Name: use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

SM laboratuarda çalışma, Wellcome Trust Araştırma Kariyer Geliştirme Bursu [WT097411MA] tarafından desteklenmektedir.

<ol>
	<li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system.">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li><li>Phalipon, A., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella's+ways+of+manipulating+the+host+intestinal+innate+and+adaptive+immune+system:+a+tool+box+for+survival.">Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival.</a> Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).</li><li>Welch, M. D., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3-mediated+actin-based+motility:+A+tail+of+pathogen+abuse.">Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse.</a> Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).</li><li>Haglund, C. M., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogens+and+polymers:+microbe-host+interactions+illuminate+the+cytoskeleton.">Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins:+the+fourth+component+of+the+cytoskeleton.">Septins: the fourth component of the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).</li><li>Saarikangas, J., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+functions+of+septins+in+metazoans.">The emerging functions of septins in metazoans.</a> EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapment+of+intracytosolic+bacteria+by+septin+cage-like+structures.">Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures.</a> Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62+and+NDP52+proteins+target+intracytosolic+Shigella+and+Listeria+to+different+autophagy+pathways.">p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways.</a> J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells.">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria.">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li><li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans.">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection.">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469, 323-335 (2011).</li><li>Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-defense:+how+cell-autonomous+immunity+protects+against+pathogens.">Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens.</a> Science. 340, 701-706 (2013).</li><li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+bacterial+clearance:+a+not+so+clear+picture.">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li><li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autophagy:+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication.">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li><li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish.">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).</li><li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+450+million+years+in+the+making:+zebrafish+and+vertebrate+immunity.">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).</li><li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy.">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588 (2013).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+permeabilization+of+cells+and+tissues.">Fixation and permeabilization of cells and tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2008).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8, 445-544 (2012).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> The Zebrafish Book. , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).</li><li>He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+autophagic+activity+in+transgenic+GFP-Lc3+and+GFP-Gabarap+zebrafish+embryos.">Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos.</a> Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).</li><li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+renovation+of+cells+and+tissues.">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li><li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+levels+of+p62+control+cytoplasmic+inclusion+body+formation+in+autophagy-deficient+mice.">Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice.