophagy+pathways.">p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways.</a> J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells.">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria.">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li><li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans.">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection.">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469, 323-335 (2011).</li><li>Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-defense:+how+cell-autonomous+immunity+protects+against+pathogens.">Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens.</a> Science. 340, 701-706 (2013).</li><li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+bacterial+clearance:+a+not+so+clear+picture.">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autophagy:+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication.">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li><li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish.">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy.">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588 (2013).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+permeabilization+of+cells+and+tissues.">Fixation and permeabilization of cells and tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2008).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8, 445-544 (2012).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> The Zebrafish Book. , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).</li><li>He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+autophagic+activity+in+transgenic+GFP-Lc3+and+GFP-Gabarap+zebrafish+embryos.">Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos.</a> Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).</li><li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+renovation+of+cells+and+tissues.">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li><li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+levels+of+p62+control+cytoplasmic+inclusion+body+formation+in+autophagy-deficient+mice.">Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice.</a> Cell. 131, 1149-1163 (2007).</li><li>Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction.">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).</li><li>Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 2010-2010 (2011).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (9), (2009).</li><li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+autophagy+in+zebrafish.">Analyzing autophagy in zebrafish.</a> Autophagy. 6, 642-644 (2010).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).</li><li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity.">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).</li></ol>