</a> Cell. 131, 1149-1163 (2007).</li><li>Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction.">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).</li><li>Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 2010-2010 (2011).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (9), (2009).</li><li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+autophagy+in+zebrafish.">Analyzing autophagy in zebrafish.</a> Autophagy. 6, 642-644 (2010).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).</li><li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity.">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Doku kültürü hücrelerinin kullanılarak in vitro ve hücre iskeleti Otofaji gözlendiği zaman, Bölüm 1 ve 2&#39;de tarif edilen protokoller doku kültür hücre tipleri çok çeşitli uygulanabilir. Ayrıca, Otofaji takip (örneğin, ATG8 / LC3 autophagosomes + ve) ve hücre iskeleti (örneğin,., Aktin kuyrukları, septin kafesler) canlı görüntüleme kullanılarak Shigella, enfeksiyon sırasında, gerçek zamanlı olarak dinamik, doku kültürü hücreleri geçici olarak GFP ile transfekte edilebilir, Önceden gibi RFP- veya CFP-etiketli yapıları 7,8 nitelendirdi. (. Yani, Shigella 100 de HeLa hücrelerinin% 5-30 istila edebilir düşünüyor gerçek zamanlı analiz için genellikle arzu: 1 İçişleri Bakanlığı) Shigella ile enfekte hücrelerin yüzdesini artırmak için (OD doğrudan Shigella 400 ul ekleyin, 600 = 0.3 -0.6) 2 ml hücreleri MEM (seruma acıktırıldı) ve yeterli bakteriyel girişi için en az 1.5 saatlik Enfeksiyon sonrası bekleyin fagosom, çoğaltma, Au kaçmaktophagy tanıma ve septin caging. Alternatif olarak, bir adezin AfaE ifade ve epitelyal hücrelerde çok daha yüksek istilası özellikler M90T suşu 28 karşılaştırdık Shigella M90T AfaI suşu kullanabilir. Notun, M90T AfaI türü henüz zebrafish kullanarak in vivo test edilmemiştir. Shigella koloniler plakalar 2-3 gün boyunca 4 ° C&#39;de tutuldu ve çeşitli deneyleri için de kullanılabilir. Ancak, zamanla, ayrıca Kongo Kırmızı emer ve görünebilir virülans plazmid kaybetmiş Shigella koloniler virülens plazmid muhafaza etmek. Bu nedenle biz mümkün olduğunda taze bakteri stoklarını kullanmanızı öneririz. In vivo enfeksiyon, hücre biyolojisi izlerken, protokoller bölüm 3 ve 4, yabani tip AB hattı zebrabalıkları tarif edilmiştir. Görsele DsRed GFP veya lyz: Shigella -leukocyte etkileşimlerin görüntülenmesi için, zebra balığı transgenik çizgiler, örneğin, MPX kullanılabilirnötrofiller 19,29,30 veya MPEG1 ize: mcherry makrofajlar 19,31 görselleştirmek için. Bölüm 3.8 &#39;de tarif edildiği gibi in vivo Otofaji görselleştirmek için, GFP-LC3 zebra balığı transgen doğru, 19,24 kullanılabilir. In vivo Otofaji bozmakta için, etkili bir doz, morfolino oligonükleotid transkript yapıştırma veya protein ötelenmesinin önlenmesi için verimine göre deneysel olarak değerlendirilmelidir. Bu titrasyon deneyi gerçekleştirmek için ve (uç uca ekleme morfolino oligonükleotid için) RT-PCR ile teyit tükenmesi ya da (morfolino oligonükleotid translasyon için) SDS-PAGE ile 32 tavsiye edilir. Zebra balığı embriyolarının ya da larva RNA izolasyonu guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Zebra balığı larvası (8-15 larva / tüp) proteininin, ayıklamak için, mekanik olarak,% 0.01 oktilfenol etilen oksit yoğunlaştırma 200 ul liziz tamponu (1 M Tris, 5 M NaCI, 0.5 M EDTA, bir havan tokmağı kullanılarak homojenizee ve proteaz inhibitörü). 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 19,000 x g&#39;de santrifüj tüpleri ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın. 15 dakika boyunca 95 ° C&#39;de numune Laemmli tamponu ilave edin ve ısıtın. Lizatlar, gerekli olana kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir ve Bölüm 2.3 &#39;de tarif edildiği gibi Western blot analizi ile değerlendirilebilir. Zebra balığı in vivo ilaç uygulaması için mükemmel bir model. Morfolino oligonükleotidler kullanılarak Analizi Otofaji (örneğin, rapamisini ve bafılomycin) işlemek için kurulan ilaçlar ile tamamlanabilir. Enfekte olmamış ve / veya enfekte olan larva rapamisin (1.5 uM) ya da bafilomycin (80 nM), E2 içinde seyreltilmiş ve 25,33 tarif edildiği gibi akış otofajik Western lekeleme yolu ile değerlendirilebilir ile muamele edilebilir. Bölüm 3.5 de tarif edildiği gibi enfekte larvaların enfeksiyon ve hayatta kalma sonucu üzerinde Otofaji manipülasyon sonucu değerlendirilebilir. Konakçı hücre incelenmesine ek olarakin vitro ve in vivo protokollerde belirleyicileri örn. Shigella ΔicsA (Shigella, protein, N-ICSA WASP toplayan ve ARP2 / 3, diferansiyel Otofaji tarafından kabul edilen bakteri mutant türünü kullanarak otofaji tanınması için gerekli bakteriyel belirleyicilerini değerlendirmek için uygulanabilir , yokluğunda, yokluğunda hiçbir aktin kuyrukları, herhangi bir septin kafes) ve ShigellaΔicsB (Shigella ICso için Otofaji makine işe engelleyen bakteriyel efektör protein IcsB aracılığıyla otofajik yanıtı önler olabilir, aktin ve kuyruk septin oluşumu için kafes daha septin kafesleri, daha otofaji) 7,8 olabilir. Shigella Zebrafish doğal bir patojen olmayan ve 37 ° C &#39;de en iyi şekilde büyür. Ancak, çalışma tta fagositik vakuol ve çoğaltma kaçmak, Shigella işgali için gerekli olduğunu virülans faktörleri göstermiştirtosol belirtilmiştir ve 28 ° C de 19 zebra balığı larvaları işlevsel olabilir. 28 ° C Normal zebra balığı gelişimini sağlamak için 23 zebra balığı ve sabit bir sıcaklıkta yetiştirilmesi için en yaygın olarak kullanılan sıcaklığıdır. Çarpıcı bir şekilde, insanlarda şigelloz yol önemli patojenik etkinlik (epitel hücreleri içinde, yani, makrofaj hücre ölümü, invazyon ve çarpma, hücreden hucreye yayılma konakçı epitel enflamatuar yok) sadık Shigella enfeksiyonun Zebrafish modelinde çoğaltılmaktadır 19. Otofaji ve iskeleti genler yayg ifade ve biyolojik işlevleri geniş bir yelpazede vardır. Fareler üzerinde yapılan çalışmalarda 5 embriyonik öldürücü olan temel Otofaji 26 ya da septin genlerin nakavt göstermiştir, ve bu sorun, zebra balığı birden fazla olması gerçeği ile daha da azalabilir, ancak, bu genlerin bir kısmı da (zebra balığı gelişimi için gerekli olması da muhtemeldirparalog genler 33). Eğer öyleyse, morpholinos aşağı titre edilebilir, (ii) ve Otofaji iskeletinin düzenlenmesi için (i) farmakolojik reaktifler kullanılması da dahil olmak üzere, bu sorunu aşmak için birçok seçenek vardır, genlerin (iii) reseptörü sadece belirli bir hücre için tasarlanabilir tipleri ve / veya (iv) hayvan gelişimi için esas teşkil etmeyen otofajik tanıma ile ilgili genler (örneğin,., P62) hedeflenebilir. Zebra balığı Otofaji ve Shigella enfeksiyonu sırasında iskeletinin araştırmak için ideal bir model sistem iken, moleküler araçlar şu anda eksiktir. Bu alan yeni araç ve söz konusu proteinlerin tahrik hücre özel ifade oluşturmak için gereklidir. Otofaji / iskeleti genlerin ifadesini yıkmak için, yeni morfolino dizileri gerekli değildir ve genom mühendisliği için yeni bir yöntem (örneğin, TALEN CRISPR / Cas9) de kullanılabilir. Bu arada, birçok araç önceki çalışmalar, insan ya da fare için oluşturulmuşeşit Zebra balığı için çalışabilir. Hücre içi bakteriler, S. flexneri bağışıklık sistemi 1,2 ile tanınan bakterilerin yeteneği dahil olmak üzere biyoloji kilit sorunları ele almak için olağanüstü bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Konakçı hücre S. motilitesini kısıtlamak için kullanır septins flexneri ve otofaji onları hedef hücre özerk dokunulmazlık 7,8 kritik bir bileşenidir. Bu gözlemler Otofaji ve sitozolik bakterileri indirgeme yeteneğini incelemek için yeni bir moleküler çerçeve önermek. Bir önemli konu tamamen altta yatan moleküler ve hücresel olayları deşifre etmek, ve ilgili hayvan modelleri kullanılarak in vivo bakteriyel enfeksiyon sırasında in vitro analiz bu olayları doğrulamak için şimdi. Bu amaçla, Zebra balığı S. analizi için değerli bir yeni bir ev sahibi olarak kurulmuştur flexneri enfeksiyonu 19. Bakteri ve konak hücreleri arasındaki etkileşim yüksek çözünürlükte görüntülü edilebilir veZebra balığı model, in vivo Shigella enfeksiyonu hücre biyolojisi anlamak için