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

При мониторинге аутофагию и цитоскелета в пробирке с помощью культуры тканей, протоколы, описанные в разделах 1 и 2 могут быть применены к широкому кругу видов ткани клеточной культуре. Кроме того, следить аутофагии (например, Atg8 / LC3 положительной аутофагосом) и цитоскелета (например., Актин хвосты, septin клетки) динамика в режиме реального времени во время Shigella инфекции с использованием живого изображения, культуры тканей клетки могут быть трансфицированы с помощью GFP-, RFP- или CFP-меченые конструкции, как описано выше 7,8. Чтобы увеличить процент клеток, инфицированных Shigella (т.е., как правило, желательно, чтобы в режиме реального времени анализа, учитывая, что Shigella могут вторгнуться 5-30% от HeLa клеток на 100:. 1 МВД), непосредственно добавить 400 мкл Shigella (OD 600 = 0,3 -0,6) к клеткам в 2 мл MEM (с недостатком сыворотки) и подождите не менее 1,5 часа после инфицирования в течение достаточного бактериальной вступления, вырваться из фагосом, репликации, AUtophagy признание и septin арретирования. Альтернативно, можно использовать напряжение Shigella M90T AfaI, выражающую адгезина AFAE и гораздо более высокие способности вторжения в эпителиальных клетках по сравнению с M90T штамма 28. Следует отметить, что штамм M90T AfaI еще не был протестирован на крысах с данио. Плиты Shigella колоний можно хранить при температуре 4 ° С в течение 2-3 дней и использовали в течение нескольких экспериментах. Тем не менее, с течением времени, колонии Shigella, потерявшие плазмиды вирулентности также может поглощать Конго красным и, кажется, сохранили свою плазмиды вирулентности. По этой причине мы рекомендуем использовать свежие бактериальные акции, когда это возможно. При контроле клеточной биологии инфекции в естественных условиях, протоколы описаны в разделах 3 и 4 использования дикого типа AB линии данио. Для мониторинга Шигеллы -leukocyte взаимодействия, трансгенные данио линии могут быть использованы, например, MPX: GFP или Lyz: DsRed чтобы визуальнаяИзе нейтрофилы 19,29,30 или MPEG1: mcherry визуализировать макрофаги 19,31. Для визуализации аутофагию в живом организме, GFP-LC3 данио трансгенной линии 19,24 могут быть использованы, как описано в разделе 3.8. Возмущать аутофагию в естественных условиях, эффективная доза морфолино олигонуклеотид должен быть оценена экспериментально на основе его эффективности ингибировать транскрипция сплайсинга или трансляции белка. Желательно, чтобы выполнить эксперимент титрования и подтвердить истощение помощью ОТ-ПЦР (для сращивания морфолино олигонуклеотида), или с помощью SDS-PAGE (для поступательного морфолино олигонуклеотида) 32. Выделение РНК из эмбрионов данио рерио или личинок может быть выполнена с использованием экстракции гуанидин тиоцианат-фенол-хлороформ. Для извлечения белка из данио личинок (от 8 до 15 личинок / трубки), механически гомогенизации с помощью пестика в 200 мкл буфера для лизиса (1 М Трис, 5 М NaCl, 0,5 М ЭДТА, 0,01% октилфенол окись этилена для конденсатае и ингибитор протеазы). Пробирки центрифужные на 19 000 мкг при 4 ° С в течение 15 мин и передать супернатант в новую пробирку. Добавить буфере Лэммли и нагрева образца при 95 ° С в течение 15 мин. Лизаты можно хранить при -80 ° С до тех пор, пока это необходимо, и может быть оценена с помощью Вестерн-блоттинга, как описано в разделе 2.3. Данио является прекрасной моделью для в естественных условиях применения препарата. Анализ с помощью морфолино олигонуклеотиды могут быть дополнены с установленными наркотиков манипулировать аутофагии (например, рапамицин и bafilomycin). Неинфицированные и / или инфицированных личинок можно лечить с помощью рапамицина (1,5 мкМ) или bafilomycin (80 нМ), разведенным в E2 и аутофагической поток может быть оценена с помощью Вестерн-блоттинга, как описано в 25,33. Следствием аутофагии манипуляции на исходе инфекции и выживания инфицированных личинок можно оценить, как описано в разделе 3.5. В дополнение к изучению клетки-хозяинадетерминанты, в пробирке и в естественных условиях протоколов могут быть применены для оценки бактериальной детерминанты, необходимые для распознавания аутофагии, с помощью бактериальных мутантные штаммы, которые по-разному распознаваемых аутофагии, например., Shigella ΔicsA (белок Shigella ICSA набирает N-оса и затем Arp2 / 3 для актина хвост и формирования septin клетки; в его отсутствие не может быть никаких актина хвосты, не septin клетках) и ShigellaΔicsB (Shigella избегает аутофагической ответ по бактериальной эффекторной белка ICSB, что предотвращает вербовку аутофагии техники в ICSA, в его отсутствие может быть больше septin клетки, более аутофагии) 7,8. Shigella не является естественным возбудитель данио и растет оптимально при 37 ° С. Тем не менее, исследования показали, что факторы вирулентности, необходимые для Shigella вторжения, вырваться из фагоцитарной вакуоли и репликации в сутосол может быть выражена и функциональны в данио личинки при 28 ° С 19. 