yararlı ispatlamak zorundadır. Zebra balığı larvalarının konak savunmasında bakteriyel otofaji rolünü araştırmak için kullanılabilir, ve iş otofaji pertürbasyon olumsuz Shigella enfeksiyonu 19 yanıt konak yaşamını etkileyebileceğini olduğunu göstermiştir. Gözlemler konak savunmasını anlamakta temel gelişmeler sağlayabilir Zebra balığı larvaları kullanılarak doku kültürü hücreleri ve in vivo kullanılarak in vitro caging ve Otofaji septin, Shigella çalışma üretti. Onlar da bulaşıcı hastalıklarla mücadele edilmesini amaçlayan yeni stratejilerin geliştirilmesini hatırlatıyoruz. Bu raporun kritik bir amacı in vitro analiz moleküler ve hücresel olayların mantıklı (yani, otofaji, aktin kuyrukları, caging septin) bir ent bağlamında in vivo bakteriyel enfeksiyon sırasındaZebra balığı larvaları kullanılarak ire organizma. Zebra balığı biyolojisi ve taşıma ile tanıdık, biri doğru Zebrafish hayvancılık 23 ve zebra balığı enfeksiyon 19,35 in vivo analizi derinlemesine protokoller başvurabilir.

Shigella flexneri, Gram-negatif invaziv enteropatojenik bakteri, sitoplazmada fagozomların kaçmak ve sitozolik immün yanıtları kaçmasına ve içi ve hücreler arası hareketi 1,2 teşvik etmek konak aktin iskeletinin polimerize olabilir. In vitro 3,4 aktin tabanlı motilite anlayışa rağmen, in vivo bakteri yayılmasını kısıtlayan mekanizmalar tam olarak tanımlanmamıştır. Bu doğuştan gelen bağışıklık ve konak savunma daha iyi anlaşılması için önemlidir. Septins, Metazoan&#39;da arasında proteinlerin yüksek oranda korunan bir aile hetero-oligomerik kompleksleri halinde birleşme ve hücresel membranlar ve hücre iskeleti ile ilişkilendirmek 5,6 polar olmayan filamentler oluşturmak proteinleri etmeye dayanır guanosin trifosfat (GTP) bulunmaktadır. Son çalışmalar, enfekte olmuş konakçı hücreler autoph hedeflenmiş bölümlere bakterilerin Shigella, aktin göre hareketlerini önleyebilir keşfetmiştiraktin esaslı hareketliliğini 7,8 dengeler ilk hücresel mekanizmayı ortaya agy içinde &#39;septin kafesleri&#39;,. Soruşturmanın geniş bir açık alanı artık &#39;septin biyoloji ve enfeksiyon&#39; yatıyor. Patojenlerin yol açtığı septin montaj, (örneğin, Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), konak savunma 5,12 önemli bir konu olarak ortaya çıkabilir. Otofaji, yüksek oranda korunmuş hücre içi bozulma süreci, çünkü lizozomdur 13,14 sitosolik bakteri teslim kabiliyetini hücre özerk bağışıklığın önemli bir bileşeni olarak görülüyor. Ancak, in vivo bakteriyel otofaji rolü kısıtlamak veya kötü 15,16 anlaşılamamış bakteri çoğaltma teşvik etmek. Bu optik olarak erişilebilir olduğu için zebra balığı (Br.rerio) enfeksiyonları çalışma için omurgalı bir model olarak ortaya çıkmıştırlarva aşamasında doğuştan gelen bağışıklık sistemi zaten 17,18 işlevsel olduğunda. Son çalışmalar S. Zebra balığı larvalarının duyarlılığını karakterize etti flexneri, bakteriyel otofaji 15 için bir paradigma, ve in vivo 19 antibakteriyel tedavi için otofaji manipülasyon çalışma Shigella -zebrafish enfeksiyon modeli kullandı. Bu rapor yeni araçlar ve S. incelemek için tahliller sağlar otofaji ve hücre iskeleti ile flexneri etkileşimleri. Bir birinci basamakta, protokoller, hücre iskeleti otofaji-etkileşimleri insan epitel hücre hattı HeLa, Shigella enfeksiyonu kullanılarak anlatılmıştır izlemek için. In vitro Shigella enfeksiyonları sürecine otofaji-iskeleti etkileşimlerin rolünü değerlendirmek için, yöntemler sunulmaktadır Otofaji ve (siRNA&#39;nın veya farmakolojik reaktifler kullanarak) iskeleti bileşenleri işlemek için. Yeni iş Shigella enfeksiyonu o kullanarak göstermiştirf zebra balığı larvası, benzer deneyler, in vivo enfeksiyon, hücre biyolojisi okumak için uygulanabilir. Protokoller hazırlamak ve Zebra balığı larvaları detaylı bulaştırmak ve in vivo Shigella enfeksiyonu için konak yanıtı değerlendirmek için, protokoller konak yaşam ve enfekte larva bakteriyel yükü sağlanır belirlemek için. (Yöntem (sabit veya canlı larva kullanılarak zebra balığı) Shigella için septin ve Otofaji belirteçlerinin işe izlemek ve yöntemleri [morfolino (1-4 hücre aşamasında embriyoların içine enjekte) oligonükleotidlerin ya da farmakolojik reaktifler kullanılarak, in vivo bu süreçlerin rolü test etmek için Zebra balığı banyo suyuna direkt ilave)] de tartışılmıştır. Bu iş programı sitozolik ana yanıtlarının enfeksiyonu kontrolü için gerekli mekanizmaların kavranmasını sağlaması bekleniyor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="771">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:240px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1793&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass microcapillars&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coarse manual manipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;">M-152</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C6762</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Dumont #5 fine tweezers</td>
			<td style="width:240px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forchlorfeneuron&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">JetPEI transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">101-01N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L5288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">NB100-2220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V2111</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MatTek glass bottom dish</td>
			<td style="width:240px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM plus L-alanyl-L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">41090028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">MEM non-essential amino acids solution</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller device&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co., Novato,</td>
			<td>P-87&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.0-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6793</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1404</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Molecular Probes</td>
			<td>A12379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Phenol red solution</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:240px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693116001</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:412px;">p62/SQSTM1 antibody</td>
			<td style="width:240px;">Cliniscience</td>
			<td style="width:119px;">PM045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:240px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R8781</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:240px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11360039</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:412px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:240px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12252-011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield hard set mounting medium containing DAPI&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1500&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of shigella flexneri to study autophagy-cytoskeleton interactions

Shigella flexneri sitoplazmada ulaşmak için fagozomların kaçmak ve onun hareketliliği ve yaygınlaştırılmasını teşvik etmek iskeletinin aktin ana polimerize edebilen hücre içi patojendir. Yeni iş aktin tabanlı motilite yer alan proteinler aynı zamanda Otofaji hücre otonom bağışıklık için önemli bir hücre-içi ayrıştırma işlemi ile bağlantılı olduğunu göstermiştir. Çarpıcı bir konakçı hücreler, S. aktin tabanlı motilite önleyebilir bakterilere içinde &#39;septin kafesleri&#39; compartmentalizing ve otofaji onları hedefleyerek flexneri. Bu gözlemler septins daha tam bir anlaşılması, lifli GTP bağlayıcı proteinler ailesidir, Otofaji sürecinde yeni görüşler işaret etmektedir. Bu rapor, S. neden Otofaji-iskeleti etkileşimlerin görüntülenmesi için protokollerini anlatır flexneri, in vitro doku kültürü hücreleri kullanılarak ve in vivo zebra balığı larva kullanılmıştır. Bu protokoller hücre içi mekaniği hakkında soruşturma etkinleştirmekmoleküler, hücresel, ve bütün organizma düzeyinde bakteri yayılmasını kontrol ms.