28 ° С является наиболее часто используемым температура для выращивания и данио стандартной температуре, чтобы обеспечить развитие нормального данио 23. Поразительно, основные патогенные события, которые приводят к дизентерии у человека (т.е. макрофагов гибели клеток, инвазии и размножения в эпителиальных клетках, распространение от клетки к клетке, воспалительные разрушение эпителия хозяин) достоверно воспроизводит в данио модели Shigella инфекции 19. Аутофагии и цитоскелета гены экспрессируются повсеместно и имеют широкий спектр биологических функций. Исследования мыши показали, что нокаут важно аутофагии 26 или septin генов 5 эмбриональные смертельным, и вполне вероятно, что некоторые из этих генов также будет иметь важное значение для рыбок данио развития (хотя эта проблема может быть уменьшена на то, что данио имеют несколькопаралогичных гена 33). Если это так, есть несколько альтернатив, чтобы преодолеть эту проблему, в том числе (I) с использованием фармакологических реагентов для регулирования аутофагии и цитоскелета, (II) морфолины можно титрованным вниз, (III) нокаут генов может быть предназначен только для конкретной ячейки типы, и / или (IV) гены, вовлеченные в аутофагической признания, которые не являются необходимыми для развития животных (например,., p62) могут быть направлены. В то время как данио является идеальной моделью системы для расследования аутофагии и цитоскелета во Shigella инфекции, молекулярные инструменты в настоящее время нет. Поле должна разрабатывать новые инструменты и привод клеток конкретное выражение белков, представляющих интерес. Чтобы сбить экспрессию генов аутофагии / цитоскелета, новые последовательности морфолиновые требуются, и новые методы генной инженерии (например, Talen, CRISPR / Cas9) также может быть использован. В то же время, несколько инструментов, ранее Генерация человека или мыши исследованийможет одинаково работать для рыбок данио. Внутриклеточные бактерии S. flexneri стала исключительной модельного организма для решения ключевых вопросов в биологии, в том числе способности бактерий быть признанной иммунной системы 1,2. Клетка-хозяин использует septins ограничить подвижность S. flexneri и нацелить их на аутофагии, одним из важнейших компонентов клеток автономной иммунитета 7,8. Эти наблюдения позволяют предположить новую молекулярную структуру для изучения аутофагии и его способностью разрушать цитозольные бактерии. Одним из основных вопросов в настоящее время в полной мере расшифровать основные молекулярные и клеточные события, и для подтверждения этих событий, проанализированных в пробирке в течение бактериальной инфекции в естественных условиях, используя соответствующие модели животных. С этой целью, данио был создан в качестве ценного нового хозяина для анализа S. flexneri инфекция 19. Взаимодействия между бактериями и клетками-хозяевами могут быть отображены в высоком разрешении, имодель данио должна оказаться полезной для понимания клеточной биологии из Shigella инфекции в естественных условиях. Данио рерио Личинки могут быть использованы для изучения роли бактериальной аутофагии в защите хозяина, и исследования показали, что, что возмущение аутофагии может отрицательно повлиять на выживание хозяина в ответ на Shigella инфекции 19. Наблюдения, полученные от изучения Shigella, septin арретирования и аутофагии в пробирке с помощью культуры ткани клеток и в естественных условиях, используя данио личинки могут обеспечить фундаментальные достижения в понимании защиту хозяина. Они могли бы также предложить разработку новых стратегий, направленных на борьбу с инфекционными заболеваниями. Критический Целью данного отчета является разобраться в молекулярных и клеточных событий, проанализированных в пробирке (т.е., аутофагии, актин хвосты, septin арретирования) во время бактериальной инфекции в естественных условиях в контексте ЛОРГнев организм, используя данио личинки. Если не знакомы с данио биологии и обращения, можно сослаться на в протоколах глубины для правильного данио хозяйства 23 и в естественных условиях анализа данио инфекции 19,35.