In vitro, S., doku kültürü hücrelerinin enfeksiyonu üzerine flexneri fagozomun kaçmak ve sitosola istila edebilir. Sitozol içinde, konakçı hücreler septin kafeslere (Şekil 1A) içine bakteri bölümlere göre Shigella aktin tabanlı motilite önleyebilir. Septin kafesler tarafından tutulan bakterileri de Otofaji belirteçleri P62 (Şekil 1B) ve LC3 (Şekil 1C) ile etiketlenebilir. Bu gözlemler invaziv patojenlerin yayılmasını kısıtlayan konak savunmasının yeni bir mekanizma vurgulamak ve otofaji ile hücre iskeleti arasında yeni bağlantılar ortaya. Çarpıcı otofaji belirteçlerin tükenmesi belirgin bakteri (Şekil 2A) septin kafes azaltır, ve aynı zamanda çalışma septin caging tükenmesi önemli Otofaji belirteçlerin 8 alımını engellediğini göstermiştir. Bu nedenle, en azından Shigella durumda, kafes aksamını ve autophagosome oluşumunu bir septin bölgesindekin birbirine süreçler olarak görülebilir. Septin kafeslerle Shigella kompartımanlara diğer hücresel şartlar aktin polimerizasyonunu ve aktomizin aktivitesi (Şekil 2B) içerir. Enfeksiyon, yeni bir hayvan modeli, Zebra balığı larvalarının 19 yararlanabilir hiçbir doğal fare şigelloz modeli, ve Shigella patogenezi, septin biyoloji ve in vivo bakteriyel otofaji soruşturma bulunmaktadır. Bu tür in vivo mikroskobu (Şekil 3A) kaudal intravenöz enjeksiyon deneyleri için hayatta kalma ve kuyruk kas enjeksiyonu gibi çeşitli anatomik bölgeler bakteri enjekte zebra balığı larvası enfekte mümkündür. Doz, S. bağlı olarak, flexneri ya 48 saat sonrası enfeksiyon içinde silinebilir Zebra balığı larvalarının enjekte ya da ilerici ve sonuçta ölümcül enfeksiyon (Şekil 3B - 3D) neden olabilir. Shigella virülans factors 28 ° C, zebra balığı optimum büyüme sıcaklığında ifade edilir ve Shigella ile zebra balığı enfeksiyonunda sahip tip III sekresyon sisteminde (T3SS) 19, insan hastalığında temel bir hastalık oluşturma mekanizmasını belirleyen sıkı sıkıya bağlıdır. Taken birlikte, bu gözlemler Zebrafish larva Shigella enfeksiyonu in vivo analizi için değerli bir yeni dizi temsil ettiğini göstermektedir. Zebra balığı larva optik erişilebilirlik in vivo (Şekil 4A) olarak septin caging önce, memeli konakçı modeller kullanılarak gerçekleştirilebilir hiçbir zaman bir başarı görselleştirme sağlar. Septin kafesleri in vivo otofaji hedefleyen bakteri tuzağa kanıtlar tamamlamak için, bir GFP-LC3 sentezleyen transgenik Zebra balığı larvaları enfekte ve Shigella (Şekil 4B) otofaji işaretleyici işe gözlemleyebilirsiniz. In vivo, el Shigella autophagosomes arasında ultrastrucutral analizi içinECTRON mikroskopi açık bir şekilde çift katlı bir zar 19 ile vaküol bakterilerin sitosolik sekestrasyonunu göstermek için kullanılabilir. Otofaji hücre özerk bağışıklığın önemli bir bileşeni ve intracytosolic bakterilere 14-16 karşı önemli bir savunma mekanizması olarak görülüyor. In vivo Otofaji işlevini karakterize etmek için, P62-morfolino muamele zebra balığı larvası kullanılabilir. Çekirdek Otofaji makineler aksine [örn., 36 otofaji ilgili proteinleri (ATG) 26], S62 olduğu enfeksiyona normal olarak önce gelişebilir, omurgalı gelişimi ve dolayısıyla 27 zebra balığı larvalar için gerekli değildir. Çarpıcı, P62-tükenmiş larvalar S. ile aşılanmış önemli ölçüde artmış mortalite ve artan bakteri yükünün 19 flexneri sonuç. Bu septin kafes aksamını gösteren in vitro çalışma ile anlaşma autophagosome oluşumu 7,8 ile birbirine bağlı olduğunu, Shigella için septin işe açıkça (P62-tükenmiş larva azalır <strong&gt; Şekil 4C). Bu veriler, zebra balığı sağkalım, hücre içi bakteri enfeksiyonu kontrol etmek için P62-aracılı Otofaji bağlı olduğunu göstermektedir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> In vitro septin kafesin Şekil 1. (A). HeLa hücreleri S. ile enfekte edilmiştir flexneri 4 saat 40 dakika boyunca, sabit ve SEPT9 falloidinle antikorları ile etiketlenmiş ve konfokal küçük kopya ile görüntülendi. Ölçek bar, 1 mikron. (B) HeLa hücreleri S. ile enfekte edildi flexneri 4 saat 40 dakika boyunca, sabit, P62 ve SEPT2 antikorları ile etiketlenmiş ve flüoresan mikroskobu ile görüntülendi. Ölçek çubuğu, 1 mikron. (C) HeLa hücrelerinde GFP-ATG8 / LC3 transfekte S. ile enfekte edilmiştir 4 saat 40 dakika boyunca flexneri, sabit floresan ışığı mi tarafından SEPT2 antikorlar ile etiketlenmiş ve görüntülücroscopy. Ölçek bar, 1 mikron. Bu rakamlar Mostowy et al 7&#39;den modifiye edilmiştir. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> Shigella -septin kafes oluşumu için Şekil 2. Hücresel gereksinimleri. (A) HeLa hücreleri kontrolü ile tedavi edildi (CTRL), P62, ATG5, ATG6 veya ATG7 siRNA. SiRNA ile muamele edilmiş hücrelerin tüm hücre lizatları siRNA azalması (en üst) etkinliğini göstermek için GAPDH, P62, ATG5, ATG6 veya ATG7 için bağışık edilmiştir. siRNA ile muamele görmüş hücreler ile enfekte edilmiştir S. sabit ve kantitatif mikroskopi için etiketlenmiş, 4 saat 40 dakika flexneri. Grafikler (alt) muamele başına n, ≥3 deneylerden SEPT2 kafesleri içinde Shigella ± SEM ortalama% temsil etmektedir. (B), HeLa hücreleri S. ile enfekte edilmiştir fD (CytD) sitokalasin, DMSO ile muamele edilmiş lexneri, latrunculin B (LatB), nokodazol (Noco) veya Blebbistatin (kabarcık) ve 4 saat sonra 40 dakika sabitlendi ve nicel mikroskopi için işaretlenebilir. Grafikler tedavisi için iki bağımsız deneyden SEPT2 kafesleri içinde Shigella ± SEM ortalama% temsil etmektedir. Mostowy Bu rakamlar, et al 7&#39;den modifiye edilmiştir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3. Shigella enfeksiyonu Zebrafish modeli. (A) Görüntüler stereomicroscope altında Zebrafish larva yönünü göstermek için. (Sol panel) Zebra balığı larvalarının 72 saat sonra döllenme onların dorsal yüzü enjeksiyon iğnesi bakacak enjeksiyon plakasına yanal konumlandırılmış. (Orta panel) Kan dolaşımı enfeksiyonu enjeksiyon sureti ile gerçekleştirilmiştirkaudal damarından bakterileri (kırmızı çözelti) ecting, ürojenital açıklığına arka. Kuyruk kasında (sağ panel), bir hücre gruplarının Enfeksiyon fazla bakteri (kırmızı çözelti) enjekte edilmesiyle gerçekleştirildi. (B), 