Shigella flexneri, грамотрицательная инвазивной энтеропатогенные бактерия, может уйти от фагосом в цитозоле, и полимеризации актина цитоскелета хоста уклониться цитозольные иммунные реакции и способствовать внутрирегиональной и межклеточной движение 1,2. Несмотря на понимание актина основе подвижности в пробирке 3,4, механизмы, ограничивающие бактериальной распространение в естественных условиях не были полностью определены. Это очень важно для более полного понимания врожденного иммунитета и защиты организма. Septins, высококонсервативный семейство белков среди многоклеточных, являются гуанозинтрифосфат (GTP) -связывающий белки, которые собираются в гетеро-олигомерных комплексов и образуют неполярные нити, которые связывают с клеточных мембран и цитоскелета 5,6. Последние работы обнаружили, что инфицированные клетки-хозяева могут предотвратить моторику основе Shigella актина по compartmentalizing бактерий, направленных на autophAGY внутри &#39;septin клетки&#39;, раскрывающие первый клеточный механизм, что противодействует актина основе моторику 7,8. Широкий открытое поле исследования в настоящее время находится в &#39;septin биологии и инфекции &quot;. Septin монтаж, вызванной различными патогенами (например, Listeria моноцитогенес 7,9,10, Mycobacterium Marinum 7,8, Candida Albicans 11), могут появиться в качестве ключевого вопроса в защите хозяина 5,12. Аутофагия, высококонсервативный внутриклеточный процесс деградации, рассматривается как ключевой компонент клеточно-автономным иммунитета за его способности поставить цитозольные бактерии к лизосом 13,14. Тем не менее, роль бактериального аутофагии в естественных условиях, чтобы ограничить или продвижения бактериальной репликации остается плохо изученным 15,16. Данио (Danio rerio) возник как позвоночных модели для изучения инфекций, потому что это оптически доступнына личиночной стадии, когда врожденная иммунная система уже функциональная 17,18. Недавняя работа характеризуется восприимчивость данио личинки к S. flexneri, парадигма для бактериальной аутофагии 15, и использовал -zebrafish инфекции модель Shigella изучать манипуляции аутофагии для антибактериальной терапии в естественных условиях 19. Этот отчет содержит новые инструменты и анализы для изучения S. flexneri взаимодействия с аутофагии и цитоскелета. В качестве первого шага, протоколы для мониторинга аутофагии-цитоскелета взаимодействия описываются с помощью Shigella инфекции человеческого эпителиальной клеточной линии HeLa. Для оценки роли аутофагии-цитоскелета взаимодействий на инфекционного процесса Shigella в пробирке, методы манипулировать аутофагии и цитоскелета компонентов (используя миРНК или фармакологических реагентов) предоставляются. Новая работа показывает, что с помощью Shigella инфекции OF данио личинки, подобные анализы могут быть применены для изучения клеточной биологии инфекции в естественных условиях. Протоколы подготовить и заразить данио личинки подробно, а также для оценки ответа хоста к Shigella инфекции в естественных условиях, протоколы для определения выживаемости хозяин и бактериальная бремя зараженного личинками предоставляются. Методы Регулирование найма septin и аутофагии маркеров к Shigella (с использованием либо фиксированную или живой личинки данио) и методы, чтобы проверить роль этих процессов в естественных условиях [используя морфолино олигонуклеотидов (введенный 1-4 клеточной стадии эмбрионов) или фармакологических реагентов ( добавляют непосредственно в данио воде ванны)], также обсуждаются. Эта программа работы, как ожидается, обеспечить для понимания механизмов, необходимых для контроля заражения цитозольными ответов принимающих.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="771">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:240px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1793&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass microcapillars&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coarse manual manipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;">M-152</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6762</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Dumont #5 fine tweezers</td>
			<td style="width:240px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forchlorfeneuron&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">JetPEI transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">101-01N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L5288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">NB100-2220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V2111</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MatTek glass bottom dish</td>
			<td style="width:240px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM plus L-alanyl-L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">41090028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MEM non-essential amino acids solution</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller device&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co., Novato,</td>
			<td>P-87&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1404</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Phenol red solution</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693116001</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:412px;">p62/SQSTM1 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Cliniscience</td>
			<td style="width:119px;">PM045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8781</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11360039</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12252-011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield hard set mounting medium containing DAPI&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1500&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions

Shigella flexneri является внутриклеточным патогеном, который может убежать от фагосом достичь цитозоль, и полимеризуется хозяина цитоскелета для содействия ее подвижность и распространение. Новая работа показывает, что белки, участвующие в актина основе подвижности также связаны с аутофагии, внутриклеточного процесса деградации решающее значение для клеток автономной иммунитета. Поразительно, клетки-хозяева могут предотвратить актина основе моторику S. flexneri по compartmentalizing бактерий внутри &quot;septin клетки &#39;и ориентации их аутофагии. Эти наблюдения показывают, что более полное понимание septins, семейство нитевидных ГТФ-связывающих белков, обеспечит новый взгляд в процессе аутофагии. В этом докладе описывается протоколы для мониторинга аутофагии-цитоскелета взаимодействия, вызванные S. flexneri в пробирке с использованием тканевой культуры клеток и в естественных условиях с использованием данио личинки. Эти протоколы позволяют расследование внутриклеточных mechanisмс, которые контролируют бактериальную распространение на молекулярном, клеточном, и всей уровне организма.

После заражения культуры тканей в пробирке, S. flexneri может уйти от фагосомы и вторгнуться в цитозоль. В цитозоле клетки-хозяева могут предотвратить актина основе моторику Shigella по compartmentalizing бактерии внутри septin клетках (1А). Бактерии захваченные septin клетках также может быть помечены аутофагии маркеров p62 (Рисунок 1В) и LC3 (Рисунок 1C). Эти наблюдения выделить новый механизм иммунной защиты, который ограничивает распространение инвазивных патогенов, а также выявить новые связи между аутофагии и цитоскелета. Поразительно, истощение аутофагии маркеров значительно снижает septin арретирования бактерий (рисунок 2А), и работа также показала, что истощение septin арретирования значительно снижает вербовку аутофагии маркеров 8. Таким образом, по крайней мере, в случае Shigella, septin сепаратором и аутофагосом формирования кN можно рассматривать как взаимозависимых процессов. Другие сотовые требования к компартментализации Shigella по septin клетках включают полимеризацию актина и актомиозина деятельности (Рисунок 2B). Там нет естественного мышиная модель дизентерии, и исследование Shigella патогенеза, septin биологии и бактериальной аутофагии в естественных условиях могут воспользоваться новой модели животных инфекции, данио личинки 19. Можно заразить данио личинки путем введения бактерий в различных анатомических участках, таких как хвостовых внутривенных инъекций для экспериментов выживания, и хвостовой мышечных инъекций для микроскопии в естественных условиях (Рисунок 3А). В зависимости от дозы, S. flexneri вводят в данио личинки могут быть очищен в течение 48 ч после заражения, или может привести к прогрессивным и в конечном счете смертельной инфекции (Цифры 3B - 3D). Shigella вирулентность фаctors выражены при 28 ° С, оптимальная температура роста рыбок данио, и данио инфекция Shigella строго зависит от его типа III системы секреции (T3SS) 19, необходимо вирулентность определяющим в человеческой болезни. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что данио личинка представляет собой ценный нового хозяина для анализа в естественных условиях Shigella инфекции. Оптический доступность данио личинок позволяет визуализировать septin арретирования в естественных условиях (рисунок 4А), достижение, что никогда прежде не было осуществлено с использованием млекопитающих модели хостов. В дополнение доказательства того, что septin клетки завлечь бактерии, ориентированные на аутофагии в естественных условиях, можно заразить трансгенных данио личинки выражая GFP-LC3 и наблюдать вербовки аутофагии маркера для Shigella (Рисунок 4B). Для ultrastrucutral анализа Shigella аутофагосом в естественных условиях, элectron микроскопия может быть использована, чтобы четко показать цитозольную секвестр бактерий двойным мембранных вакуолей 19. Аутофагия рассматривается как ключевой компонент клеточно-автономным иммунитета и решающий механизм защиты против intracytosolic бактерий 14-16. Чтобы охарактеризовать функцию аутофагии в живом организме, P62 морфолино, обработанных данио личинки могут быть использованы. В отличие от основной аутофагии техники [например., В 36 аутофагии связанные белки (ATGs) 26], p62 не является необходимым для развития позвоночных 27 и, таким образом, данио личинок может нормально развиваться до заражения. Поразительно, p62 обедненного личинки заражают S. flexneri результат в значительно повышенной смертностью и повышением бактериальной нагрузки 19. В соответствии с работой в пробирке, показывающие, что septin сепаратором взаимосвязано с аутофагосом формирования 7,8, septin набор в Shigella заметно снижается в p62 обедненного личинок ( <strОнг&gt; Рисунок 4C). Эти данные показывают, что данио выживание зависит от p62-опосредованного аутофагии, чтобы управлять внутриклеточной бактериальной инфекции. <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> Рис.1 septin клетке в пробирке. (A) HeLa клетки были инфицированы S. flexneri в течение 4 часов 40 мин, фиксированная, помечены с антителами к SEPT9 и фаллоидином, и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии. Шкала бар, 1 мкм. (B) HeLa клетки были инфицированы S. flexneri в течение 4 часов 40 мин, фиксированная, помечены с антителами к p62 и SEPT2, и изображается флуоресцентного световой микроскопии. Шкала бар, 1 мкм. (С) HeLa клетки трансфицировали GFP-Atg8 / LC3, инфицированных S. flexneri в течение 4 часов 40 мин, фиксированная, помечены с антителами к SEPT2, и изображается люминесцентных мимикроскопия. Шкала бар, 1 мкм. Эти цифры были изменены с Mostowy соавт 7. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> Рисунок 2 Сотовые требования для формирования Shigella -septin клетки. (А) HeLa клетки были обработаны с контролем (CTRL), P62, ATG5, ATG6 или ATG7 миРНК. Всего-клеточные лизаты из миРНК-обработанных клеток были иммуноблоттингу для GAPDH, p62, ATG5, ATG6 или ATG7 показать эффективность миРНК истощения (вверху). миРНК обращению клетки были инфицированы S. flexneri в течение 4 часов 40 мин, фиксированная, и маркируется при количественной микроскопии. Графики (внизу) представляют собой средние значения ± SEM% от Shigella внутри SEPT2 клеток из н ≥3 экспериментов в лечении. (B), HeLa клетки были инфицированы S. еlexneri, обрабатывают ДМСО, цитохалазин D (CytD), latrunculin B (LATB), нокодазол (NOCO), или blebbistatin (Bleb) и после 4 часов 40 мин были зафиксированы и маркируется при количественной микроскопии. Графики представляют среднее% ± SEM из Shigella внутри SEPT2 клетках от двух независимых экспериментов в лечении. Эти цифры были изменены с Mostowy соавт 7. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> Рисунок 3 данио модель Shigella инфекции. (A) изображения для иллюстрации ориентацию данио личинки под стереомикроскопом. (Левая панель) Данио рерио Личинки 72 часов после оплодотворения были расположены горизонтально в инъекции пластины с их спинной стороной инъекционной иглой. (Средняя панель) инфекции кровотока проводили инъекциюкаждым из бактерии (красный раствор) в хвостовую вену, задняя на открытие мочеполовой. (Справа) Заражение в хвостовой мышцы проводили путем инъекции бактерий (красный раствор) в течение сомитов. (В) Выживание кривые 72 часов после оплодотворения личинок вводили различные дозы S. flexneri и инкубировали при 28 ° С в течение после инфицирования 48 час. Эффективная Инокулят классифицируется как низкий (&lt;10 3 КОЕ, белые кружки), средних (~ 4 х 10 3 КОЕ, открытые треугольники) или высокой (~ 10 4 КОЕ, светлые квадраты). Средний% ± SEM (турники) от п ≥3 экспериментов в классе посевной. (C) Перечень живых бактерий в гомогенатах индивидуального личинок в разное время после заражения, измеренное при посеве на LB. Обратите внимание, только личинки пережив инфекции включены в анализ перечисления. Среднее ± SEM (горизонтальные полосы) также показано. (D) Распределение GFP- Shigella определяетсяЖивая съемка с использованием флуоресцентного стереомикроскопа в разное время после заражения, используя низкий, средний или высокий дозы инокулята (хвостовые внутривенных инъекций). Наложение изображения передачи (серый) и GFP флуоресценции (зеленый) (B) -. (D) Эти цифры были изменены с Mostowy соавт 19. <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> Рисунок 4 клеточной биологии из Shigella инфекции в естественных условиях. () Данио рерио Личинки были инфицированы в хвостовой мышцы с GFP- Shigella (низкой дозы) в течение 24 часов, фиксированной, помечены с антителами против SEPT7 (красный) и GFP (зеленый ), и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии. Шкала бар, 5 мкм. (B) GFP-LC3 данио личинки были инфицированы mCherry- Shigella (средняя доза) для4 ч, фиксированной, помечены с антителами против mCherry (красный) и GFP (зеленый), и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии. . Шкала бар, 1,5 мкм (C) Данио рерио Личинки обрабатывали либо контроля (CTRL; левого изображения) или p62 (правое изображение) морфолины были инфицированы GFP- Shigella в течение 4 ч (средняя доза), фиксированной, помечены с антителами против SEPT7 ( красный) и GFP (зеленый), и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии. Стрелки выделить некоторые примеры Shigella захваченные в septin клетках (Ctrl) или нет (p62 истощены) почтовое инфекции с 4 часами. Шкала бар, 5 мкм. Эти цифры были изменены с Mostowy соавт 19.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Чтобы противодействовать распространению болезнетворных микроорганизмов, клетки-хозяева реорганизовать их цитоскелета по полочкам бактерии и вызывать аутофагии. Использование Shigella инфекция тканевых культур клеток, хозяина и возбудителем детерминант, лежащих в основе этого процесса были выявлены и охарактеризованы. Использование данио модели Shigella инфекции, роль обнаруженных молекул и механизмов исследуются в естественных условиях.

Использование<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Для изучения аутофагии-Цитоскелет взаимодействий

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Использование оптической ловушки для изучения хост-Возбудитель Взаимодействие для динамических изображений Живая сотовый

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Использование EpiAirway модель Характеризуя Долгосрочные хост-возбудителя Взаимодействия

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Использование<em&gt; Галерея MELLONELLA</em&gt; В качестве модельного организма по изучению<em&gt; Легионелл</em&gt; Инфекция

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Оценка эффективности и токсичности РНК Ориентация ВИЧ-1 Производство для использования в генной или терапии наркотиками

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Создание плотного Transposon вставки библиотеки с использованием бактериальной сопряжения в энтеробактерий штаммов таких как Кишечная палочка или шигеллам Флекснера

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

Imaging Ca2 + ответы во время инфекции Shigella эпителиальных клеток

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Дополнительное использование микроскопических методов и флуоресценции Чтение в изучении Cryptococcus-Amoeba Взаимодействия

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Высок объём шигеллезом-конкретные бактерицидной Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Человеческого Colonoid монослои для изучения взаимодействия между патогенов, Комменсалами и принимающих кишечного эпителия

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...