72 saat sonra döllenme larvalarının hayatta kalma eğrisi S. çeşitli dozlarda enjekte flexneri ve 48 saat sonrası enfeksiyon için 28 ° C&#39;de inkübe edildi. Etkili inokulum düşük (&lt;10 3 CFU, açık daireler), orta (~ 4 x 10 3 CFU, açık üçgenler) veya yüksek (~ 10 4 CFU, açık kareler) olarak sınıflandırıldı. Inokulum sınıf başına n ≥3 deneylerden SEM ±% (yatay çubuklar) idi. (C) Numaralandırma bireysel larva homogenatlarda canlı bakteri çeşitli zamanlarda LB üzerine kaplama ile ölçülen enfeksiyon sonrası at Not, sadece larva numaralandırma analize dahil edilmiştir enfeksiyonu atlattı sahip. Da gösterilmiştir ± SEM (yatay çubuklar) idi. (D) GFP- Shigella Dağılımı göre belirlenirÇeşitli kez düşük, orta veya yüksek doz inokulum (kaudal damardan enjeksiyonlar) kullanılarak enfeksiyon sonrası bir floresan stereomikroskopta kullanarak canlı görüntüleme. . Iletim görüntüsü (gri) ve GFP floresan (yeşil) (B) Kaplama - (D) Bu rakamlar Mostowy ve diğ 19 dan modifiye edilmiştir. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. in vivo Shigella enfeksiyonu hücre biyolojisi. (A) Zebra balığı larvalarının 24 saat, sabit, GFP SEPT7 (kırmızı) karşı ve antikorlar ile etiketlenmiş (yeşil için GFP- Shigella (düşük doz) ile kuyruk kas enfekte edildi ) ve konfokal mikroskobu ile görüntülenmiş. Ölçek bar, 5 mikron. (B) GFP-LC3 Zebra balığı larvaları mCherry- Shigella (orta doz) için enfekte edildi4 saat, sabit, mCherry (kırmızı) karşı ve GFP (yeşil) karşı antikorlar ile etiketlenir, ve aynı odaklı mikroskopi ile görüntülenmiştir. . Veya P62 (sağ görüntü) morpholinos SEPT7 karşı antikorların (ile etiketlenmiş, sabit, 4 saat boyunca GFP- Shigella (orta doz) ile enfekte edilmiştir, Ölçek çubuğu, 1.5 um (C) Zebrafish larvaları ya da kontrol (sol görüntü CTRL) ile işlemden geçirildi kırmızı) ve GFP (yeşil) için ve aynı odaklı mikroskopi ile görüntülenmiştir. Oklar septin kafeslere (CTRL) veya entrapped Shigella bazı örnekler vurgulamak 4 saat sonrası enfeksiyon (P62 tükenmiş). Ölçek bar, 5 mikron. Bu rakamlar Mostowy ve diğ 19 dan modifiye edilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions at JoVE.com

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Patojen yayılmasını karşı koymak için, konakçı hücreler bakteriler ve bölümlere Otofaji uyarabilme iskeletinin yeniden. Doku kültürü hücreleri, ev sahibi ve bu işlem altında patojen belirleyicileri kullanılarak Shigella enfeksiyonu tespit ve karakterize edilir. Shigella enfeksiyonu Zebra balığı modellerini kullanarak, keşfedilen moleküllerin ve mekanizmaların rolü in vivo incelenmiştir.

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Kullanımı<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Bir Model Organizma olarak Eğitim için<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Enfeksiyon

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

Epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyon sırasında CA2 + yanıtları görüntüleme

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...